Her2機能化金ナノシェル磁性ハイブリッドナノ粒子：乳がんのデュアルモーダルイメージングおよび光熱治療のための治療薬

要約

マルチモーダルイメージングと治療機能を統合するターゲットセラノスティックプラットフォームは、癌の早期発見と正確な治療のための有望な戦略として浮上しています。ここでは、デュアルモーダル超音波（US）用の抗ヒト表皮成長因子受容体2（Her2）抗体（Her2-GPH NPs）を運ぶターゲットゴールドナノシェルポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）磁気ハイブリッドナノ粒子を設計しました/磁気共鳴（MR）イメージングと乳がんの光熱療法。この薬剤は、パーフルオロオクチルブロミド（PFOB）と超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPIO）を同時充填したPLGAナノ粒子の周りに金ナノシェルをコーティングし、続いて抗Her2抗体と結合させることによって製造されました。細胞標的化研究は、Her2陽性ヒト乳がんSKBR3細胞への受容体を介した特異的結合を示し、その結合率はHer2陰性細胞よりも有意に高かった（ P <0.001）。インビトロでは、この薬剤は、造影剤増強米国イメージングおよび T の機能を備えていました。 ₂ 比較的高い緩和能（ r ）を備えた加重MRイメージング ₂ =441.47 mM ^-1 s ^-1 ）。さらに、薬剤のHer2機能化は、細胞特異的結合により、標的細胞のUS / MR分子イメージング効果を顕著に増強しました。生/死細胞アッセイおよび標的光熱細胞毒性実験により、Her2-GPH NPが、近赤外レーザー照射時にSKBR3細胞死を特異的に誘導する効果的な光吸収剤として機能することが確認されました。要約すると、Her2-GPH NPは、乳がんの早期の非侵襲的診断と補助療法を促進する大きな可能性を秘めた、新規の標的療法薬であることが実証されました。

はじめに

乳がんは、世界中の女性のがん関連死の主な原因です[1]。乳がんによる死亡を効果的に減らすための鍵は、早期かつ正確な診断です[2]。ここ数十年の進歩にもかかわらず、現在の診断および治療戦略には、乳がんの早期発見と正確な治療にまだ限界があります[3]。したがって、初期および無症状の段階で乳がんの創造的な新しい戦略を活用する必要があります。

1つのプラットフォーム内で診断と治療のアプローチを組み合わせたセラノスティクスは、個別化医療の進歩に重要な役割を果たすことが期待されています[4]。一般に、セラノスティック剤は、細胞レベルまたは分子レベルで乳がんを同時に監視および治療する可能性を考慮して、分子イメージングと治療機能を単一のナノ粒子に統合します[5]。臨床では、超音波（US）と磁気共鳴画像法（MRI）が、乳がんの診断と病期分類に一般的に使用される2つの方法です[6]。米国のイメージングは、高い安全性、リアルタイム測定、および容易な可用性の利点を示しており、造影超音波（CEUS）により、乳房病変の検出における感度と特異性が向上しています[7]。しかし、米国のイメージングのアプリケーションは、まだ比較的限られた空間的および解剖学的解像度に制限されています。 MRIは、比較的長いイメージング時間と限られた感度に悩まされながら、優れた空間分解能と軟組織コントラストを備えた画像を提供することができます[8、9]。したがって、米国とMRIの両方の機能を組み合わせて、乳がんに関するより補完的で相乗的かつ正確な情報を提供することは意味があります[10]。さらに、手術と補助化学療法は乳がんの主要な治療法ですが、重篤な合併症や多剤耐性の増加などの欠点もあります。近赤外（NIR）レーザーと光吸収体を利用した光熱療法（PTT）は、その最小の侵襲性と優れた制御性により、従来の治療法の効果的な代替手段として最近広く関心を集めています[11、12]。したがって、US / MRイメージングとPTTを1つのプラットフォームに組み合わせて、乳がんの誘導および監視された光熱アブレーションのデュアルモーダルイメージングを実現することは非常に価値があります。

最近、ナノ材料の調製は、癌治療薬の潜在的な用途において大きな進歩を遂げました。誰もが知っているように、その優れた生体適合性と生分解性により、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）ベースのナノ構造は、ドラッグデリバリーシステムや分子イメージングで使用するために広く研究されてきました[13、14]。液体パーフルオロカーボン（PFC）であるパーフルオロオクチルブロミド（PFOB）は、その高い酸素溶解性、疎水性、および疎油性のために、PLGAなどの高分子シェル内にカプセル化されて新しい超音波造影剤（UCA）を開発しました[15、16]。さらに、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPIO）は、その優れた生体適合性と優れたコントラスト増強により、生物の解剖学的情報を取得するためのMR分子プローブとして大きな注目を集めています[17、18、19]。

もう1つの有望なナノプラットフォームは金（Au）ナノ構造であり、優れた生体適合性と独自の光学的および電気的特性により、生物学および医学研究で広く使用されています[20]。球状の金ナノ材料の一種である金ナノシェルは、NIR領域で有意な表面プラズモン共鳴（SPR）吸収を示し、PTTで使用して、周囲の健康な細胞に影響を与えることなく癌細胞を選択的に殺すことができます[21]。また、AuナノシェルでコーティングされたPLGAマイクロカプセルを米国の分子イメージングに使用できることも報告されています[22]。多くの研究が、癌のセラノスティクスの「シェルコア構造」としてのAuナノシェルとポリマーの組み合わせに焦点を合わせてきました。 Ke etal。マルチモーダルイメージングおよびPTT用のAuナノシェルポリ（乳酸）マイクロカプセルに基づく一連のセラノスティック剤を開発しました[23、24]。 Lu etal。癌の蛍光イメージングおよび光熱化学療法のためにドキソルビシンをロードした高分子金ナノシェルを準備しました[25]。ただし、これらのNPが直面する一般的な問題は、表面に高親和性結合リガンドがないことです。これにより、診断および治療効果を最大化するために、特定の標的細胞を高い特異性で認識または結合できなくなります。さらに、私たちの知る限りでは、乳がんのデュアルモーダル共同診断とPTTのためのターゲットAuナノシェルPLGAハイブリッドナノプラットフォームを調査することに専念した研究はほとんどありません。

これまでに乳がんについて検討されてきた分子標的の中で、細胞膜表面結合受容体チロシンキナーゼであるヒト上皮成長因子受容体2（Her2）は、乳がんの位置と同定のための重要なバイオマーカーとして最も一般的に使用されています[26、27 ]。これは、腫瘍の攻撃性、高い再発率、および予後不良に関連するヒト原発性乳がんの約25〜30％で過剰発現しています[28、29]。したがって、Her2を標的とした治療薬の製造は、乳がんの早期発見と治療を改善する上で繁栄している分野です。

私たちの研究では、基本的な考え方は、乳がんの早期診断と正確な治療に専念する、デュアルモーダルUS / MRイメージングとPTTを統合するHer2機能化金ナノシェル磁気ハイブリッドNP（Her2-GPH NP）を開発することです。この薬剤は、PFOBとSPIOをPLGA NPにカプセル化し、表面に金のナノシェルをコーティングし、抗Her2抗体と結合させることで構築されました（図1）。 Her2陽性乳がんSKBR3細胞における薬剤の十分な蓄積は、抗体を介した標的特異性と薬剤のナノスケールサイズによって達成できると予想されます。本研究はまた、invitroでUS / MR造影剤増強イメージングを提供するためのデュアルモーダル分子プローブとしての薬剤の使用の実現可能性、およびNIR吸収Auによって誘発される乳癌細胞の標的PTT効果を検証するために設計されましたナノシェル。

材料と方法

資料

ポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA、カルボン酸末端、ラクチド：グリコリド50：50、Mw 24,000〜38,000）、ポリアリルアミン塩酸塩（PAH、Mw 17,500）、およびテトラクロロ金酸（III）酸三水和物（HAuCl ₄ ・3H ₂ O）Sigma-Aldrich Trading Co.、Ltd。（上海、中国）から入手しました。平均直径10nmのオレイン酸でコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子（OA-SPIO）は、Shanghai So-Fe Biomedicine Co.、Ltd。（Shanghai、China）から購入しました。パーフルオロオクチルブロミド（PFOB）、ポリビニルアルコール（PVA、87〜89％モル加水分解、低分子量）、1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）、および N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）は、Aladdin Chemistry Co.、Ltd。（Shanghai、China）から入手しました。カルボン酸末端ポリ（エチレングリコール）（SH-PEG-COOH、Mw 2000）およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識抗Her2抗体は、Xi'an Ruixi Biological Technology Co.、Ltd。（Xi'an、China）から入手しました。）およびAbcam（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）、それぞれ。使用した他のすべての試薬は分析グレードのものでした。

PFOB / SPIOs @ PLGANPの準備

PFOB / SPIOs @ PLGA NPは、適応した油/水エマルジョン溶媒蒸発法を使用して製造されました[24、30]。簡単に説明すると、ヘキサン中のオレイン酸でコーティングされたSPIO（0.5 mL、20 mg / mL）を、PLGA（100 mg）とPFOB（60μL）を溶解する塩化メチレン（3.6 mL）に添加しました。得られた有機相を予冷したPVA水溶液（20 mL、2％、 w ）に滴下した。 / v ）。続いて、システムは、80％の出力振幅設定の下で氷水浴中でプローブ超音波処理を使用して2分間乳化されました。その後、エマルジョンを室温で5時間撹拌し、遠心分離（16,000 rpm、5分、15°C、Avanti J-25、Beckman Coulter）し、脱イオン（DI）水で2回洗浄して、PFOB / SPIOs @を得ました。 PLGANP。

PFOB / SPIOs @ PLGA @ AuNPの準備

最初に、以前に報告されたように、平均直径5nmのクエン酸塩で安定化された金NPを調製しました[21]。一方、PFOB / SPIOs @ PLGA NPs懸濁液（1 mL）をPAH溶液（0.5 mol / LNaCl水溶液中1.0mg / mL）で30分間混合した後、遠心分離（15,000 rpm、10分、15°C）しました。）そしてDI水で2回洗浄します。次に、混合物をクエン酸塩で安定化した金NP懸濁液（100 ml）に加え、30分間撹拌しました。遠心分離/洗浄ステップを繰り返した後、得られたAuNPでコーティングされたPFOB / SPIOs @ PLGANPをHAuCl ₄に再分散させました。溶液（2 mL、1％ w / v ）磁気攪拌下。次に、新たに調製した塩酸ヒドロキシルアミン溶液（NH ₂ HAuCl ₄を還元するために、OH・HCl、0.3 mL、0.5 mol / L）を添加しました。 PFOB / SPIOs @ PLGANPの表面にAuナノシェルを形成します。

Her2-GPHNPの調製

調製したPFOB / SPIOs @ PLGA @ Au NPs水溶液（1 mL、1 mg / mL）をSH-PEG-COOH（5 mg）と混合し、室温で12時間撹拌しました。遠心分離（16,000rpm、20分、15°C）および2回の洗浄後、沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させました。次に、EDC（10 mg）とNHS（10 mg）を導入し、室温で2時間撹拌して、ペグ化NPのカルボン酸基を活性化し、遠心分離/洗浄を繰り返して活性化NP（GPH NP）を得ました。ステップ。その後、FITC標識（10μL、0.38 mg / mL）を含む抗Her2抗体を、活性化されたNP分散液に添加し、等温シェーカーで90分間インキュベートしました。最後に、遠心分離/洗浄ステップによって遊離抗体を除去し、Her2機能化PFOB / SPIOs @ PLGA @ Au NP（Her2-GPH NP）を取得しました。

特性

Her2-GPH NPの表面構造と形態は、電界放出型走査電子顕微鏡（FE-SEM、日立S-4800、東京、日本）によって特徴づけられました。高分解能透過型電子顕微鏡（TEM、JEM-2100、JEOL、東京、日本）を使用して、カーボンコーティングされたCuグリッドにサンプルを浸して内部構造を確認しました。サンプルの対応するエネルギー分散型X線分光法（EDS）（金スパッタリングプロセスなし）をTEMに接続して、得られたNPの元素組成を分析しました。 Her2-GPH NPの流体力学的サイズとゼータ電位は、動的レーザー散乱（DLS）装置（Zetasizer Nano ZS3690; Malvern Instruments、Malvern、UK）を使用して測定しました。異なる調製段階での薬剤のＵＶ－可視吸収スペクトルは、ＵＶ－可視分光光度計（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＤＵ７３０、米国）を用いて得られた。 Her2-GPH NPのAuおよびFe元素の量は、誘導結合プラズマ原子発光分析（ICP-AES、Vistampxicp Varian、米国）によって評価されました。

光熱性能の測定

Her2-GPH NPの光熱性能は、NIRレーザー照射下での温度上昇を監視することで評価されました。さまざまな濃度のHer2-GPHNP水溶液（50、100、150、200μg / mL）に808 nmレーザー（1 W / cm ² ）を照射しました。）石英キュベット（総量1 mL）で10分間、溶液の温度をFLIRA300サーマルカメラで10秒ごとに測定しました。薬剤の光熱安定性を評価するために、照射プロセスの前後に材料の吸収スペクトルを取得しました。比較のために、DI水を同じ条件下で照射しました。

細胞培養

Her2を過剰発現するヒト乳癌SKBR3細胞株（SKBR3細胞）およびHer2を低発現するヒト乳癌MDA-MB-231細胞株（MDA-MB-231細胞）は、Institute of Biochemistry and Cell Biology（Shanghai、China）から入手しました。それらは、20％ウシ胎児血清（FBS）と1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco Life Technologies、米国ニューヨーク州グランドアイランド）で培養されました。すべての細胞は37°Cおよび5％CO ₂の環境で増殖しました。

インビトロ細胞毒性アッセイ

Her2-GPH NPのインビトロ細胞毒性は、SKBR3およびMDA-MB-231細胞での細胞計数キット-8アッセイ（CCK-8、Dojindo Molecular Technologies Inc.、日本）によって評価されました。 2種類の細胞をそれぞれ96ウェルプレートに1×10 ⁴ の密度で播種しました。ウェルごとに24時間インキュベートします。培地を除去した後、細胞をさまざまな濃度（0、10、20、50、100、200μg / mL）のHer2-GPH NPで処理し、さらに12時間または24時間インキュベートしました。次に、CCK-8溶液（100μLDMEM中の10μLCCK-8）を添加し、さらに2時間インキュベートしました。最後に、各ウェルの光学密度（OD）を、マイクロプレートリーダー（Thermo Scientific Multiskan MK3）を使用して450nmの波長で測定しました。

インビトロ受容体特異的ターゲティング研究

共焦点レーザー走査顕微鏡

SKBR3およびMDA-MB-231細胞をガラス底細胞培養皿（Φ）にプレーティングしました。 =20 mm）密度2×10 ⁴ 細胞/ウェルを24時間処理した後、非標的グループ、標的グループ、標的阻害グループを含む3つのグループにそれぞれ分けました。非標的群としての2種類の細胞を100μLのGPHNPで処理し、標的群の細胞を100μLのHer2-GPHNPで処理しました。標的阻害群では、細胞を遊離の抗Her2抗体（20μL）と30分間インキュベートした後、Her2-GPHNPで処理しました。それぞれ30分間のインキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで15分間固定しました。次に、細胞を核染色剤（DAPI; Beyotime Biotechnology Co.、Ltd.、Shanghai、China）で10分間染色し、PBSで再度洗浄しました。最後に、レーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）（Leica TCS SP5 II、Leica Microsystems Ltd.、マンハイム、ドイツ）を使用して細胞を観察しました。

フローサイトメトリー

SKBR3およびMDA-MB-231細胞は、上記のように培養および処理され、グループ化はLSCMアッセイと一致していました。すべての細胞をトリプシンで消化し、2×10 ⁵ の密度でフローサイトメトリー（FCM）の前にPBSに再懸濁しました。チューブあたりの細胞。細胞の蛍光強度は、フローサイトメーター（FC500MCL、ベックマンコールター、フラートン、カリフォルニア州）によって決定された。 SKBR3およびMDA-MB-231セルは、ゲートを設定するためのブランクコントロールとして使用されました。次に、FL1の電圧と蛍光の補正を調整して、細胞の自発蛍光が10 ¹ 以内になるようにしました。蛍光ヒストグラムの。細胞をNPとインキュベートした後、ブランクグループからの蛍光強度の偏差は、細胞へのNPの結合率を反映していました。すべての実験は3回行った。

In Vitro US Imaging and Quantitative Analysis

In VitroSolution超音波イメージング

Her2-GPHNPのinvitro溶液超音波イメージングは、Mylab Twice Ultrasound Systemユニット（Esaote SpA、ジェノバ、イタリア）を使用して実施しました。 Her2-GPH NPを脱気したDI水にさまざまな濃度（0.1、0.5、1、1.5、2 mg / mL）で分散させ、エッペンドルフチューブ（2 mL）に注入した後、チューブを超純水タンクに浸しました。超音波検査は、LA522トランスデューサーを使用して、2次元（2D）グレースケールモードと造影剤増強モードの両方で、機械的指標（MI）=0.01、周波数範囲が3–9MHzで実行されました。画像はチューブの縦断面から取得され、QontraXt V3.06ソフトウェアを使用して時間強度曲線（TIC）の定量分析のために記録されました。

米国の乳がん細胞のターゲットイメージング

SKBR3細胞とMDA-MB-231細胞を6ウェルプレートで2×10 ⁶ の密度で培養しました。 / well for 24 h、そしてそれらはコントロールグループ、非ターゲットグループ、ターゲットグループを含む3つのグループに分けられました。非標的群と標的群の細胞は、それぞれGPH NP（100μg/ mL）とHer2-GPH NP（100μg/ mL）で30分間処理されました。続いて、細胞をPBSで洗浄し、消化し、PBS（0.5 mL）を含む試験管に再分散させました。アガロースゲル（1％）は20mLガラス皿で調製しました。細胞表面に対するNPの標的超音波イメージング効果をシミュレートするために、6つのグループの試験管の細胞懸濁液を1 mLシリンジで別々に抽出し、寒天ゲルにゆっくりと注入しました。イメージングは、SL3116トランスデューサーをグレースケールモードで使用して実行されました（ゲイン=70％;中心周波数=22 MHz; MI =0.06）。スキャン後、超音波画像の各グループの関心領域（ROI）が描画されました。各ROIのグレースケール値は、画像分析ソフトウェア（DigSubAna;上海交通大学、上海、中国）を使用して定量的に分析され、Her2-GPHNPの対象となる超音波画像効果を評価しました。

インビトロMRイメージングおよび定量分析

T ₂ Her2-GPHNPの測定とMRイメージング

Her2-GPH NPのMRイメージングと弛緩性測定は、0.5 Tシステム（Shanghai Niumag Corporation配給NM120-アナリスト）を使用して実行されました。 Her2-GPH NPは、さまざまなFe濃度（0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mM）、および T でDI水に懸濁されました。 ₂ サンプルの重み付けされたMR画像は、スピンエコーシーケンスを使用して取得されました（TR =2000 ms; TE =100ms;スライス厚=3 mm; FOV =3×3cm）。横緩和時間（ T ₂ ）NPs水溶液の水プロトンの）も測定され、横緩和度（ r ₂ ）は、1 / T のカーブフィッティングによって決定されました。 ₂ （s ^-1 ）対Feの濃度（mM）。

乳がん細胞のターゲットMRイメージング

SKBR3およびMDA-MB-231細胞のグループ化と処理は、米国のターゲットイメージングアッセイと一致していました。非標的GPHNP（100μg/ mL）または標的Her2-GPH NP（100μg/ mL）と30分間インキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、消化し、キサンタンガム（1 mg / mL）に分散させました。。すべてのサンプルは、上記と同じパラメータでスピンエコーシーケンスを使用してスキャンされました。各画像のROIは、画像Jソフトウェアを使用した信号強度の定量分析のために定義されました。

インビトロでのターゲットPTT評価

Her2-GPH NPの標的PTT効果を視覚化するために、SKBR3細胞をガラス底細胞培養皿（Φ）にプレーティングしました。 =20 mm）密度1×10 ⁵ 細胞/ウェルを24時間培養し、レーザー照射ありまたはなしのDMEM対照群、レーザー照射ありまたはなしの標的物質グループ、レーザー照射ありの非標的物質を含む5つのグループにそれぞれ分けました。標的群はHer2-GPHNP（100μg/ mL）を含むDMEM分散液で30分間処理し、非標的群は同じ条件でGPH NP（100μg/ mL）で処理しました。レーザー照射群の細胞にNIRレーザー（808 nm、1 W / cm ² ）を照射しました。）10分間、さらに37℃で2時間インキュベートします。次に、生/死細胞アッセイキット（Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド）を使用して細胞生存率を評価しました。最後に、染色された細胞の画像がLSCMで取得されました。光熱細胞毒性を定量化するために、SKBR3細胞（1×10 ⁴ ウェルあたり）を96ウェルプレートにプレーティングし、24時間インキュベートしました。グループ分けは上記と一致しており、細胞生存率はCCK-8アッセイによってテストされました。異なる濃度およびレーザー照射下でのHer2-GPHNPの光熱細胞毒性をさらに定量的に評価すること。細胞を、さまざまな濃度（0、50、100、150、200μg / mL）のHer2-GPHNPを含むDMEM分散液とともにインキュベートしました。 PBS（10 mM、pH 7.0）で洗浄した後、細胞にNIRレーザー（808 nm、1 W / cm ² ）を照射しました。）10分間、さらに2時間インキュベートします。次に、細胞生存率もCCK-8アッセイによって決定されました。結果は、平均±標準偏差（ n ）として表示されます。 =4）。

乳房腫瘍組織におけるHer2の不均一な発現をシミュレートするために、SKBR3細胞とMDA-MB-231細胞を異なる比率（0：100％、25：75％、50：50％、75：25％、100）で共培養しました。：0％）。すべての細胞をHer2-GPHNP（200μg/ mL）で30分間処理し、NIRレーザー（808 nm、1 W / cm ² ）を照射しました。）10分間。さらに2時間インキュベートした後、細胞生存率をCCK-8アッセイで分析しました。結果は、平均±標準偏差（ n ）として表示されます。 =4）。

統計分析

定量的データは、平均±標準偏差（平均±SD）として表されました。複数のグループ間の統計的差異は分散分析（ANOVA）によって決定され、2つの独立したサンプルからのデータがStudentの t を使用して比較されました。テスト。 P <0.05は統計的に有意な差と見なされました。統計分析は、SPSS v17.0（IBM、米国ニューヨーク州アーモンク）を使用して実行されました。

結果と考察

特性

PFOB / SPIOs @ PLGA NPは、油/水エマルジョン溶媒蒸発プロセスを介して製造されました。 SEM画像（図2a）は、PFOB / SPIOs @ PLGANPが均一な球状の形態と滑らかな表面を持っていることを明らかにしました。 TEM（図2b）に示されているように、PFOB / SPIOs @ PLGA NPのコアとシェルの間に電子密度の明らかな違いがあり、NP内にPFOBがカプセル化されていることを示唆しています。さらに、高倍率の挿入画像に示されているように、SPIOの存在は、PFOB / SPIOs @ PLGANPのシェルおよび液体PFOBコア領域に深い灰色のスポットとして示されました。 PFOB / SPIOs @ PLGA NPの平均直径は約248.3nmで、多分散度指数は0.037であり、DLS測定によるとゼータ電位は約-14.7mVでした。したがって、PFOB / SPIOs @ PLGA NPは、正に帯電したPAHを容易に吸収して、平均サイズが5〜7 nmの負に帯電したAuナノ粒子を付着させ、PFOBの表面の周りに金ナノシェルの成長を核形成するためのシードとして使用されました。シード手順による/ SPIOs @ PLGANP。

Her2-GPH NPは、SH-PEG-COOHを介して抗Her2抗体をPFOB / SPIOs @ PLGA @ AuNPにリンクすることによって調製されました。このプロセスでは、古典的なカルボジイミド技術を使用して、PEG化PFOB / SPIOs @ PLGA @ Au NPのカルボン酸基を活性化し、アミノ基の抗体への共有結合を促進しました[31]。 SEMおよびTEM画像（図2c、d）に示されているように、Her2-GPH NPは、表面が粗い明確な球状の形態を維持し、直径数十ナノメートルの高密度のAuNPが表面にはっきりと見られました。金ナノシェルの製造が成功したことを示すNP。 Her2-GPH NPのEDS元素マッピング（図2e）と元素分析結果（図3a）は、大量のAu元素と、Fe、F、Br元素の存在を明確に示しており、SPIOとPFOBのカプセル化が成功したことを示しています。そしてAuナノシェルの形成。さらに、Her2-GPH NPのAuおよびFe元素の含有量は、ICP-AESによってそれぞれ67.71±7.34％wt。％および2.13±0.52％wt。％と評価されました。

さらに、さまざまな準備段階でのHer2-GPH NPのUV-Vis吸収スペクトルも調べました（図3b）。 PFOB / SPIOs @ PLGA NPは、400〜800 nmの範囲で明らかな吸収ピークを示さなかったのに対し、AuNPは約520nmでプラズマ共鳴ピークを示しました。 PFOB / SPIOs @ PLGA @ AuNPとHer2-GPHNPはどちらも、シードプロセスによってクラスター化するのに十分な大きさに成長した付着したAuシードのために、600〜900 nm（NIR領域）の範囲の連続した広いピークを示しました。 NIR領域の広い吸収スペクトルにより、Her2-GPHNPがNIR光熱治療の光吸収体として機能することが保証されました。さらに、PFOB / SPIOs @ PLGA NPと比較して、Her2-GPH NPのサイズ分布は282.3nm増加し、多分散度指数は0.18でした（図3c）。また、ゼータ電位は− 31.3 mVであり（図3d）、安定性が良好であることを示しています。

光熱性能の測定

Her2-GPH NPs溶液の光熱変換効果は、NIRレーザー（808 nm、1 W / cm ² ）の照射下で評価されました。）、温度変化は10秒ごとにIR熱画像カメラで監視されました。 10分間のレーザー照射後、さまざまな濃度のHer2-GPH NP溶液の熱画像の色が変化し、Her2-GPH NPの濃度が高くなるにつれて温度が上昇したことを示しています（図4a）。光熱温度測定は、画像データと一致していました。 NP溶液の温度は、曝露時間と濃度の増加とともに上昇することが観察できました（図4b）。詳細には、Her2-GPH NPs溶液の温度上昇は0.2mg / mLの濃度で18.5°Cでしたが、DI水の上昇はわずか1.2°Cでした。以前の研究[32]によれば、癌細胞を殺すために、温度を温熱療法の温度範囲（40–47°C）に上げる必要がありました。しかし、in vitroでの熱損失のため、約10°Cの温度上昇は細胞死を誘発するのに十分ではありません[33]。 Her2-GPH NPは、比較的低濃度で温度を約18°C上昇させる可能性があるため、温熱療法によって癌細胞を殺す可能性があります。さらに、Her2-GPH NPの光熱安定性を検証するために、サンプルのUV-可視NIR吸収スペクトルをレーザー照射の前後に収集しました。また、レーザー照射の前後で吸収スペクトルはほとんど変化しないため（図4c）、Her2-GPHNPが癌のPTTの効率的な光吸収体として機能することが保証されます。

インビトロ細胞毒性アッセイ

NPの生体適合性は、生物医学的応用における主要な懸念事項の1つであり、最初に決定する必要があることはよく知られています。したがって、図5aおよびbに示すように、CCK-8アッセイを使用して、乳がんMDA-MB-231およびSKBR3細胞におけるHer2-GPHNPの細胞毒性を評価しました。コントロールと比較して、Her2-GPH NPで処理したMDA-MB-231およびSKBR3細胞の生存率は、10〜200μg / mLの範囲の濃度で24時間90％以上を維持し、細胞毒性が低く、生体適合性が良好であることを示しています。結果として得られたNPは、さらなる細胞実験や臨床研究のための安全性を確保する可能性があります。

インビトロ受容体特異的ターゲティング研究

共焦点レーザー走査顕微鏡

フルオレセインイソチオシアネート（FITC）は、免疫検出用の緑色蛍光プローブとして広く使用されており、数種類のモノクローナル抗体に簡単に結合できます。したがって、FITC標識抗Her2抗体を選択し、NPと抗体の接続を免疫蛍光アッセイでより視覚的に観察することができます。抗her2抗体のGPHNPへの結合を確認するために、GPHNPとHer2-GPHNPを皿に置きました（Φ =20 mm）CLSM分析用。図6に示すように、Her2-GPHNPとGPHNPの両方が明視野ではっきりと観察できました。 GPH NPは蛍光シグナルを示さなかったが、Her2-GPH NPはFITCおよびマージチャネルで明るい緑色の蛍光を示し、抗her2抗体とGPHNPの結合が成功したことを確認しました。

LSCMを利用して、invitroでのHer2-GPHNPのターゲティング特異性を確認しました。図7からわかるように、非標的グループ（b）と比較して、標的Her2-GPH NP（a）とインキュベートしたSKBR3細胞は、細胞膜の表面に明るい緑色の蛍光シグナルを示し、Her2抗体を運ぶNPを示しています。 Her2陽性細胞に効果的に結合する可能性があります[34]。 SKBR3細胞におけるHer2-GPHNPの分布を明確に観察するために、明るい画像（a1）、FITC蛍光画像（a2）、核画像（a3）、およびそのオーバーレイ画像（a4）を提供しました。 NPのインキュベーション時間は短いため、NPは主に細胞膜の表面に分布し、黒い斑点に凝集しました。競合研究では、SKBR3細胞を過剰な遊離抗Her2抗体で前処理した後、Her2-GPH NPとインキュベートした場合、蛍光シグナルはごくわずかでした（図7c）。これらの結果は、Her2-GPH NPのターゲティング挙動が受容体を介したものであり、過剰な遊離抗Her2抗体によってブロックされる可能性があることを示しています[26]。さらに、同じ条件下でHer2-GPH NPで処理したMDA-MB-231細胞ではほとんど蛍光が検出されず（図7d）、Her2-GPHNPがHer2受容体を過剰発現するSKBR3細胞に特異的に結合することが確認されました。

フローサイトメトリー

細胞に対するHer2-GPHNPの結合率は、FCMを介してさらに定量的に評価されました。図7に明確に示されているように、SKBR3細胞への標的NPの結合率（e）は、MDA-MB-231細胞の結合率（h）よりも著しく高かった（86％±3.72％対2.31％±0.36％、 P <0.001）、Her2陽性細胞に対するHer2-GPHNPの特異的ターゲティング能力を示します。さらに、Her2-GPH NPは、過剰な遊離抗Her2抗体で前処理されたSKBR3細胞へのターゲティング結合がほとんどなく（図7g）、ターゲット阻害グループとターゲットグループの間に有意差がありました（3.16％±0.41 ％vs 86％±3.72％、 P <0.001）。上記に基づいて、FCMの結果は、Her2-GPH NPがHer2受容体を過剰発現するSKBR3細胞を認識して結合する特定のターゲティング能力を持ち、ターゲティング動作が受容体を介したものであるというさらに強力な証拠を提供しました。

In Vitro US Imaging and Quantitative Analysis

インビトロソリューション超音波イメージング

私たちの研究では、Her2-GPH NPsソリューションの米国のイメージング効果を、Mylab Twice UltrasoundSystemユニットを使用してさまざまなモードでinvitroで評価しました。図8aから観察すると、Her2-GPH NPs溶液で満たされたチューブは、2DグレースケールモードとCEUSモードの両方で強い点線のエコーを示しました。対照的に、DI水はエコーとして現れました。さらに、Her2-GPH NPの濃度が高くなると、超音波造影信号は徐々に増加しました。 TICに示されているように、Her2-GPH NPの平均シグナル強度は、NPの濃度が増加するにつれて徐々に増加し、CEUSの結果との対応を維持しました。 2 mg / mLの濃度の薬剤は、0.1 mg / mLのNPよりも有意に強いコントラスト増強シグナルを示しました（82±0.69dB対27±6.7dB、 P <0.01）、より強い後方散乱がNPのより高い濃度によって生成されることを示します。上記は、Her2-GPH NPがinvitroで十分なコントラスト増強効果を有し、そのようなコントラスト増強が濃度依存性であることを示した。さらに、2 mg / mLの濃度でのHer2-GPHNPの超音波イメージング時間の長さも調査されました（図8b）。 Her2-GPH NPは、2分前に絶妙な造影剤増強シグナルを示し、シグナル強度は時間の経過とともに徐々に減少しました。ただし、5分以内に明らかな造影信号がありました。これは、臨床造影超音波検査の要件を満たすことができます。 UCAとしての従来のガス充填マイクロバブルは、超音波下での非線形振動によって血液の後方散乱信号を増強する可能性がありますが、血管内イメージングの制限と安定性の低さのため、組織分子評価には適していません[35]。ガス充填剤と比較して、液体フルオロカーボン充填PLGAナノカプセルは、循環半減期が長く、音響安定性があります[16]。さらに、私たちの以前の研究では、Auナノシェルは原子番号と密度が高いために優れた反射特性を持っていることがわかりました[36]。したがって、PFOBを充填したPLGAナノカプセルの超音波共鳴特性と、Auナノシェルの優れたエコー源性を組み合わせました。これにより、invitroでHer2-GPHNPの後方散乱信号が顕著に増強されました。

米国の乳がん細胞のターゲットイメージング

乳がん細胞に対するHer2-GPHNPの標的超音波イメージング能力は、Mylab Twice UltrasoundSystemユニットを使用して2Dグレースケールモードで評価されました。図9aに示すように、NP処理細胞と対照細胞の両方が、明確な境界を持つゲル内に均一な高エコーバンドを示しました。 Her2-GPH NPで処理されたSKBR3細胞のエコー源性バンドは、非標的および対照SKBR3細胞のエコー源性バンドよりも明るく高密度であることがはっきりと観察できました。ただし、ターゲットまたは非ターゲットNPで処理されたMDA-MB-231細胞では、有意なエコー信号の違いは観察されませんでした。定義されたROIに基づいて画像の平均グレースケール値をさらに定量化し、その結果を図9bに示しました。標的Her2-GPHNPで処理されたSKBR3細胞のグレースケール値は、SKBR3非標的および対照群のグレースケール値よりも有意に高かった（ P <0.01）。さらに、標的化されたHer2-GPH NPで処理されたSKBR3細胞は、同じNPで処理されたMDA-MB-231細胞と比較して高いグレースケール値を示しました（ P <0.05）。これらの結果は、Her2-GPH NPがHer2陽性SKBR3細胞に特異的に結合し、標的細胞の超音波分子イメージング効果を高める可能性があることを示しています。

インビトロMRイメージングおよび定量分析

T ₂ Her2-GPHNPの測定とMRイメージング

SPIOは T で集中的に調査されています ₂ 周囲の水プロトンの横緩和時間を短縮する能力による加重MRイメージング。これにより、MR信号強度が低下し、標的病変の負のコントラスト強調を提供できるようになります[37、38]。 T ₂ さまざまなFe濃度のHer2-GPHNPのコントラストイメージング機能を、0.5Tの磁場で評価しました。図10aは、横緩和率（1 / T ）を示しています。 ₂ ）Her2-GPHNPs水溶液中の鉄濃度の関数としての水プロトンの。そしてリラックス性（ r ₂ ）は、勾配に基づいて441.47 mM ^-1 と計算されました。 s ^-1 、これは市販のSPIOベースのMRイメージング造影剤Feridex（152 mM ^-1 ）の2倍以上の高さです。 s ^-1 ）同じ磁場強度の下で[39]。より高い T ₂ 緩和能は、高分子マトリックス内のSPIOの凝集により、磁性NPのサイズが比較的大きくなり、磁性相互作用が強化されるという事実に起因する可能性があります[37、40]。さらに、 T の信号強度 ₂ 鉄濃度の増加に伴い、加重MRイメージングは徐々に減少し（図10b）、Her2-GPHNPが T の能力を持っていることがさらに確認されました。 ₂ -加重MR造影画像。

乳がん細胞のターゲットMRイメージング

SKBR3およびMDA-MB-231細胞に対するHer2-GPHNPの標的MRイメージング効果は、in vitro T によって確認されました。 ₂ -加重MRイメージング。図10cおよびdに示すように、標的化されたHer2-GPH NPで処理されたSKBR3細胞は、顕著な負のコントラスト増強を示し、シグナル強度は対照細胞と比較して48％減少しました（ P <0.001）。ただし、非ターゲットGPHNPs処理SKBR3細胞のMR信号強度はほとんど減少を示さなかった。さらに、Her2-GPHNPまたはGPHNPで標識されたMDA-MB-231細胞のシグナル強度は、対照群と比較して有意に変化しませんでした（ P > 0.05）。さらに、Her2-GPH NPで処理されたSKBR3細胞は、MDA-MB-231細胞よりも高度なシグナル強度の低下を示しました（ P <0.001）、これは2つのセルを互いに区別するために使用できます。上記の結果を総合すると、Her2-GPHNPが T を増強する可能性があることが示されました。 ₂ -受容体を介した細胞特異的取り込みによる強調MR画像[41]。

インビトロでのターゲットPTT評価

最初に、カルセイン-AM /ヨウ化プロピジウム（PI）染色を使用して、invitroで標的光熱細胞毒性を視覚的に評価しました。非蛍光性の生細胞染色剤であるカルセインAMは、細胞膜に浸透して加水分解し、生細胞内で緑色の蛍光性カルセイン色素を生成します。ヨウ化プロピジウム（PI）は死細胞の染色であり、死細胞のDNAに結合して赤色蛍光を発します[33]。図11aに示すように、NIRレーザー照射またはHer2-GPH NPを個別に使用した場合、明らかな死細胞はなく、レーザー照射もNP自体も細胞毒性がないことを示しています。同様に、NIRレーザーと組み合わせて非標的GPH NPで処理された細胞は、細胞死をほとんど示しませんでした。逆に、Her2-GPH NPをレーザー照射の存在下で処理すると、多数の死細胞が観察され、光熱効果を標的とすることで高熱細胞死を誘発できることが示唆されました。細胞生存率は、CCK-8アッセイによってさらに定量的に評価されました。図11bに示すように、Her2-GPH NPとレーザー照射で処理されたSKBR3細胞は、対照群（ P ）と比較して細胞生存率の低下（62±4.56％）を示しました。 <0.001）。さらに、10分間のレーザー照射下では、標的Her2-GPH NPs群の細胞生存率は非標的群よりも有意に低かった（38±4.56％対87.6±4.06％、 P <0.05）。

さらに、CCK-8アッセイを使用して、さまざまな濃度でのHer2-GPHNPの光熱細胞毒性をさらに定量的に評価しました。図11cに示すように、NIRレーザー照射なしでHer2-GPH NPで処理されたSKBR3細胞の生存率は90％以上を維持しましたが、レーザー照射細胞の生存率はHer2-GPHNPの濃度の増加とともに大幅に減少しました。同じ濃度の非レーザー照射細胞と比較して、200μg/ mLの濃度で生存しているのはレーザー照射細胞の20％未満でした（ P <0.001）。これらの結果はさらに、比較的低濃度のHer2-GPH NPが、SKBR3細胞を殺すのに十分な温度上昇を提供するのに十分であることを確認しました。

さらに、SKBR3細胞とMDA-MB-231細胞を異なる比率で共培養して、乳房腫瘍組織におけるHer2の不均一な発現をシミュレートしました。結果は、Her2-GPH NPの光熱誘導後の総細胞生存率は、SKBR3細胞の割合の増加とともに減少し、他の割合グループの総細胞生存率は、100％SKBR3細胞グループのそれよりも有意に高かったことを示しました（ P <0.05）（追加ファイル1：図S1）。さらに、Her2-GPH NPが30分間存在する場合、NIRレーザーによる誘導後の総細胞生存率は、非レーザー照射細胞よりも有意に低かった（ P <0.05）、100％MDA-MB-231セルグループを除く。まとめると、Her2-GPH NPはSKBR3細胞に特異的に結合する可能性があり、光熱効果によって癌細胞を死に至らしめる大きな可能性を秘めていました。 SKBR3細胞の光熱温熱療法の考えられるメカニズムは、主に、細胞内タンパク質を変性させることによって正常な細胞の成長と増殖を阻害した、癌細胞の高温への曝露に起因するはずです[42]。

結論

デュアルモーダルUS / MRイメージングとターゲットPTTを統合したHer2機能化セラノスティック剤であるHer2-GPHNPは、in vitroでの設計、製造、調査に成功しています。抗Her2抗体と結合することにより、この薬剤は、Her2を過剰発現している乳がんSKBR3細胞を高い特異性と感度で認識または結合することができます。さらに、PFOBとSPIOの同時ローディング、およびAuナノシェルPLGA「シェルコア構造」の構築により、得られたHer2-GPH NPは、in vitroUSおよび T で優れたコントラスト増強を提供します。 ₂ -加重MR画像。さらに、Auナノシェルの形成により、この薬剤を乳がん細胞の標的NIRPTTの効率的な光吸収剤として機能させることができます。私たちの結果は、乳がんの共同診断と補助療法を統合するための予備的な探索的研究を提供しており、invivoでのさらなる研究が依然として必要です。