二硫化スズナノフレークベースの電気化学バイオセンサーによる唾液コルチゾールの迅速・高感度検出

概要

コルチゾールは下垂体-副腎皮質ホルモン（HPA）軸から分泌される典型的なストレスホルモンであり、心理的・生理的ストレスの重要なバイオマーカーです。コルチゾールの長期過剰発現はクッシング症候群やアジソン病などの深刻な疾患を引き起こすため、迅速なポイントオブケア（POC）検出が求められています。本研究では、ガラスカーボン電極（GCE）上に固定化した二硫化スズ（SnS₂）ナノフレーク多層膜、コルチゾール特異的抗体（C-M_ab）、ウシ血清アルブミン（BSA）を用いた非侵襲的電気化学アッセイを報告します。BSA/C-M_ab/SnS₂/GCEセンサーは電気化学インピーダンス分光法（EIS）とサイクリックボルタンメトリー（CV）で特性評価しました。差動パルスボルタンメトリー（DPV）により、100 pMから100 µMのコルチゾール濃度範囲で直線的応答を示し、検出限界（LOD）100 pM、感度0.0103 mA M⁻¹ cm⁻²（R²=0.9979）を達成しました。センサーで測定した唾液サンプルはELISA結果と5%以内の誤差で一致し、臨床的関連性と特異性を実証しました。本デバイスは、ストレス関連バイオマーカー監視のための従来免疫アッセイに代わる迅速・低コストな選択肢を提供します。

はじめに

コルチゾールはHPA軸から分泌されるステロイドホルモンで、心理的ストレス評価に最も広く用いられるバイオマーカーです。その概日リズムは早朝にピークを迎え夜間に低下し、調節異常はクッシング症候群からアジソン病まで多様な疾患を引き起こします。したがって、PTSD、うつ病、自閉スペクトラム障害などストレス関連障害の診断と管理には、正確なリアルタイムコルチゾール監視が不可欠です。

クロマトグラフィー、放射免疫測定、ELISA、SPR、QCMなどの従来実験室法は、実験室限定、時間がかかる、高コストという理由でPOC現場での使用が制限されています。特異的抗原-抗体反応を利用した電気化学免疫センサーは、簡易な装置、迅速な読み取り、低コスト、高感度という利点で有望な解決策です。唾液コルチゾール測定は非侵襲的でサンプル処理が最小限であるため特に魅力的です。

多数の金属硫化物ナノ材料がバイオセンシングに探索されてきましたが、二硫化スズ（SnS₂）がタンパク質固定化マトリックスとして用いられた例は稀です。SnS₂はバンドギャップ2.18-2.44 eVのn型半導体で、高いキャリア移動度と優れた化学的安定性を備え、電気化学変換の理想的なプラットフォームとなります。本研究では、2次元SnS₂ナノフレークを活用し、唾液コルチゾールの生理的濃度範囲で動作する高感度センサーを構築しました。

材料と方法

材料

ヒドロコルチゾン、抗ウサギコルチゾール抗体（C-M_ab）、ヘキサシアノ鉄酸カリウム（II/III）、β-エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチコステロン、ウシ血清アルブミン（BSA）はSigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から購入。四塩化スズ五水和物とチオアセトアミドは昭和（日本）とAlfa Aesar（英国）から供給。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）と微粒子アルミナ研磨剤はSigma-AldrichとBuehler（英国）から入手。すべての試薬は精製せずに使用。市販コルチゾールELISAキット（Cat# SA E-6000）はLDN（ドイツ）から購入。

二硫化スズの合成

SnCl₄·5H₂OとC₂H₅NSを70 mL脱イオン水に溶解しpH 7.4に調整。水熱オートクレーブに移し、1時間で200°Cまで昇温し、11時間維持。得られたSnS₂粉末を水とエタノールで6000 rpm、15分洗浄し、80°Cで空気乾燥し、均一なナノフレークを得ました。

材料キャラクタリゼーション

X線回折（XRD）で六方最密充填SnS₂相（JCPDS 89-2358）を確認。電界放出型走査型電子顕微鏡（FE-SEM）で側面寸法約300 nmのフレーク状形態を観察。透過型電子顕微鏡（TEM）と選択領域電子回折（SAED）で単結晶構造を確認し、格子間隔0.167 nmと0.316 nm、ナノフレーク厚さ10 nm未満を確認。

BSA/C-M_ab/SnS₂/GCEバイオセンサーの作製

ガラスカーボン電極（GCE）をアルミナスラリーで研磨し、5 M SnS₂分散液を滴下乾燥。その後、PBS中1 mg/mL C-M_ab溶液と1% BSA溶液で順次インキュベート。完成センサーは使用時まで4°Cで保存。検出コンセプトとセットアップを図1に示す。

検出システムの研究コンセプトとセットアップ

電気化学分析

センサーの電気化学的挙動評価にEISとCVを用いました。すべての測定で三電極系を使用：BSA/C-M_ab/SnS₂/GCEを作業電極、Pt線を対極、飽和カロメル電極を基準電極とし、5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻含有10 mM PBS（pH 7.4）中で実施。CVとDPV走査を-0.4 Vから1.0 V、走査速度10 mV/sで実施。

唾液サンプル採取と電気化学センシング

健常ボランティア2名から正午に2 mL唾液サンプルを採取。-20°Cで凍結保存後、解凍、遠心分離（3500 rpm、15分）、上清液を分析に使用。センサーによるコルチゾール測定値をELISAキット結果と比較。

干渉試験

潜在的干渉物質（β-エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチコステロン、各100 nM）をセンサーに10分間インキュベートし、CV応答を測定。コルチゾール検出への影響は5%未満でした。

ELISAによる唾液コルチゾール検出

ELISAはメーカーのプロトコルに従い実施。6濃度（0、0.1、0.4、1.7、7.0、30 ng/mL）のコルチゾールで標準曲線を作成。450 nmで吸光度を測定し、未知サンプルを定量。

結果と考察

SnS₂の材料分析

XRDパターン（図2a）は六方最密充填SnS₂相（JCPDS 89-2358）と一致。FE-SEM画像（図2b,c）は均一な300 nmフレーク状粒子を示す。TEM（図2d-f）で層間隔0.167 nmと0.316 nmの単結晶フレーク、総厚10 nm未満を確認。

a SnS₂のXRDパターン。SnS₂ナノフレークのFE-SEM画像（b ×250,000、c ×100,000）。d SnS₂ナノフレークのTEM画像。e 断面TEMと拡大図。f SAEDパターン。

電極の電気化学応答

GCEへのSnS₂添加で酸化電流が大幅に増加（図3a,b）。その後の抗体とBSA修飾により電荷移動抵抗が増加し、EISデータに反映（図3b）。BSA/C-M_ab/SnS₂/GCEの走査速度10-100 mV/sでのCVはピーク電流の直線的増加を示し（図3c,d）、表面制御可逆酸化還元プロセスを確認。

a GCE、SnS₂/GCE、C-M_ab/SnS₂/GCE、BSA/C-M_ab/SnS₂/GCEのCV。b 各電極のEIS。インセット：等価回路。c 酸化電流vs走査速度。d 電流vs走査速度の線形フィット。e BSA/C-M_ab/SnS₂/GCEのコルチゾール（100 pM-100 µM）に対するCV。f 検量線（対数コルチゾール）。g BSA/C-M_ab/SnS₂/GCEのコルチゾール（100 pM-100 µM）に対するDPV。h DPV検量線。

CVとDPVの両方で、コルチゾール濃度増加に伴いピーク電流が単調に減少しました。DPVでは直線的関係：y = -0.0103x + 0.0443（R²=0.9979）、LOD 100 pM、感度0.0103 mA M⁻¹ cm⁻²を得ました。センサーのダイナミックレンジ（100 pM-100 µM）は唾液コルチゾールの全生理濃度範囲をカバーします。

保存安定性試験

1日から1週間保存したセンサーでCVを実施、2条件（真空乾燥と4°C）で比較。4°C保存では7日後も酸化還元ピーク電流の91%を保持、真空乾燥では82%であり、低温での抗体活性安定性が優れています。

BSA/C-M_ab/SnS₂/GCEの酸化還元ピーク安定性：（a、b）真空、（c、d）4°C保存、7日間。

干渉試験

100 nMのβ-エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチコステロンでインキュベートしてもコルチゾール信号変化は5%未満（図5a）、高いアッセイ特異性を確認。

a β-エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチコステロン（100 nM）vs コルチゾール（10 nM）の干渉試験。b ELISAと電気化学センサーによる唾液コルチゾール比較。

ELISAと電気化学法による唾液コルチゾール検出

2名のボランティア唾液サンプルで、ELISAでは1.105×10⁻⁸ Mと3.998×10⁻⁹ M、電気化学センサーでは1.046×10⁻⁸ Mと3.911×10⁻⁹ Mのコルチゾール濃度を検出。わずか2-5%の差異で、センサーの精度を確認。

他研究との比較

表2、3（省略）で非金ベースコルチゾールセンサーと比較。本研究の利点：（1）材料コストが大幅に低い；（2）迅速で簡単な作製プロトコル；（3）既存デバイスと同等または優れたLOD。

結論

二硫化スズナノフレークベース電気化学バイオセンサーを開発し、唾液コルチゾールに対して100 pM LOD、100 pM-100 µM検出範囲を達成、ELISA精度と一致。構造類似ステロイドからの干渉5%未満、4°Cで7日後も90%以上の活性維持。低コスト、簡易組立、迅速読み取りにより、POCストレス監視の有力候補となります。

データと材料の入手可能性

本研究で生成・分析されたすべてのデータは本論文に含まれています。

略語

2D

二次元

BSA

ウシ血清アルブミン

C-M_ab

コルチゾール抗体

CV

サイクリックボルタンメトリー

DPV

差動パルスボルタンメトリー

EIS

電気化学インピーダンス分光法

ELISA

酵素免疫測定法

FEG-TEM

電界放出ガン透過型電子顕微鏡

FE-SEM

電界放出走査型電子顕微鏡

GCE

ガラスカーボン電極

HPA

下垂体-副腎皮質ホルモン軸

PBS

リン酸緩衝生理食塩水

POC

ポイントオブケア

PTSD

心的外傷後ストレス障害

SAED

選択領域電子回折

XRD

X線回折