ソノダイナミックN2Oマイクロバブルによる高密度焦点式超音波治療の研究

はじめに

悪性腫瘍は、人間の生命と健康を脅かす主要な病気の1つです[1]。高密度焦点式超音波（HIFU）は、腫瘍の非侵襲的局所切除のための新しい技術です。 HIFUは、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、乳房、骨、子宮の良性および悪性固形腫瘍の治療に使用されています[2、3]。しかし、治療中の超音波エネルギーの減衰、標的領域でのエネルギー蓄積の弱体化、非標的の健康な組織の損傷など、HIFUの固有の制限により、その治療効果が低下します[4、5]。 HIFU照射によって形成される焦点場は小さく、通常はミリメートルの大きさです。大きな腫瘍を切除するには長い時間がかかります。 HIFU照射時間の延長は体温を上昇させ、39.2℃に達することさえあります。腫瘍の深さが体内で増加するにつれて、HIFUアブレーションのエネルギーも増加する必要があります[6]。これらは、患者への身体的損傷のリスクを高め、HIFU治療の効率と安全性を低下させます。したがって、研究者は近年、HIFUの治療効率を高める方法を見つけることに取り組んでいます[7、8、9]。マイクロバブルは相乗的にHIFU治療効果を改善する可能性があります[7、10]。マイクロバブル内のガスは、高音響インピーダンス材料に属します。マイクロバブルは、HIFUが腫瘍組織の領域を照射すると、標的領域での超音波の散乱と反射を増加させます[11、12]。マイクロバブルは、腫瘍標的領域の温度を上昇させ、標的領域でのHIFUエネルギーの蓄積を増加させることにより、HIFU治療の熱効果を高めます[13]。さらに、外因性キャビテーション核としてのマイクロバブルは、組織キャビテーションの閾値を低下させ、HIFUが血液循環を通過して腫瘍組織に入る際のキャビテーション効果を高めます[14]。近年、ソノダイナミックセラピー（SDT）が相乗的にHIFU治療の有効性を高めることができることが研究によって示されています[15、16]。超音波増感剤と超音波の間の相互作用は、一重項酸素とヒドロキシルラジカルを含む活性酸素種（ROS）を生成し、腫瘍細胞を殺し、アポトーシスと壊死を介して腫瘍の成長を阻害します[17]。 SDTは、近年提出された非侵襲的腫瘍治療において大きな進歩を遂げました。これにより、従来の単剤療法に比べて薬剤投与量とHIFU照射力を低減することができます。この2つの利点を最大限に活用するために、この研究ではマイクロバブルとソノダイナミック効果を組み合わせて、HIFUの有効性をさらに向上させました。超音波増感剤はSDTの重要な部分です[18、19]。現在研究されている従来の超音波増感剤のほとんどは、光増感剤からのものです。 N ₂ Oは光増感剤であり[20、21]、紫外線照射条件下で有毒物質を生成します。この研究では、N ₂ の音響感受性 Oも最初に調査されました。以前、N ₂ の適用が HIFU手術での吸入麻酔は、腹部の厚さの増加や皮膚のうっ血など、組織の損傷度を悪化させました[22]。 N ₂ の併用 OとHIFUは組織損傷に対して相乗効果を発揮しました。しかし、どのような生物学的効果N ₂ OはHIFU治療に不明確です。 N ₂ Oは比較的安定した小分子ガスであり、生体内変化や細胞内の組織特異性はありません。組織に広く使用でき、体に毒性を及ぼすことはありません[23、24]。ですから、超音波増感剤としては魅力的な展望です。この研究では、ナノスケールのマイクロバブル（N ₂ O-mbs）は脂質で包まれたN ₂ を使用して調製されました OとC ₃ F ₈ 。 N ₂ の投与量 Oは減少し、invivoでのその作用範囲も腫瘍組織の領域に効果的に制限されました。 N ₂ のソノダイナミック効果 OとHIFUの有効性に対するその相乗効果を調べた。

材料と方法

資料

1,2-ジヘキサデカノイル-rac-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン- N -[メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DSPE-mPEG2000）は、Avanti Polar Lipids（Alabaster、AL、USA）から購入しました。グリセリンとアガロースはSigmaAldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手しました。 N ₂ OとC ₃ F ₈ Chongqing Ruixin Gas Co.、Ltd（中国）から購入しました。 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3'、3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（DiI）、2 '、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA） 、3-アミノ、4-アミノメチル-2 '、7'-ジフルオレセイン、ジアセテート（DAF-FM DA）およびCCK-8は、Beyotime Biotechnology（Chongqing、China）から購入しました。カルセイン-AM（CAM）およびヨウ化プロピジウム（PI）は、Santa Cruz Biotechnology（TX、USA）から入手しました。アネキシンV-FITC / PIは、Nanjing Keygen Biotech（Nanjing、China）から入手しました。一重項酸素センサーグリーン（SOSG）は、Invitrogen（NY、USA）から購入しました。

N _2の準備 O-mbsとC ₃ F ₈ -mbs

N ₂ O-mbは、回転フィルムと機械的振動法を組み合わせて作成しました。シェル材料としてDPPCとDSPE-PEG2000を使用し、N ₂ コアとしてのO。簡単に説明すると、5 mg DPPC、2 mg DSPE-PEG2000、および10 mLクロロホルムを同時に丸底フラスコに注ぎ、超音波で混合して完全に溶解しました。次に、脂質膜をロータリーエバポレーター（60分、55℃、100r /分）で形成した。次に、2 mLの10％グリセロールを添加して脂質膜を水和し、懸濁液を調製しました。 500μLをカプセルチューブに加えた。カプセルチューブはゴム製のキャップで覆われていました。チューブ内の空気はN ₂ に置き換えられました OとC ₃ F ₈ ガス置換装置による。次に、懸濁液を銀-水銀カプセルミキサー（YJT-2、上海医療機器株式会社、中国）によって150秒間機械的に振動させた。最後に、得られた懸濁液を分画遠心分離にかけ、標的N ₂ を得た。 O-mbsで、300 rpmで5分間遠心分離した後、800rpmで5分間遠心分離しました。 N ₂ O-mbをPBSに再懸濁し、さらに使用するために4°Cで保存しました。

C ₃ F ₈ -mbsは、以前に説明されたのと同じ機械的振動法を使用して製造されました[25]。 DiIでラベル付けされたN ₂ O-mbは、スピンフィルム形成中にDiIを追加することで作成できます。 N ₂ Oは低分子量で不安定です。 N ₂ マイクロバブル内のOは簡単にオーバーフローします。したがって、マイクロバブルの半減期は短くなります。 C ₃ F ₈ 超音波マイクロバブル造影剤の研究で広く使用されている高分子不活性ガスです。 C ₃ F ₈ マイクロバブルの安定性を高めることができます。したがって、この調査では、N ₂ OとC ₃ F ₈ （2：1）はN ₂ として混合されました O-mbsコアは安定性を高めます。

N _{2の製造とパフォーマンスの検出} O-mbs

N ₂ の形態とサイズ分布 O-mbは明視野光学顕微鏡下で観察された。 N ₂ の濃度 O-mbsとC ₃ F ₈ -mbsは、計算ガイドラインに従ってglobulimeterによって計算されました。 N ₂ の平均粒子サイズとゼータ電位 O-mbは、動的レーザー光散乱システム（Malvern Instruments、Malvern、UK）によって決定されました。 N ₂ の構造と形態 O-mbは、透過型電子顕微鏡法（TEM、日立H-7600、日立製作所、東京、日本）によって特徴づけられました。準備されたN ₂ O-mbは4°Cで保存されました。 N ₂ の安定性を観察するため O-mbs、形態および濃度は、1日目、2日目、および3日目に記録されました。同時に、マイクロバブルの平均粒子サイズとゼータ電位が決定されました。

細胞培養と動物モデル

ヒト乳がん細胞（MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co.、Ltd。Chongqing、China）は、蘇生後3か月未満の間実験室で継代されました。細胞は、5％CO ₂ を含む37°Cのインキュベーターで維持されました。 、10％ウシ胎児血清、50μg/ Lストレプトマイシンおよび50μg/ Lペニシリンを含むDMEMを使用。細胞が80％のコンフルエンスに達したとき、それらを実験に使用しました。

すべての動物実験は、重慶医科大学の動物倫理委員会のガイドラインに従って実施されました。一定数のメスのヌードマウス（4〜6週齢、体重15〜20 g）は、重慶医科大学（中国、重慶）の動物実験センターから購入しました。固形腫瘍の確立には、MDA-MB-231細胞（1×10 ⁶ 通常の生理食塩水（100μL）に懸濁した細胞/ mL）をすべてのマウスの右後腹に皮下注射した。腫瘍体積が約150mmに達したとき、すべての担癌マウスを治療実験に使用した ³ 。

N _{2の細胞内取り込みと生体適合性評価} O-mb

成長期のMDA-MB-231細胞は、約1×10 ⁵ の密度で播種されました。 共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）フラスコあたり24時間の細胞。次に、100μL（1×10 ⁵ 気泡/ mL）のDiI標識N ₂ 共焦点ディッシュを培地で満たすために、O-mbs完全培地希釈溶液を加えた。皿をマイクロプレートシーラーで密封し、N ₂ を維持しながら、インキュベーターに逆さにして保管しました。 細胞と接触しているO-mbs。 2時間および4時間の共培養後、細胞をPBSで3回穏やかに洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で20分間固定し、DAPIで20分間染色しました。最後に、N ₂ のセルターゲティング動作 O-mbsはCLSM（Nikon A1、日本）によって観察されました。

N ₂ の細胞毒性 O-mbsは標準的なCCK-8アッセイによって評価されました。 MDA-MB-231細胞を96ウェルプレート（5×10 ⁴ ）に播種しました 細胞/ウェル）24時間。次に、100μLの異なる濃度（1×10 ⁴ / mL、1×10 ⁵ / mL、および1×10 ⁶ / mL）のN ₂ O-mbが追加されました。 24時間のインキュベーション後、CCK-8溶液（10μL）を各ウェルに加えた。次に、MDA-MB-231細胞を37°Cでさらに2時間培養しました。最後に、Bio-Tekマイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments、Thermo Fisher Scientific、米国バーモント州ウィヌースキ）を使用して各ウェルの吸光度を450nmで測定しました。

体重約20gの健康な雌ヌードマウス10匹をランダムに2つのグループに分けた。 N ₂ O-mbs（ n =5）グループにN ₂ を静脈内注射した O-mbs（200μL、1×10 ⁵ / mL）および対照群（ n =5）通常の生理食塩水（200μL）を注入。 21日後、すべてのマウスの主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）を切除し、ヘマトキシリン-エオジン（H＆E）で染色しました。

N _{2のinvitroSDT効率} O-mbs

酸素ラジカル検出の方法は、以前の報告[26]に基づいていました。簡単に説明すると、10μLのSOSG（500μM）を2mLのサンプル溶液と混合しました。治療は次のようにグループ化されました：グループC（ブランクコントロールグループ）、PBSのみが追加されました。 N ₂ O-mbsグループ、100μLのN ₂ O-mbs（1×10 ⁵ / mL）2mLのPBS溶液を加えました。 C ₃ F ₈ -mbsグループ、100μLのC ₃ F ₈ -mbs（1×10 ⁵ / mL）2mLのPBS溶液を加えました。 LIFUグループ、PBSは超音波（2 W / cm ² ）で照射されました;重慶医科学研究所、重慶、中国）100秒間; LIFU–N ₂ O-mbsグループ、N ₂ が追加されたPBS O-mbsは超音波照射されました。 LIFU–C ₃ F ₈ -mbsグループ、C ₃ が追加されたPBS F ₈ -mbsは超音波照射されました。実験群の治療パラメータは2W / cm ² として設定されました。 実験結果の分析と比較、および文献の参照を通じて100秒[27、28]。治療目的で使用される超音波パラメータは、次のように設定されました。焦点距離、12.5 mm;脈波モード、50％のデューティサイクル。パルス持続時間、1秒。一重項酸素の生成（ ¹ O ₂ ）は、蛍光強度（λ）を測定することにより、蛍光分光法（Cary Eclipse、Agilent Technologies）によって決定されました。 励起/ λ 発光=504 nm / 525 nm）。超音波の強度と持続時間の選択は、invitro細胞実験と一致していました。

細胞外活性酸素種（ROS）の生成がSOSGアッセイを使用して検出された後、細胞内ROSの生成がDCFH-DAベースのROSアッセイキットによって検出されました。 MDA-MB-231細胞を約1×10 ⁵ の密度で播種しました CLSMフラスコあたりのセル。次に、それらをランダムに6つのグループに分けました：コントロールグループ（治療なし）、N ₂ O-mbsのみのグループ（100μL、1×10 ⁵ 泡/ mL）、C ₃ F ₈ -mbsのみのグループ（100μL、1×10 ⁵ 泡/ mL）、LIFUのみのグループ（2 W / cm ² 100秒間）、LIFU–C ₃ F ₈ -mbsグループ、LIFU–N ₂ O-mbsグループ。細胞接着を可能にするために24時間インキュベートした後、各グループを上記の対応する実験的介入に供した。次に、同量のDCFH-DA（30μM）を各グループの対応する皿に加え、皿を暗所で20分間インキュベートした。次に、細胞をPBSで3回穏やかにすすぎ、細胞に入らなかったDCFHプローブを除去した。最後に、細胞内ROSの生成はCLSMによって決定されました。 N ₂ のSDT効率をさらに検証するには O-mbs、細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間培養し、上記のように6つのグループにランダムに分配しました。次に、対応する治療が各グループで行われた。各グループの細胞を消化し、適切な濃度の細胞懸濁液に調製し、CLSMディッシュに入れました。最後に、CAMおよびPI色素で共染色した後、細胞をCLSMでスキャンして、死んだ（赤）細胞と生きた（緑）細胞を区別しました。アポトーシスは、フローサイトメトリーとアネキシンV-FITC / PI染色によって検出されました。 1時間の処理後、細胞の各グループを遠心分離し、細胞を収集しました。アネキシンV-FITC / PI共染色に続いて、フローサイトメトリー（Becton–Dickinson、ニュージャージー州フランクリンレイクス）の検出が行われました。

N _{2のinvitroソノダイナミック効果} O-mbsはHIFU治療の有効性を高めます

診断用超音波ユニット、治療用超音波ユニット、および中央処理システムで構成されるHIFUシステム（JC200、HIFU Technology Co.、Ltd。、中国、重慶）を前述のように使用しました[29]。治療目的で使用されるHIFUパラメータは次のように設定されました。焦点距離、140 mm;直径、220 mm;リアルタイム診断トランスデューサ周波数、3.5MH。統合されたトランスデューサーは脱気した水に沈められました。 N ₂ の強化効果を評価するには HIFU治療のO-mb、MDA-MB-231細胞を遠心分離、5×10 ⁵ / mL、4つのグループに分けられます：コントロールグループ（治療なし）、HIFUのみのグループ（125 W、5秒）、HIFU–N ₂ O-mbsのみのグループ、HIFU–C ₃ F ₈ -mbsのみのグループ。次に、各グループに対して異なるそれぞれの治療を行った。処理した細胞を遠心分離し、PBSで洗浄し、アネキシンV-FITC / PIで二重染色し、フローサイトメトリー用に回収しました。一酸化窒素（NO）プローブDAF-FMを使用して、各処理グループの上清中のNOを検出しました。すべての実験は3回行った。 TEMを使用して、処理した細胞の超微細構造の形態を特定しました。各処理後、処理された細胞はすぐに2％OsO ₄ で固定されました。 、段階的な一連のアルコールで脱水され、Epon 812（Electron Microscopy Sciences、ペンシルベニア州フォートワシントン）に平らに埋め込まれます。超薄切片（100 nm）を調製し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡で検査しました。

N _{2のExVivoおよびInVivoソノダイナミック効果} O-mbsはHIFUアブレーションの有効性を高めます

新鮮な牛の肝臓組織は地元の食肉処理場から購入し、屠殺後12時間以内に使用しました。結合組織が少なく血管が少ない新鮮なexvivoウシ肝臓を10cm×5cm×5cmの切片にスライスし、37°C​​で1時間脱気しました。ウシの肝臓は3つのグループに分けられました：C ₃ F ₈ -mbsグループ、N ₂ O-mbsグループとPBSグループ。まず、新たに単離したウシ肝臓を脱気水を入れた容器に入れた。次に、200μL（1×10 ⁵ 図6aに示すように、PBS中のマイクロバブルのバブル/ mL）をウシの肝臓に直接注入しました。診断用超音波トランスデューサーのガイダンスの下で、HIFU焦点は注射部位に配置されました。次に、治療用トランスデューサーを使用して、ウシ肝臓注射部位で異なる電力（100 W、125 W、150 W）で5秒間のアブレーションを実行しました。最後に、ウシ肝臓組織の標的領域の凝固壊死体積を、測定された最大の長さ、幅、および深さ（mm）に従って、次の式によって計算した： V （mm ³ ）=π/ 6×長さ×幅×深さ。さらに、各グループのHIFUアブレーション前後のターゲット領域のグレー値が超音波診断画像に記録されました。

20匹の担癌マウスをランダムに4つのグループに分けました（ n =グループあたり5）、コントロールグループ（治療なし）、HIFU–PBSグループ、HIFU–C ₃ を含む F ₈ -mbsグループ、およびHIFU–N ₂ O-mbsグループ。マウスに200μLのC ₃ を静脈内注射した後、HIFU（125 W、5秒）による腫瘍の切除を行った。 F ₈ -mbsグループ、N ₂ O-mbsとPBS。固形腫瘍のHIFUアブレーション手順は、exvivoで単離されたウシ肝臓の手順と同様でした。まず、マウスを1％ペントバルビタール（8 mL / kg）で麻酔しました。マウスの腫瘍部位を脱気水を含む容器に接種した。診断用超音波トランスデューサーのガイダンスの下で、HIFU焦点を腫瘍組織に配置しました。マウスの体重と腫瘍体積を3日間隔で記録した。最後に、治療の21日後にすべてのマウスを殺し、腫瘍組織をマウスから解剖し、H＆E、増殖細胞核抗原（PCNA）染色、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）に送りました。

統計分析

すべてのデータは、GraphPad Prism（バージョン7、GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州ラホーヤ）で提示および分析されました。データは平均±SDとして表されます。各実験は少なくとも3回繰り返された。統計分析は、ボンフェローニ事後検定（すべてのグループを比較）またはダネット事後検定（すべてのグループを対照グループと比較）を使用した一元配置分散分析によって実行されました。 p の値 <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

N _{2の特性評価} O-mbs

N ₂ の準備 修正された機械的振動法によるO-mbは、非常に安定した乳白色の懸濁液になります（図1a）。 N ₂ O-mbsは、室温で72時間保存した後、粒子サイズと形態に大きな変化はありませんでした。光学顕微鏡下では、N ₂ O-mbは、均一なサイズ、良好な分散、および高い安定性で観察されました（図1b）。 N ₂ の濃度 O-mbsは5.12±0.45×10 ⁸ 泡/ mL。 TEM画像（図1c）に示されているように、N ₂ のサイズ O-mbsは均一に分布しており、平均サイズは約450nmでした。 N ₂ O-mb動的光散乱の結果は、458.1±17.26 nmの流体力学的直径（多分散度指数=0.368;図1d）を示しており、これはTEMの結果と一致していました。 N ₂ の可能性 O-mbsは-16.2±0.35mVでした（図1e）（追加ファイル1：図S1）。

a N ₂ の写真 脱イオン水に分散したO-mb; b N ₂ の画像 明視野光学顕微鏡下のO-mbs; c N ₂ の透過型電子顕微鏡画像 O-mbs; d N ₂ のサイズ分布 O-mbs; e N ₂ の見かけのゼータ電位 O-mbs

N _{2の細胞内取り込みと生体適合性} O-mbs

N ₂ の細胞毒性 invitroでの細胞に対するO-mbsをCCK-8法で調べた。対照群の細胞生存率を100％と定義しました。 24時間のインキュベーション後、細胞生存率の結果は、MDA-MB-231細胞に対して有意な細胞毒性を示さなかった。高いN ₂ でも O-mb濃度では、細胞生存率は95％を超えたままでした（図2a）。 N ₂ の細胞毒性 健康なヌードマウスのinvivoでのO-mbを分析した。図2bに示すように、主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）の組織病理学的分析では、N ₂ O-mbsはマウスに重大な毒性損傷を引き起こしませんでした。これらの結果は、N ₂ O-mbは高い生体適合性を持っています。

a 細胞生存率はCCK-8アッセイによって決定されました。 b N ₂ の投与の有無にかかわらず、健康な雌のヌードマウスの主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）のH＆E染色 O-mbs; c a からの画像 d へ 明視野で細胞を表示、DAPIで染色された細胞核、N ₂ DiIによって染色されたO-mb、および3つの蛍光画像のマージされた結果。スケールバー=50μm[ NS 対照群と比較して有意性なし（0気泡/ mL）]

N ₂ の細胞内取り込み 長時間のインキュベーション時間（2時間および4時間）にわたるO-mbは、CLSMによって視覚化されました。 DiI標識N ₂ との細胞のインキュベーション O-mbsは、多数のN ₂ の蓄積をもたらしました。 がん細胞膜および細胞質のO-mbs。図2cに示すように、赤色蛍光N ₂ は良好に共局在していました。 青色蛍光細胞を含むO-mbs。この発見は、N ₂ O-mbはMDA-MB-231癌細胞に効率的に内在化されます。

N _{2のソノダイナミック効果} O-mbs In Vitro

SOSGは、酸素フリーラジカルの生成を検出するための高感度で信頼性の高い、一般的に使用される一重項酸素検出プローブです。 N ₂ の可能性を探る 音響増感剤としてのO-mbs、SOSGはinvitroでのROS生成を検出するために使用されました[30、31]。 SOSGは ¹ と組み合わせます O ₂ 蛍光強度の増加を特徴とするSOSG-EPを形成します。図3aに示すように、N ₂ を含むSOSG溶液の超音波照射後 O-mbs、蛍光強度値は大幅に増加しました。残りのグループと比較して、酸素フリーラジカルの生成が大幅に増加しました（ p <0.01）。

a N ₂ を使用したSOSGの蛍光スペクトル LIFUによって照射されたO-mbs; b 細胞生存率はCCK8アッセイによって決定されました。 c 細胞内ROS生成の共焦点画像（緑色蛍光はDCFH-DAで染色されたROSの陽性染色を示します）; d Image Jによって計算された各グループの平均蛍光強度値（DCFH-DA）。（データは平均±SD、 n として示されました。 =グループあたり5、* p <0.05、LIFU–C ₃ と比較 F ₈ -mbsグループ）

N ₂ の超音波照射後の水溶液中のROS生成の検出に加えて DCFH-DA ROSアッセイキットであるO-mbsを使用して、N ₂ による細胞内ROS産生を測定しました。 O-mbs。図3bに示すように、陽性対照群は最も強い蛍光強度を示しました。次に強い緑色の蛍光シグナルは、LIFU–N ₂ にのみ現れました。 O-mbsグループ、N ₂ の同時存在下でのROSの結果的な生成を明らかにする O-mbsとLIFU照射。ただし、残りのグループでは明らかな蛍光は検出されませんでした（図3c）。対照群の細胞生存率は100％と定義されました。 CCK-8アッセイの結果は、LIFU–N ₂ で約46％の細胞死を示しました。 O-mbsグループ（図3d）。 N ₂ の細胞毒性 LIFUと組み合わせたO-mbは、治療後の細胞死のCLSM観察によって評価されました。 CAMを使用して生細胞を緑色蛍光で染色しました。 PIを使用して、死んだ細胞を赤色蛍光で染色しました。図4aに示すように、LIFU–N ₂ には多くの死細胞がありました。 O-mbsグループ。さらに、フローサイトメトリーの結果は、MDA-MB-231細胞グループのアポトーシス率が他のグループのアポトーシス率よりも有意に高いことを示しました（ p <0.05）結合されたN ₂ の後 LIFU処理を施したO-mb（図4b）。結合されたC ₃ F ₈ -LIFU治療を受けたmbsは、明らかな細胞死やアポトーシスを引き起こしませんでした。結果はさらに、SDTに応答して広範なアポトーシスおよび壊死が起こったことを示した。フローサイトメトリーの結果は、CLSMの結果と一致していました。これらの結果は、N ₂ LIFUと組み合わせたO-mbは、in vitroで腫瘍細胞のアポトーシスを誘導します（追加ファイル2：図S2;追加ファイル3：図S3）。

a 腫瘍細胞のアポトーシスと壊死のフローサイトメトリー分析。 b さまざまな処理後のCAM / PI共染色MDA-MB-231細胞の共焦点画像。スケールバーは100μmです

癌細胞におけるinvitroHIFU相乗効果評価

フローサイトメトリーの結果を図5aに示します。両方N ₂ O-mbsとC ₃ F ₈ -mbsは、HIFUアブレーション後のMDA-MB-231細胞の死亡率を増加させました。さらに、HIFU-C ₃ と比較して F ₈ -mbs、N ₂ O-mbsはMDA-MB-231アポトーシスを有意に増加させました（ p <0.05;図5b）。 NO試験の結果は、HIFU–N ₂ の上清の蛍光強度を示しました。 O-mbsグループも残りのグループよりも有意に高かった（ p <0.05）（図5c）。細胞質と細胞小器官の変化がTEMで観察されました（図5d）。対照群（処理なし）の細胞は、完全な細胞形態を示した。 HIFU群の細胞質に大量の液胞物質が認められた。しかし、細胞はまだ完全な細胞膜と核膜を持っています。ただし、両方のHIFU–N ₂ O-mbsグループとHIFU–C ₃ F ₈ -mbsグループは、細胞膜の完全性の喪失と細胞構造の完全な崩壊を示しました。 TEM観察は、各グループでの治療後の細胞死とアポトーシスの過程の瞬間にすぎなかったことは言及する価値がありました。 N ₂ 外因性マイクロバブルとしてのO-mbは、HIFU治療に明らかに相乗効果をもたらします。 HIFU–N ₂ で O-mbsグループ、N ₂ の音響力学的効果 O-mbsはより多くの細胞アポトーシスを促進する可能性があります。結果は、フローサイトメトリー検出とin vivo実験の両方で検証されています（追加ファイル4：図S4;追加ファイル5：図S5）

a アネキシンV-FITC / PI結合アッセイの結果; b 各グループの平均細胞アポトーシス率。 c N ₂ のNO生成の定量分析 HIFUで照射されたO-mb; d 細胞の透過型電子顕微鏡画像。スケールバーは100μmです。 （データは平均±SD、 n として示されました =グループあたり5、* p <0.05、対照と比較して、 HIFU 、HIFU–C ₃ F ₈ -mbsグループ）

N ₂ HIFU療法の相乗剤としてのO-mbs

摘出されたウシ肝臓のHIFUアブレーション後、標的領域に灰白色の凝固壊死領域が現れました（図6b）。 HIFU前後のターゲット領域の平均エコー強度の変化を図6cに示します。 PBS群と比較して、C ₃ の目標エコー強度値 F ₈ -mbsグループとN ₂ O-mbs群はHIFU治療後に有意に増加しました（ p <0.05）、HIFUアブレーション強度が増加するにつれて増加しました。後者の2つのグループの凝固壊死量と、ターゲット領域のBモード超音波画像のエコー強度は、HIFUパワーが増加するにつれて増加しました（図6d、e）。

a 脱気したウシ肝臓でのexvivoHIFUアブレーションの概略図。 b HIFUアブレーション後の切除されたウシ肝臓の標的領域の写真; c 100 W、125 W、150Wで5秒間ウシ肝臓にHIFUを照射する前後のリアルタイム超音波画像。 d エコー強度の定量分析; e HIFUアブレーション後の切除されたウシ肝臓の標的領域の凝固壊死体積の定量分析。 （データは平均±SD、 n として示されました =グループあたり5、* p <0.05、100 W、5秒、125 W、5秒のグループと比較）

N ₂ の相乗効果 HIFU療法のO-mbはinvivoでさらに検証されました。図7aに示すように、マウスと対応する腫瘍組織のデジタル写真は、さまざまな治療の21日後に記録されました。 N ₂ の後、腫瘍の成長はより効果的に抑制されました HIFU治療と組み合わせたO-mbs。 N ₂ の相乗効果 HIFU治療のO-mbは、H＆E、PCNA、およびTUNEL染色によっても評価され（図7b）、N ₂ HIFU照射と組み合わせたO-mbは、HIFU–C ₃ と比較して、より大規模な腫瘍細胞壊死を引き起こす可能性があります。 F ₈ -mbsグループ。 HIFU–N ₂ で見られる細胞形態の変化 O-mbは、核濃縮、核崩壊、核溶解などの他のグループよりも明白であり、癌細胞の実質的な壊死を示しています。

a さまざまな治療の21日後の担癌マウスとexvivo腫瘍のデジタル写真。 b さまざまな治療後の腫瘍切片のH＆E、PCNAおよびTUNEL染色。 c 21日間の異なる治療後の各グループの対応する計算された腫瘍体積。 d 各グループの担癌マウスの体重。 HE染色のスケールバーは100μmです。 TUNELおよびPCNA染色のスケールバーは50μmです。 （データは平均±SD、 n として示されました =グループあたり5、* p <0.05、HIFU-C ₃ と比較 F ₈ -mbsグループ）

さらに、HIFU–N ₂ の腫瘍体積 O-mbはHIFU–C ₃ よりも有意な抑制傾向を示しました F ₈ -21日以内のmbs（図7c、d）。

ディスカッション

腫瘍治療の新しい方法としてのHIFUは、臨床的に認められており、多くの固形腫瘍の治療において目覚ましい進歩を遂げています[32]。熱効果、キャビテーション効果、機械的効果、および音響化学的効果は、HIFUアブレーション中に腫瘍細胞を殺し、標的領域組織に不可逆的な損傷を引き起こすのに重要な役割を果たします[33]。 HIFUは周囲の正常組織への影響が限定的であり、本質的に非侵襲的な腫瘍治療です。しかし、超音波によって運ばれるエネルギーは、HIFU治療中の伝達距離の増加、標的領域の血流による吸収、および体内の骨またはガスの遮断によって減衰されるため、標的領域に伝達されるエネルギーは減少。しかし、切除時間を延長し、治療力を高めると、皮膚のやけど、神経血管の損傷、その他の合併症などの正常な組織の損傷のリスクが高まります[34]。したがって、HIFUの有効性を高める必要があります。多くの研究により、マイクロバブルとSDTの両方がHIFUの有効性を改善できることが確認されています[15、16、35]。 N ₂ この研究で調製されたO-loadedマイクロバブルは、粒子サイズが小さいですが、超音波マイクロバブル造影剤と同様の特性を持っています。研究によると、ナノ/マイクロバブルはin vitroでのマイクロバブルと同じイメージング機能を備えていますが、invivoでのマイクロバブルよりも優れた機能を備えています[36]。したがって、N ₂ O-mbは、HIFU治療の超音波ガイダンスと位置特定に使用できるだけでなく、HIFUの有効性を高めるための外因性マイクロバブルとしても使用できます（追加ファイル6：図S6）。同時に、N ₂ のソノダイナミック効果 O-mbsはHIFUの有効性を効果的に改善する可能性があります。超音波励起後のROSの生成は、超音波増感剤の最も重要な要因の1つです[16]。 N ₂ の音響感度を検証するには O-mbs、細胞外および細胞内環境の両方でのROSの生成がこの研究で検出されました。両方のテストの一貫した結果は、N ₂ O-mbsは、水溶液と細胞内の両方でROSを生成できます。研究によると、ガス（N ₂ およびO ₂ ）溶液中のキャビテーション核に閉じ込められた場合、次のように開裂反応を起こし、NおよびOフリーラジカルを生成する可能性があります[37、38]。

キャビテーション効果とマイクロバブルパッケージの利点により、N ₂ の難しさが軽減されます。 O反応[39]。細胞とインキュベートした場合、N ₂ O-mbは優れた生体適合性を示します。ナノ粒子の高い選択性、高い親和性、高い薬物負荷[40]、および細胞による活発な食作用は、効率的なN ₂ を促進します。 癌細胞に結合するO-mbs。ナノバブルは、浸透性、安定性の向上、および細胞への侵入または細胞周囲での凝集の容易さを示します[36]。さらに、超音波のソノポレーション効果は、マイクロバブルの細胞への移動を効果的に促進することができます[41]。

従来のマイクロバブル造影剤C ₃ とは対照的 F ₈ -mbs、N ₂ O-mbは、超音波照射後の細胞増殖に対してより大きな阻害効果を示します。これは、細胞内ROSの増加、細胞生存率の低下、アポトーシスおよび壊死を特徴としています。これらの結果は、N ₂ の音響力学的毒性効果を事前に示唆しています。 O-mbs。

HIFU相乗効果実験では、実験結果を分析および比較し、文献を参照することにより、実験グループの治療パラメーターを125 Wに5秒間設定しました。これにより、HIFUパワーが低いと十分な切除効果が誘発され、悪影響が軽減されることが確認されました。結果は、N ₂ O-mbsは、より多くの腫瘍細胞の壊死と進行したアポトーシスを増加させました。 N ₂ O-mbはナノスケールのマイクロバブル相乗剤として作用し、HIFUに応答したその音波力学的効果が異なる実験結果の理由である可能性があります。マイクロバブルとして、N ₂ O-mbsは、標的領域でのHIFUエネルギーの蓄積を増加させ、標的領域の温度を上昇させ、HIFU治療の熱効果を増加させました[11]。キャビテーション効果の生成は、キャビテーションしきい値とキャビテーション核濃度に密接に関連しています[42]。 N ₂ O-mbは、HIFUのキャビテーション閾値を下げ、キャビテーション効果を促進するキャビテーション核でした。したがって、N ₂ O-mbsは細胞壊死を効果的に促進しました。ナノスケールのマイクロバブル相乗剤として、N ₂ O-mbは溶解され、超音波に応答してフリーラジカルと窒素酸化物を生成します。研究により、ROSがアポトーシス誘導の重要な要因であることが確認されています[43]。多くの種類のフリーラジカルが細胞に損傷を与える可能性があることは注目に値します。酸素ラジカルの生成に加えて、N ₂ Oは、腫瘍細胞の死滅に寄与する窒素フリーラジカルなど、切断反応で他のタイプのフリーラジカルを生成する可能性があります。 HIFU処理後の細胞上清で少量の一酸化窒素（NO）の生成が検出され、さらにN ₂ O開裂反応が起こった。等。 [44]は、NOが抗腫瘍機能を持っている可能性があることを報告しました。そのメカニズムには、細胞がトラップされたときに細胞の成長と分裂を失敗させる疑わしい鉄酵素を攻撃するNOが含まれます。さらに、不安定なNOは酸素分子と相互作用してヒドロキシルラジカルを形成する可能性があります（HO ^・ ）およびNO ₂ 。ヒドロキシルラジカルは非常に細胞毒性があり、腫瘍細胞のアポトーシスを促進します。 NOは内皮由来の弛緩因子でもあります。 NOの発生は、HIFU手術中の患者の充血および異常な腫れの原因である可能性があります。切除されたウシ肝臓実験では、Bモード超音波画像のエコー強度、病理学的変化、およびN ₂ の存在下でのHIFUアブレーション後の標的領域の凝固壊死体積を注意深く比較しました。 O-mbs、C ₃ F ₈ -mbsとPBS。これらの結果はすべて一貫していた。 PBSと比較して、N ₂ O-mbsはHIFUの切除効果を効果的に高めました。この相乗効果は、インビボでの固形腫瘍の切除においてもよりよく示され、腫瘍細胞のアポトーシスの増加、腫瘍の体積の減少、および腫瘍の成長の阻害によって明らかにされた。この発見はさらに、N ₂ O-mbsは、HIFU熱腫瘍切除を促進するために使用できる超音波の新しい補助剤である可能性があります。 N ₂ の相乗効果 HIFUのO-mbと相乗メカニズムは、HIFU相乗研究のための新しいアイデアと理論的実践を提供します。しかし、相乗効果の他の関連するメカニズムはさらに調査されるべきです。 N ₂ と組み合わせたHIFUによる腫瘍切除の効果 O-mbsはさらに対処する必要があります。

結論

要約すると、N ₂ を開発しました O-mbナノ粒子。 N ₂ の特性評価と生体適合性 O-mbsが決定されました。 N ₂ の音響感度 O-mbsは、水溶液中および細胞内でのROSの生成を検出することによって調べられました。 C ₃ との比較 F ₈ -mbs、N ₂ O-mbsはROSを生成し、腫瘍細胞のアポトーシスと壊死を促進しました。これは異常な音響感受性を示しました。 HIFU相乗効果実験では、N ₂ の音響力学的効果 O-mbsは、in vitroで腫瘍細胞のアポトーシスと壊死を有意に増加させ、ex vivoで単離されたウシ肝臓標的領域の凝固壊死量とエコー強度を増加させ、invivoで腫瘍増殖を効果的に阻害しました。これらの結果は、N ₂ O-mbsは、HIFUによる腫瘍の切除に使用できる、新しい種類の超音波増感剤および超音波治療用の新しい補助剤である可能性があります。

データと資料の可用性

この原稿でなされた結論は、この論文で提示され示されているすべてのデータに基づいています。

略語

N ₂ O-mbs：

N ₂ Oマイクロバブル

C ₃ F ₈ -mbs：

C ₃ F ₈ マイクロバブル

HIFU：

高密度焦点式超音波

LIFU：

低強度集束超音波

SOSG：

一重項酸素センサーグリーン

SDT：

ソノダイナミックセラピー

DPPC：

1,2-ジヘキサデカノイル-rac-グリセロ-3-ホスホコリン

DSPE-mPEG2000：

1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3ホスホエタノールアミン- N -[メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000

DAPI：

4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール

DiI：

1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩

DCFH-DA：

2 '、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート

DAF-FM：

3-アミノ、4-アミノメチル-2 '、7'-ジフルオレセイン、ジアセテート

CAM：

カルセイン-AM

CCK-8：

細胞計数キット-8

CLSM：

共焦点レーザー走査顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

FBS：

ウシ胎児血清

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

DI：

脱イオン水

ROI：

関心領域

ROS：

活性酸素種

いいえ：

一酸化窒素