標的siRNA送達のためのレドックス感受性ゼラチン/シリカ-アプタマーナノゲル

はじめに

RNA干渉（RNAi）は遺伝子の配列特異的サイレンシングであり、その高い特異性と低い毒性により、遺伝性疾患、癌、感染症などの幅広い疾患の治療において最も有望な方法として現在評価されています。 [1]。二本鎖RNA分子を含む低分子干渉RNA（siRNA）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ分解に対して耐性があり、したがってアンチセンス療法よりも優れています。化学的に修飾されたヌクレオチドをsiRNAに組み込むことで、RNAiの有効性と持続時間を増減させました。センス鎖のリボヌクレオチドをデオキシヌクレオチドに置き換えると、センス鎖の安定性が高まり、RNAiの有効性が約40％維持されることが証明されています[2、3]。ただし、siRNAの組織特異的送達は、in vitro研究で観察された優れた遺伝子ノックダウンの効力にもかかわらず、そのアプリケーションにとって依然として大きな障害となっています[4、5]。

ナノ粒子ベースのデリバリーは、効果的なsiRNAの安定化と、部位特異的なデリバリーのためのさらなる修飾において潜在的な利点があります[6、7、8]。 siRNAの生産的な部位特異的送達は、トランスフェクションを強化し、ほとんどの実際のアプリケーションで必要とされるオフターゲット効果を減らすことができます[9]。ヌクレオリンは多様な生物学的プロセスに関連しており、さまざまな正常細胞の核や細胞質で乱暴に発現しています。さらに、ヌクレオリンは、正常な対応物と比較して、活発に増殖している癌細胞の原形質膜上で高度に発現されており、したがって、抗腫瘍治療の魅力的な標的として使用されている。 G-カルテットDNAアプタマーであるアプタマーAS1411（AGRO100としても知られる）は、核因子-kB必須モジュレーターと組み合わせることにより、細胞表面のヌクレオリンに強く結合し、癌細胞の抗アポトーシス経路を遮断することができます。ヒトの癌治療のための最初の核酸アプタマー薬[10、11]。これまでのところ、AS1411はさまざまなナノ粒子にうまく結合し、それらを癌細胞に内在化させています[12、13、14、15]。ゼラチンは、その優れた生体適合性、生分解性、およびゲル化特性により、siRNAのカプセル化に使用されてきました[16、17、18]。私たちのグループは、サイズと表面電荷が制御された一連のシロキサン架橋ゼラチンナノゲル（GS NG）を調査し、invitroおよびinvivoでのGSNGのトランスフェクション効率を実証しました[19、20]。

細胞内バリアに加えて、siRNAの効率的な分解やエンドソーム脱出を含む内在化後の細胞内バリアも同様に挑戦的なままです。不安定または非不安定な結合を介したキャリアへのsiRNAの結合は、この送達の課題を克服するための有望な方法です。酸性pHおよび酸化還元電位下での刺激応答性放出は大きな関心を集めています。ジスルフィド架橋は、細胞外環境でのグルタチオン（GSH）レベルが高いため、腫瘍細胞の切断された結合を介した薬物放出のバーストにおいて大きな可能性を示します[21、22]。ジスルフィド結合を介して形成されたポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）/ siRNAコンジュゲートは、カプセル化と送達効率の向上を示すことが報告されています[23]。

この研究では、ジスルフィド接合の酸化還元応答性とアプタマーAS1411の特異的腫瘍標的化の二重機能を備えたGSに基づくハイブリッドナノゲルを、癌治療用のsiRNAキャリアとして検討しました（スキーム1）。 AS1411機能性GSNGが効果的な細胞内在化を改善し、invitroでルシフェラーゼモデル遺伝子の腫瘍特異的遺伝子サイレンシングを達成するかどうかを調査することを目的としています。さらに、このシステムの安全性もinvitroで評価されました。

酸化還元応答性で腫瘍を標的とするApt-GSNGは、ジスルフィド結合とアプタマーAS1411を用いたsiRNAデリバリー用に開発されました

メソッド

資料

ゼラチン（ブルーム番号：240-270、pH 4.5-5.5）はBBI Company Inc.（米国）から購入しました。 N -スクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、3-グリシドキシプロピル-トリメトキシシラン（GPSM）、および3-アミノプロピル-トリメトキシシラン（APTMS）は、Sigma-Aldrich Co.（USA）から購入しました。 3-（4,5-ジメチルチアゾリル-2）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）はAmresco Co.（USA）から購入しました。ダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンは、Hyclone Co.（USA）から入手しました。 AS1411アプタマー、5'-FAM標識AS1411、およびネガティブコントロールDNA（TDO）は、Sangon Biotech Co.（中国）によって合成されました。 Luc-siRNAのチオールセンス鎖、5'-SH-（CH ₂ ） ₆ -CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3 '（リボヌクレオチドの代わりにデオキシヌクレオチド）およびアンチセンス鎖、3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5'、および3 '末端のFAM標識アンチセンス鎖を合成し、Gene Pharma Co.中国）。 Lipofectamine 2000、ルシフェラーゼプラスミドpGL3、およびルシフェラーゼアッセイシステムは、Promega Co.（USA）から購入しました。悪性ヒト肺腺癌A549細胞と正常なNIH3T3線維芽細胞が使用され、厦門大学（中国）の生物医学工学センターから提供されました。使用したすべての材料は分析グレードであり、さらに精製することはありませんでした。ガラス器具は徹底的に洗浄され、脱イオン水ですすがれました。

DNA配列は次のとおりです：

AS1411アプタマー：5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3 '、コントロールTDO：5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'

Apt-GS / siRNA複合体の調製と特性評価

アミノ官能化ゼラチン/シリカナノゲル（GS NG）は、以前に説明されているように、最初にゾルゲル法によって調製されました[19]。通常、0.2gのGPSMを20mLの0.75％ゼラチン水溶液（pH =3）に60°Cで30分間攪拌しながら添加し、続いて0.08gのAPTMSを添加してさらに24時間インキュベートしました。得られたGSNGを3回の遠心分離（14,000 rpm、25°C、12分）で精製しました。次に、GS NG（0.5 mL、PBS中5 g / L）を25 uL SPDP（DMSO中20 mM）で室温で60分間処理した後、チオール化AS1411（1 mg / mL）を添加し、 12h。 Apt-GSナノゲルは、遠心分離（14,000 rpm、25°C、12分）によって得られ、脱イオン水で3回精製されました。第三に、得られたSPDP活性化Apt-GS NG懸濁液（80 mL、5 mg / mL）をsiRNAセンス鎖と4℃で一晩直接混合しました。遠心分離による精製後、siRNAアンチセンス鎖を添加し、94°Cで5分間インキュベートした後、47°Cで20分間アニーリングして、Apt-GS / siRNA複合体を形成しました。

AS1411-GSおよびAS1411-GS / siRNA複合体の表面形態を透過型電子顕微鏡（TEM）（Hitachi S-4300、日本）で調べた。各サンプルの粒子サイズとゼータ電位は、Nano-ZS Zetasizer動的光散乱検出器（Malvern Instruments、英国）によって測定されました。有効粒子径は、対数正規分布を仮定して、MalvernZetasizerソフトウェアを使用して自己相関関数から計算されました。 GSとAS1411またはsiRNAの結合は、F-7000蛍光顕微鏡（Olympus-IX73、日本）を使用して未付着のFAM標識DNAの濃度を収集および測定することによって決定されました。総アミノ基（-NH ₂ ）GSナノゲルの表面のレベルは、ニンヒドリン比色反応を使用して定量的に決定されました。量は約0.642mmol / gでした。

ゲル電気泳動分析

ゲル電気泳動は、TBEバッファー中の2％（w / v）アガロースゲルを使用して、100 Vで20〜30分間実施しました。画像は、ゲルドキュメンテーションシステム（Tanon GIS-2008、中国）を照射することによって観察されました。 Apt-GS / siRNAカプセル化アッセイでは、裸のsiRNA、GS / siRNA、およびApt-GS / siRNA複合体を添加物なしでゲルにロードしました。レドックス応答アッセイでは、GS / siRNAおよびApt-GS / siRNA複合体をPBS中の10mMGSH溶液と2時間インキュベートしてから測定しました。

インビトロ細胞毒性

ヒト肺腺癌A549細胞に対する細胞毒性をMTTアッセイで評価した。簡単に説明すると、A549細胞（1×10 ⁴ 細胞/ウェル）をポリスチレン96ウェル培養プレートに播種し、70％コンフルエンスになるまで24時間インキュベートしました。培地を除去した後、ナノゲル（100–600 mg / mL）を含む100μLの無血清DMEM培地を各ウェルに添加しました。培地で処理された細胞は、ネガティブコントロールグループとしてのみ機能しました。 24時間の共培養後、100μLの新鮮な培地と20μLのMTT溶液（PBSバッファー中5 mg / mL）を加え、さらに4時間培養しました。次に、MTT溶液を除去し、100μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を添加しました。暗所で30分間振動させた後、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（TECAN DNA export、スイス）で490nmの波長で測定しました。すべての実験は3回行った。相対的な細胞生存率（％）は、未処理のコントロール細胞に対するパーセンテージとして表されました。

セルの内部化

細胞を25μLのFAM標識Apt-GSおよびTDO-GSナノゲル（2 mg / mL）と無血清培地で37℃で10時間共培養します。 PBSで3回洗浄した後、細胞をパラホルムアルデヒド（PBS中4％）で30分間固定し、共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica、ドイツ）で観察しました。細胞への取り込みを定量化するために、細胞を25μLのFAM標識AS1411-GSおよびTDO-GS（2 mg / mL）で37°Cの無血清培地で一定期間（0.5–16 h）処理しました。 Apt-GS NGの細胞取り込みにおけるヌクレオリンの役割を評価するために、調製したApt-GS NGとさまざまな濃度（0.5、5、および50μM）の遊離AS1411アプタマーの混合物をA549細胞と8分間インキュベートしました。 h。次に、細胞を氷冷PBSに再懸濁し、EPICS XLフローサイトメーター（Beckman Coulter、USA）を使用して、FAM標識ナノゲルを含む蛍光細胞を10,000個の細胞からカウントしました。データ分析はEPICSXLフローサイトメーターソフトウェアを使用して実行され、分析ゲートは陽性領域内にあるコントロール細胞の1％として選択されました。

遺伝子サイレンシング

ルシフェラーゼのsiRNAとルシフェラーゼ発現細胞の組み合わせを使用して、遺伝子をサイレンシングする能力を調べました。簡単に説明すると、ルシフェラーゼを発現するA549（2×10 ⁵ 細胞/ウェル）およびNIH 3 T3線維芽細胞（4×10 ⁵ 細胞/ウェル）を12ウェルプレートに播種し、一晩培養した後、LUC-siRNA（またはコントロールsiRNA）を含む100μLのテストコンプレックス（80μg/ mL）で8時間処理しました。サンプルは3つのグループに分けられました：（a）8時間のApt-GS / siRNA複合体のみ、（b）8時間のApt-GS / siRNA複合体、続いてさらに1時間のリポソーム（A-GS / si→と名付けられました）リップグループ）、および（c）Apt-GS / siRNA複合体とリポソームの8時間の共インキュベーション（A-GS / si +リップグループ）。無処理の細胞およびルシフェラーゼプラスミドpGL3（マディソン、ウィスコンシン州、米国）でトランスフェクトされた細胞を対照として使用した。さらに40時間のインキュベーション後、製造元のプロトコルに従ってルシフェラーゼアッセイシステムを使用して細胞内のルシフェラーゼ発現を定量化することにより、遺伝子ノックダウン効率を調査しました。実験は3回行われ、データは平均値±平均値の標準誤差として示されています。

結果と考察

GS-AS1411 / siRNA複合体の合成と特性評価

癌を標的とするsiRNA担体を構築するために、ゼラチン/シリカ-AS1411（Apt-GS）ナノゲルがゾルゲル法を使用して設計されました（スキーム1）[19、20]。典型的なTEM画像（図1）は、ブランクGSとApt-GSが平均直径170〜200nmの分散した球状構造であることを明らかにしました。 AS1411とsiRNAのGSNGへのカップリングを確認するために、FAM標識DNAを合成に使用しました。 GS上の共役アプタマーの量は、蛍光スペクトルを使用して定量化した場合、約0.65μmol/ gでした。一方、強い緑色の蛍光は蛍光画像で簡単に観察でき、アプタマーAS1411とsiRNAの統合を示唆しています。図2に示すように、裸のGS、Apt-GS、およびApt-GS / siRNA NGの流体力学的サイズ（それぞれ162.3 nm、216.5 nm、および234.9 nm）は、機能化手順に伴い、表面機能層。一方、Apt-GSのゼータ電位は、表面の負のDNAアプタマーのマスキング効果により、裸のGS NG（40.1±0.5 mV）よりも正ではありませんでした（33.9±0.5 mV）。表面でsiRNAとさらに結合した後でも、Apt-GS / siRNA NGのゼータ電位は、siRNAからの過剰な遊離の負のリン酸基のために、24.9mVに負にシフトします。この結果は、強い正電荷が血液中の負電荷タンパク質を妨害し、細胞膜を破壊する可能性があるため、生物学的毒性の低下を示唆しました[24]。

Apt-GSの画像（ a 、 c ）およびApt-GS / siRNAナノゲル（ b 、 d ）。 a 、 b TEM画像。スケールバーは0.5μmを表します。 c 、 d 蛍光画像。スケールバーは5μmを表します

GS、Apt-GS、およびApt-GS / siRNAナノゲルの流体力学的サイズとゼータ電位

siRNAのロードとリリース

RNAiが成功するのは、siRNAがその担体から細胞質に急速に送達および放出される場合のみです[25]。腫瘍細胞は、正常細胞よりも7〜10倍高いGSH濃度を持っています[26、27]。この研究では、siRNAはジスルフィド架橋反応を介して活性なApt-GSNGに結合しました。ゲル電気泳動（GE）を実施して、Apt-GS / siRNA複合体のsiRNAのローディングおよびリリース能力を評価しました。予想通り、遊離pDNA（図3、レーン1〜5）は通常の位置に移動しましたが、Apt-GS / siRNA複合体は、電気移動度シフトアッセイ（図3、レーン10〜11）で移動度の低下を示し、良好であることを示しています。 siRNAのローディング。細胞内の状態を模倣するために、10 mMのGSHを複合体で2時間処理して、Apt-GS / siRNANGを減らしました。図3、レーン6〜7に示すように、GSH処理後のポリアクリルアミドゲルでsiRNA分子が観察され、Apt-GS / siRNANGがグルタチオンの存在下でジスルフィド切断によって機能的なsiRNA分子を可逆的に放出できることを示しています。さらに、ナノ粒子上のsiRNAの量は、2％ポリアクリルアミドゲル電気泳動でsiRNAとコントロールsiRNAの総量を比較することによって分析されました。 Apt-GSは、マイクログラムあたり3：1〜2：1pmolの比率でsiRNA分子をカプセル化しました。また、siRNAとApt-GSの混合物は、ネガティブsiRNAが物理的に捕捉されているため、保持力が弱いことにも注意してください（図3、レーン8）。

Apt-GSナノゲルへのsiRNA可逆的結合のAGE分析。レーン1〜5：50、40、30、20、および10pmolの量の遊離siRNA。レーン6および7：GS / siRNAおよびApt-GS / siRNA、2hで10mMGSH。レーン8：遊離siRNAとApt-GSNGの混合物。レーン10および11：コントロールとして10 mMGSHを使用しないGS / siRNAおよびApt-GS / siRNA複合体

細胞毒性とヌクレオリンターゲティング

インビトロ細胞毒性評価は、A549細胞におけるMTTアッセイによって調査された。 MTTアッセイは、調製されたナノゲルの細胞毒性を評価するために使用されます。無毒のルシフェラーゼsiRNAがレポーターとして選択されましたが、これは腫瘍細胞に殺傷効果はありません[28、29]。したがって、細胞生存率は、担体の生体適合性を表しています。図4に示すように、細胞増殖は、100〜600μg / mLグループの濃度（細胞生存率> 80％）でGS、Apt-Apt、およびApt-Apt / siRNAの影響をあまり受けず、細胞毒性は用量に現れました。 -依存。裸のGSNGと比較して、AS1411修飾ナノゲルは、NF-κBシグナル伝達の阻害[27、30]および細胞小器官膜の破壊[16]により、細胞生存率がわずかに低下しました。 Apt-GSナノゲルの良性の生体適合性により、invivoでのsiRNAキャリアとして適しています。

MTTアッセイで測定されたさまざまな濃度のGS、Apt-GS、およびApt-GS / siRNAナノゲルを使用したA549細胞の細胞生存率

腫瘍細胞におけるApt-GSのinvitroでのターゲティングを評価するために、A549細胞と3T3線維芽細胞を同量のFAM標識Apt-GSまたはコントロールTDO-GS（コントロールオリゴヌクレオチドで装飾されたGS）とインキュベートしました。 3T3細胞で、または細胞をコントロールTDO-GSで処理した場合、低レベルの蛍光が観察されました（図5b、c）。対照的に、アプタマーAS1411によって放出される緑色蛍光は、A549癌細胞で著しく増強され（図5a）、ヌクレオリンを標的とするAS1411アプタマーの導入によりApt-GSが腫瘍細胞に特異的に蓄積されたことを示唆しています。フローサイトメトリーによる定量分析（図6）では、Apt-GSNGは両方の細胞タイプで時間依存性の蛍光強度を示しました。 A549細胞と3T3細胞におけるApt-GSの内在化の0.5から16hの蛍光強度は、それぞれ13倍と2倍改善しました。 NGを含む細胞比に関しては、最初の30分間で急速に増加し、A549では8時間で飽和の可能性が最大になりました。A549細胞の96％が16時間以内にナノゲルに付着または取り込まれましたが、3T3細胞の52％のみでした。観察されました。ナノゲルの細胞取り込みにおけるヌクレオリンの役割を評価するために、調製したApt-GS NGとさまざまな濃度（0.5、5、および50μM）の遊離AS1411アプタマーの混合物をA549細胞と8時間インキュベートしました。遊離AS1411アプタマーを使用して細胞膜で発現するヌクレオリンに対するApt-GSNGと競合すると、ナノゲルを含む細胞の蛍光強度とパーセンテージがそれぞれ50％と30％減少し、ヌクレオリン誘発性受容体介在性エンドサイトーシスが示唆されました（図6c）。これらのデータは、Apt-GSNGがヌクレオリンを介した内在化を介してA549癌細胞でより高い蓄積を示したことを示しています。

a – c Apt-GSおよびTDO-GSナノゲルによって送達されるFAM-siRNAの細胞取り込み。画像はCLSMで撮影されました。緑の信号：FAM。スケールバーは10μm

異なる細胞型におけるFAM標識Apt-GSおよびTDO-GSナノゲルの細胞取り込みのフローサイトメトリー分析（FCMS）。挿入：FACSプロファイル、 a 、 b 曲線の赤、緑、青、紫、水色、および黄色は、0.5〜16時間のインキュベーション時間を示します。 c 赤、緑、青、紫の曲線は、0から16μMまでのAS1411の濃度を意味します

RNA干渉

デオキシヌクレオチドをsiRNAに組み込むと、センス鎖の安定性が高まり、RNAiの有効性が約40％維持されることが報告されています[2、3]。テストsiRNAキャリアのノックダウン効率を評価するために、両方の細胞でリボヌクレオチド置換ルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを採用しました。 siRNAの遺伝子ノックダウン（KD）効率は、48時間後のルシフェラーゼ活性によって評価されました。図7aに示すように、Apt-GS / siRNAは、通常の3T3細胞の6％と比較してA549細胞の4.6倍の遺伝子ノックダウン効率を改善し、良好な細胞選択性を示しています。これは、アプタマーAS1411修飾が、ターゲティング効果を生成することによってトランスフェクション効率を高めることを示唆しました。カチオン性リポソームは、貨物の配送を支援し、リソソームから脱出することが証明されています[31]。さらに、その後のリポソームの添加（A / si-GS→Lipグループ）は、エンドソーム破壊にもかかわらず、siRNAを介した遺伝子サイレンシング活性（30.4％）の改善に役立たず、ジスルフィド切断によるグルタチオン（GSH）細胞内環境でのsiRNA放出を推測しました。さらに、リポソームとApt-GS / siRNA（A / si-GS + Lipグループ）の同時トランスフェクションは、以前の報告に対応して、リポソーム支援リソソームエスケープを介して、A549でのルシフェラーゼ発現のノックダウン効率をわずかに改善しました（41.6％）[27 、30]。しかし、A549細胞は3T3細胞と比較してA / si-GS→LipグループとA / si-GS + Lipに対してそれぞれ2.7倍と1.4倍の遺伝子サイレンシング活性を示し、細胞選択性の低下を推測しました。 / P>

さまざまな処理を施したApt-GSナノゲルに配合された抗ルシフェラーゼsiRNAのinvitroサイレンシング効果（ a ）および遺伝子サイレンシングにおけるApt-GS / siRNA複合体（A-GS / si）の濃度（ b ）

次に、RNAiに対するナノゲルの濃縮効果を調べました。図7bに示すように、遺伝子干渉効率は、80μg/ mlの複合体濃度で最大に達しました。 120μg/ mlの濃度でのKD効率の低下は、アプタマーによる細胞毒性の増加が原因である可能性があります。エンドソームエスケープエージェントリポソームの添加は、低濃度のApt-GS / siRNAナノゲル（40μg/ mlおよび80μg/ ml）でRNA干渉効率を高めることができますが、高濃度（120 μg/ ml）。したがって、Apt-GSはsiRNAを腫瘍細胞に正常に送達し、その後特定のRNAiをもたらすことができると考えられています。

結論

siRNAの安定性と組織特異的な送達は、RNAi治療の最大の障害として残っています。ここでは、デオキシヌクレオチド置換siRNAを使用してsiRNAの安定性を改善し、GSコアを腫瘍ターゲティング用のAS1411アプタマーと、siRNAのレドックス応答性送達用のジスルフィドリンカーでさらにコーティングしました。車両は約200nmのサイズの球形構造を持ち、表面に正電荷を持っています。これらの調製されたままのApt-GS / siRNAナノゲルは、貨物を保護することができ、ジスルフィド切断によるDTT添加下での加速されたsiRNA放出を示しました。さらに、ターゲティングアプタマーAS1411を使用すると、新しいApt-GSナノゲルApt-GSは、より多くのカーゴを細胞質に効果的に送達および放出し、ヌクレオリン過剰発現A549細胞の沈黙活性をin vitroで約5倍向上させることができます。全体として、これらの発見は、デオキシヌクレオチド置換siRNAの送達が革新的な戦略であり、これらのレドックス応答性の腫瘍標的スマートナノゲルがsiRNA送達および腫瘍治療に大きな期待を抱いていることを示唆しています。

データと資料の可用性

この記事の結論を裏付けるデータセットは、記事に含まれています。

略語

APTMS：

3-アミノプロピルトリメトキシシラン

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

DMSO：

ジメチルスルホキシド

FAM：

フルオレセインアミダイト

GE：

ゲル電気泳動

GPSM：

3-グリシドキシプロピル-トリメトキシシラン

GS NG：

シロキサン架橋ゼラチンナノゲル

MTT：

3-（4,5-ジメチルチアゾリル-2）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド

RNAi：

RNA干渉

siRNA：

低分子干渉RNA

SPDP：

N -スクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）-プロピオネート

TDO：

ネガティブDNAオリゴヌクレオチド