ソノダイナミックN₂OマイクロバブルによるHIFUがん治療の改善

概要

高強度集束超音波（HIFU）は代表的な非侵襲的がん治療法ですが、治療効率の低さと周囲正常組織への損傷リスクが更なる臨床発展と応用を妨げています。ソノダイナミック療法（SDT）は、超音波治療中にソノセンシタイザーが生成する反応性酸素種により腫瘍細胞を殺傷します。SDTはマイクロバブルと同様にHIFU効率を向上させます。本研究では、改良機械振動法によりナノスケールN₂Oマイクロバブル（N₂O-mbs）を開発しました。これらマイクロバブルは良好な生体適合性と腫瘍細胞結合能を示しました。N₂O-mbsのソノセンシタイザー感受性は、反応性酸素種生成検出により細胞外および細胞内で検証されました。これらソノダイナミックマイクロバブルの腫瘍細胞に対する毒性効果とHIFU治療への相乗効果を評価しました。超音波照射下でN₂O-mbsが生成する反応性酸素種により有意なアポトーシスが誘導されました。N₂O-mbsとHIFUの組み合わせは、in vitroで腫瘍細胞の壊死とアポトーシスを増加させ、ex vivo牛肝ターゲット領域で凝固壊死体積とエコー強度を増大させました。これらソノダイナミックマイクロバブルはin vivoでも腫瘍増殖を効率的に抑制することが実証されました。N₂O-mbsはマイクロバブルの利点と並外れたソノセンシタイザー感受性により、HIFUの治療とアブレーション効果に顕著な影響を与えます。この知見は、N₂O-mbsがHIFU腫瘍熱アブレーションを促進するために使用できる新規超音波補助剤となり得ることを示唆しています。

はじめに

悪性腫瘍は人類の生命と健康を脅かす主要疾患の一つです[1]。高強度集束超音波（HIFU）は腫瘍の非侵襲的局所アブレーション新技術です。HIFUは肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、乳房、骨、子宮の良性・悪性固形腫瘍治療に成功裏に使用されています[2, 3]。しかし、治療中の超音波エネルギー減衰、ターゲット領域でのエネルギー蓄積弱化、非標的健康組織損傷などHIFU固有の限界が治療効果を低下させます[4, 5]。HIFU照射で形成される焦点領域は小さく、通常ミリメートルオーダーです。大型腫瘍アブレーションには長時間を要します。HIFU照射時間延長は体温上昇を招き、39.2℃に達することもあります。体内腫瘍深度増加に伴い、HIFUアブレーションエネルギーも増加必要があります[6]。これらは患者への物理的損傷リスクを増大させ、HIFU治療の効率と安全性を低下させます。したがって、研究者は近年HIFU治療効率向上法の探索に取り組んでいます[7-9]。マイクロバブルはHIFU治療効率を相乗的に向上させます[7, 10]。マイクロバブル内ガスは高音響インピーダンス材料に属します。HIFUが腫瘍組織領域を照射すると、マイクロバブルがターゲット領域での超音波散乱と反射を増加させます[11, 12]。マイクロバブルはターゲット領域でのHIFUエネルギー蓄積を増加させ腫瘍ターゲット領域温度を上昇させ、HIFU治療の熱効果を増強します[13]。さらに、マイクロバブルは外因性空洞核として組織空洞閾値を低下させ、血液循環で腫瘍組織に到達する際のHIFU空洞効果を増強します[14]。近年、ソノダイナミック療法（SDT）がHIFU治療効率を相乗的に向上させることが示されています[15, 16]。ソノセンシタイザーと超音波の相互作用で生成される反応性酸素種（ROS）、一重項酸素とヒドロキシルラジカルを含む、がアポトーシスと壊死を介して腫瘍細胞を殺傷し腫瘍増殖を抑制します[17]。SDTは近年非侵襲的腫瘍治療分野で大きな進歩を遂げました。従来単独療法と比較して薬剤用量とHIFU照射出力を低減可能です。両者の利点を最大限活用するため、本研究ではマイクロバブルとソノダイナミック効果を組み合わせHIFU効率を更向上させました。ソノセンシタイザーはSDTの重要な構成要素です[18, 19]。現在研究されている従来型ソノセンシタイザーの多くは光感受性物質から派生しています。N₂Oは光感受性物質です[20, 21]、紫外線照射条件下で有毒物質を生成します。本研究ではN₂Oのソノセンシタイザー感受性も初期探索しました。我々は以前、HIFU手術でのN₂O吸入麻酔適用が組織損傷度を悪化させ、腹部と皮膚充血厚増加を含むことを発見しました[22]。N₂OとHIFUの併用は組織損傷に相乗効果を発揮しました。しかし、N₂OがHIFU治療で何らかの生物学的効果を持つかは不明でした。N₂Oは比較的安定な低分子ガスで生体内変換と組織特異性がなく、広く組織で使用でき、人体に無毒です[23, 24]。したがって、ソノセンシタイザーとして魅力的な展望を持ちます。本研究では、脂質被覆N₂OとC₃F₈を用いてナノスケールマイクロバブル（N₂O-mbs）を調製しました。N₂O用量を減らし、その体内作用範囲を腫瘍組織領域に効果的に限定しました。N₂Oのソノダイナミック効果とHIFU効率への相乗効果を検証しました。

材料と方法

材料

1,2-ジヘキサデカノイル-rac-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）と1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（DSPE-mPEG2000）をアバンティポーラリピッズ社（アラバマ州アルバスター、米国）から購入。グリセリンとアガロースはシグマアルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス、米国）から入手。N₂OとC₃F₈は重慶瑞信ガス社（中国）から購入。4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインダール（DAPI）、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレート（DiI）、2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）、3-アミノ,4-アミノメチル-2',7'-ジフルオレセイン,ジアセテート（DAF-FM DA）とCCK-8はベヨタイムバイオテクノロジー社（重慶、中国）から購入。カルセイン-AM（CAM）とヨウ化プロピジウム（PI）はサンタクルーズバイオテクノロジー社（テキサス州、米国）から入手。アネキシンV-FITC/PIは南京キージェンバイオテック社（南京、中国）から入手。一重項酸素センサーグリーン（SOSG）はインビトロジェン社（ニューヨーク州、米国）から購入。

N₂O-mbsとC₃F₈-mbsの調製

N₂O-mbsは回転膜法と機械振動法の組み合わせで調製しました。DPPCとDSPE-PEG2000を殻材料、N₂Oをコアとして使用しました。簡潔に述べると、5 mg DPPC、2 mg DSPE-PEG2000、10 mLクロロホルムを丸底フラスクに同時に注入し、超音波で混合完全溶解しました。次に、回転蒸発器（60分、55℃、100 rpm）で脂質膜を形成しました。続いて、10%グリセリン2 mLを添加し脂質膜を水和し懸濁液を調製しました。このうち500 μLをカプセルチューブに移しました。カプセルチューブをゴムキャップで密封しました。チューブ内空気をガス置換装置でN₂OとC₃F₈に置換しました。次に、懸濁液を銀-水銀カプセルミキサー（YJT-2、上海医療機器社、中国）で150秒機械振動させました。最後に、差動遠心分離で目的のN₂O-mbsを得ました。300 rpmで5分、次に800 rpmで5分遠心分離しました。N₂O-mbsをPBSに再懸濁し、4℃で保存し後続実験に使用しました。

C₃F₈-mbsは前述と同じ機械振動法で作製しました[25]。DiI標識N₂O-mbsは回転膜形成時にDiIを添加して調製可能です。N₂Oは分子量が低く不安定なため、マイクロバブル内N₂Oは容易に流出し、マイクロバブル半減期が短くなります。C₃F₈は超音波マイクロバブル造影剤研究で広く用いられる高分子不活性ガスで、マイクロバブル安定性を向上させます。したがって本研究では、N₂OとC₃F₈（2:1）を混合してN₂O-mbsコアとし、安定性を向上させました。

N₂O-mbsの作製と性能検出

N₂O-mbsの形態と粒径分布を明視野光学顕微鏡で観察しました。N₂O-mbsとC₃F₈-mbs濃度を球数計で計算ガイドラインに従い算出しました。N₂O-mbsの平均粒子径とゼータ電位を動的光散乱システム（マルバーンインスツルメンツ社、イギリス）で測定しました。N₂O-mbsの構造と形態を透過電子顕微鏡（TEM、日立H-7600、日立製作所、東京、日本）で特性評価しました。調製N₂O-mbsを4℃で保存し、安定性観察のため1日目、2日目、3日目の形態と濃度を記録しました。同時に平均粒子径とゼータ電位を測定しました。

細胞培養と動物モデル

ヒト乳がん細胞（MDA-MB-231；金西克技術開発社、重慶、中国）を蘇生後3ヶ月未満で継代培養しました。5% CO₂、37℃インキュベーターで、10%胎仔牛血清、50 μg/Lストレプトマイシン、50 μg/Lペニシリン含有DMEMで維持しました。細胞コンフルエンス80%達した時点で実験に使用しました。

全動物実験は重慶医科大学動物倫理委員会ガイドラインに従って実施しました。4-6週齢、体重15-20 gの雌ヌードマウスを重慶医科大学動物実験センターから購入しました。固形腫瘍確立のため、MDA-MB-231細胞（1×10⁶ cells/mL）を生理食塩水（100 μL）に懸濁し、各マウス右背側側腹部に皮下注射しました。腫瘍体積が約150 mm³に達した時点で全腫瘍保有マウスを治療実験に使用しました。

N₂O-mbの細胞内取り込みと生体適合性評価

増殖期MDA-MB-231細胞を約1×10⁵ cells/well密度で共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）用フラスクに播種し24時間培養しました。次に、DiI標識N₂O-mbs完全培地希釈液100 μL（1×10⁵ bubbles/mL）を添加し共焦点ディッシュを培地で満たしました。ディッシュをマイクロプレートシーラーで密封し逆さまにしてインキュベーターに保管し、N₂O-mbsを細胞と接触させました。2時間と4時間共培養後、細胞をPBSで優しく3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド（PFA）で20分固定し、DAPIで20分染色しました。最後にCLSM（ニコンA1、日本）でN₂O-mbsの細胞標的化挙動を観察しました。

N₂O-mbsの細胞毒性を標準CCK-8アッセイで評価しました。MDA-MB-231細胞を96ウェルプレート（5×10⁴ cells/well）に播種し24時間培養しました。次に、異なる濃度（1×10⁴/mL、1×10⁵/mL、1×10⁶/mL）のN₂O-mb 100 μLを添加しました。24時間インキュベート後、CCK-8溶液（10 μL）を各ウェルに添加しました。さらに37℃で2時間培養しました。最後にバイオテックマイクロプレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、バーモント州ウィノスキ、米国）で450 nm吸光度を測定しました。

約20 gの健康雌ヌードマウス10匹を無作為に2群に分けました。N₂O-mbs群（n=5）にN₂O-mbs（200 μL、1×10⁵/mL）を静脈注射、対照群（n=5）に生理食塩水（200 μL）を注射しました。21日後、全マウスの主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）を摘出しヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色しました。

N₂O-mbsのin vitro SDT効率

酸素ラジカル検出法は先行報告[26]に基づきました。簡潔に述べると、500 μM SOSG 10 μLを検体溶液2 mLと混合しました。処理群は以下の通り：群C（ブランク対照群）、PBSのみ添加；N₂O-mbs群、PBS溶液2 mLにN₂O-mbs（1×10⁵/mL）100 μL添加；C₃F₈-mbs群、PBS溶液2 mLにC₃F₈-mbs（1×10⁵/mL）100 μL添加；LIFU群、PBSを超音波照射（2 W/cm²；重慶医科大学超音波画像研究所、重慶、中国）100秒；LIFU-N₂O-mbs群、添加N₂O-mbs PBSを超音波照射；LIFU-C₃F₈-mbs群、添加C₃F₈-mbs PBSを超音波照射。実験群処理パラメータは実験結果解析比較と文献[27, 28]参照により2 W/cm²、100秒に設定しました。治療目的の超音波パラメータ：周波数650 kHz、焦点距離12.5 mm、パルス波モード、デューティー比50%、パルス持続時間1秒。一重項酸素（¹O₂）生成を蛍光分光光度計（キャリーエクリプス、アジレントテクノロジーズ社）で蛍光強度（λ励起/λ蛍光=504 nm/525 nm）測定により決定しました。超音波強度と持続時間選択はin vitro細胞実験と一致させました。

N₂O-mbs超音波照射後の水溶液中細胞外ROS生成をSOSGアッセイで検出した後、DCFH-DAベースROSアッセイキットでN₂O-mbsによる細胞内ROS生成を検出しました。MDA-MB-231細胞を約1×10⁵ cells/well密度でCLSMフラスクに播種しました。その後、6群に無作為分配：対照群（無処理）、N₂O-mbsのみ群（100 μL、1×10⁵ bubbles/mL）、C₃F₈-mbsのみ群（100 μL、1×10⁵ bubbles/mL）、LIFUのみ群（2 W/cm²、100秒）、LIFU-C₃F₈-mbs群、LIFU-N₂O-mbs群。細胞付着のため24時間インキュベート後、各群に上記実験介入を実施しました。次に同量DCFH-DA（30 μM）を各群ディッシュに添加し、暗所で20分インキュベートしました。細胞をPBSで優しく3回洗浄し、細胞内に入らなかったDCFHプローブを除去しました。最後にCLSMで細胞内ROS生成を決定しました。N₂O-mbs SDT効率をさらに検証するため、細胞を6ウェルプレートに播種し24時間培養し、上記同様6群に無作為分配しました。次に各群で対応処理を実施しました。各群細胞を消化し適切濃度で細胞懸濁液調製しCLSMディッシュに移しました。最後にCAMとPI染色で死細胞（赤）と生細胞（緑）を区別しCLSMでスキャンしました。アポトーシスをフローサイトメトリーとアネキシンV-FITC/PI染色で検出しました。処理1時間後、各群細胞を遠心分離し回収。アネキシンV-FITC/PI共染色後、フローサイトメトリー（ベクトン・ディキンソン社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）で検出しました。

N₂O-mbsのin vitroソノダイナミック効果によるHIFU治療効率増強

HIFUシステム（JC200、HIFUテクノロジー社、重慶、中国）を使用しました。診断超音波ユニット、治療超音波ユニット、中央処理システムで構成されます[29]。治療目的のHIFUパラメータ：動作周波数0.94 MHz、焦点距離140 mm、径220 mm、リアルタイム診断トランスデューサー周波数3.5 MHz。統合トランスデューサーを脱気水に浸漬しました。N₂O-mbsのHIFU治療増強効果評価のため、MDA-MB-231細胞を遠心分離し5×10⁵/mL、4群に分配：対照群（無処理）、HIFUのみ群（125 W、5秒）、HIFU-N₂O-mbsのみ群、HIFU-C₃F₈-mbsのみ群。次に各群で異なる処理を実施しました。処理細胞を遠心分離しPBS洗浄、アネキシンV-FITC/PI二重染色しフローサイトメトリー用回収しました。一酸化窒素（NO）プローブDAF-FMで各処理群上清液中NOを検出しました。全実験を3回繰り返しました。処理細胞超微細構造形態をTEMで同定しました。各処理後、処理細胞を直ちに2% OsO₄で固定し、勾配アルコールで脱水し、Epon 812（エレクトロンマイクロスコピーサイエンス社、ペンシルベニア州フォートワシントン）で平坦包埋しました。超薄切片（100 nm）を作製し、酢酸ウランとクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡で観察しました。

N₂O-mbsのex vivoおよびin vivoソノダイナミック効果によるHIFUアブレーション効率増強

新鮮牛肝組織を地元屠殺場から購入し、屠殺後12時間以内に使用しました。結合組織が少なく血管の少ない新鮮ex vivo牛肝を10 cm×5 cm×5 cmに切片し、37℃で1時間脱気しました。牛肝を3群に分け：C₃F₈-mbs群、N₂O-mbs群、PBS群。まず、新鮮分離牛肝を脱気水入り容器に置きました。次に、図6a示す方法でマイクロバブルPBS懸濁液200 μL（1×10⁵ bubbles/mL）を牛肝に直接注射しました。診断超音波トランスデューサーガイド下でHIFU焦点を注射部位に位置合わせしました。次に、治療用トランスデューサーで牛肝注射部位に異なる出力（100 W、125 W、150 W）で5秒アブレーション実施しました。最後に、牛肝組織ターゲット領域の凝固壊死体積を測定した最大長、幅、深度（mm）から以下式で計算しました：V (mm³) = π/6 × 長さ × 幅 × 深度。さらに、各群のHIFUアブレーション前後ターゲット領域の診断超音波画像グレー値を記録しました。

腫瘍保有マウス20匹を無作為に4群（n=5/群）に分け：対照群（無処理）、HIFU-PBS群、HIFU-C₃F₈-mbs群、HIFU-N₂O-mbs群。マウスがC₃F₈-mbs、N₂O-mbs、PBS 200 μL静脈注射受けた後、HIFU（125 W、5秒）で腫瘍アブレーション実施。固形腫瘍HIFUアブレーション手順はex vivo分離牛肝と類似。まず、マウスを1%ペントバルビタール（8 mL/kg）で麻酔。マウス腫瘍部位を脱気水入り容器に浸漬。診断超音波トランスデューサーガイド下でHIFU焦点を腫瘍組織に位置合わせ。マウス体重と腫瘍体積を3日間隔で記録。最終的に全マウスを治療21日後に安楽死させ、腫瘍組織を摘出しH&E、PCNA染色、TUNEL実施しました。

統計解析

全データをGraphPad Prism（バージョン7、GraphPad Software Inc.、カリフォルニア州ラホヤ、米国）で提示・解析しました。データは平均±SDで表現。各実験を最低3回繰り返しました。統計解析は一元配置分散分析（ANOVA）にボンフェローニ事後検定（全群比較）またはダネット事後検定（全群を対照群と比較）で実施。p<0.05を統計的有意としました。

結果

N₂O-mbsの特性評価

改良機械振動法によるN₂O-mbs調製で高安定性乳白色懸濁液が得られました（図1a）。N₂O-mbsは室温72時間保存後、粒子径と形態に有意変化なし。光学顕微鏡下で均一サイズ、良好分散、高安定性観察（図1b）。N₂O-mbs濃度は5.12±0.45×10⁸ bubbles/mL。TEM画像（図1c）ではN₂O-mbsサイズ均一分布、平均サイズ約450 nm。動的光散乱結果で動的直径458.1±17.26 nm（ポリ分散性指数=0.368；図1d）、TEM結果と一致。N₂O-mbsゼータ電位-16.2±0.35 mV（図1e）（追加ファイル1: Figure S1）。

N₂O-mbsの細胞内取り込みと生体適合性

N₂O-mbsのin vitro細胞毒性をCCK-8法で調査。対照群細胞生存率を100%と定義。24時間インキュベート後、細胞生存率結果はMDA-MB-231細胞に有意な細胞毒性なし。高濃度N₂O-mbでも細胞生存率95%以上維持（図2a）。健康ヌードマウスでのin vivo N₂O-mbs細胞毒性解析。図2b示す通り、主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）病理組織解析でN₂O-mbsはマウスに有意な毒性損傷なし。これら結果はN₂O-mbsの高い生体適合性を示します。

長時間インキュベーション（2時間、4時間）でのN₂O-mbs細胞内取り込みをCLSMで可視化。DiI標識N₂O-mbsと細胞共培養で、癌細胞膜と細胞質に大量N₂O-mbs蓄積。図2c示す通り、赤色蛍光N₂O-mbsと青色蛍光細胞の良好な共局在化観察。この所見はN₂O-mbsがMDA-MB-231癌細胞に効率的に内部化されることを示唆します。

N₂O-mbsのin vitroソノダイナミック効果

SOSGは高感度・高信頼性一重項酸素検出プローブとして酸素フリーラジカル生成検出に広く用いられます[30, 31]。N₂O-mbsのソノセンシタイザーとしての可能性探索のため、SOSGでin vitro ROS生成検出。SOSGは¹O₂と結合しSOSG-EP形成、蛍光強度増加で特徴付けられます。図3a示す通り、N₂O-mbs含有SOSG溶液超音波照射後、蛍光強度値有意増加；他群と比較し酸素フリーラジカル生成有意増加（p<0.01）。

N₂O-mbs超音波照射後水溶液中ROS生成検出に加え、DCFH-DA ROSアッセイキットでN₂O-mbsによる細胞内ROS生成決定。図3bで陽性対照群が最強蛍光強度。次に強い緑色蛍光信号はLIFU-N₂O-mbs群のみ出現、N₂O-mbsとLIFU照射同時存在下でのROS顕著生成を示唆。他群では明らかな蛍光検出なし（図3c）。対照群細胞生存率100%定義。CCK-8アッセイ結果でLIFU-N₂O-mbs群約46%細胞死（図3d）。CLSMでCAM/PI共染色後細胞死観察しN₂O-mbs+LIFU細胞毒性評価。CAMで生細胞緑色蛍光、PIで死細胞赤色蛍光染色。図4a示す通りLIFU-N₂O-mbs群に多数死細胞。さらにフローサイトメトリーでLIFU-N₂O-mbs併用処理後MDA-MB-231細胞群アポトーシス率他群より有意高値（p<0.05）（図4b）。C₃F₈-mbs+LIFU併用で明らかな細胞死・アポトーシス誘導なし。結果はSDTに応じ広範囲アポトーシスと壊死発生示唆。フローサイトメトリー結果はCLSMと一致。これら結果はN₂O-mbs+LIFU併用がin vitroで腫瘍細胞アポトーシス誘導示す（追加ファイル2: Figure S2; 追加ファイル3: Figure S3）。

がん細胞におけるin vitro HIFU相乗効果評価

フローサイトメトリー結果を図5a示す。N₂O-mbsとC₃F₈-mbs両方ともHIFUアブレーション後MDA-MB-231細胞死亡率増加。さらにHIFU-C₃F₈-mbsと比較しN₂O-mbsがMDA-MB-231アポトーシス有意増加（p<0.05；図5b）。NO検定結果でHIFU-N₂O-mbs群上清液蛍光強度も他群より有意高値（p<0.05）（図5c）。細胞質と細胞小器官変化をTEM観察（図5d）。対照群（無処理）細胞は完全形態。HIFU群細胞質に大量空胞性物質だが細胞膜と核膜完全。一方HIFU-N₂O-mbs群とHIFU-C₃F₈-mbs群両方で細胞膜完全性喪失と細胞構造完全崩壊観察。TEM観察は各群処理後細胞死・アポトーシス過程の瞬間のみ。N₂O-mbsは外因性マイクロバブルとしてHIFU治療に明確な相乗効果。HIFU-N₂O-mbs群ではN₂O-mbsソノダイナミック効果が更多くの細胞アポトーシス促進。結果はフローサイトメトリー検出とin vivo実験で検証済み（追加ファイル4: Figure S4; 追加ファイル5: Figure S5）。

HIFU療法の相乗剤としてのN₂O-mbs

分離牛肝HIFUアブレーション後、ターゲット領域に灰白色凝固壊死領域出現（図6b）。HIFU前後ターゲット領域平均エコー強度変化を図6c示す。PBS群と比較し、C₃F₈-mbs群とN₂O-mbs群ターゲットエコー強度値がHIFU治療後有意増加（p<0.05）し、HIFUアブレーション出力増加とともに増大。後者2群凝固壊死体積とBモード超音波画像ターゲット領域エコー強度両方HIFU出力増加とともに増大（図6d, e）。

N₂O-mbsのHIFU療法相乗効果をin vivoでさらに検証。図7a示す通り、異なる治療21日後マウスデジタル写真と対応腫瘍組織記録。N₂O-mbs+HIFU併用治療後腫瘍増殖更効果的に抑制。N₂O-mbsのHIFU治療相乗効果をH&E、PCNA、TUNEL染色で評価（図7b）、N₂O-mbs+HIFU照射がHIFU-C₃F₈-mbs群比較でより大規模腫瘍細胞壊死誘導示す。HIFU-N₂O-mbs群細胞形態変化他群より顕著、核縮小、核崩壊、核溶解含み、癌細胞実質的壊死示唆。

さらに、HIFU-N₂O-mbs腫瘍体積が21日間でHIFU-C₃F₈-mbsより有意抑制傾向示す（図7c, d）。

考察

HIFUは腫瘍学新手法として臨床認知され、多くの固形腫瘍治療で顕著進歩達成[32]。熱効果、空洞効果、機械効果、音響化学効果がHIFUアブレーション中腫瘍細胞殺傷とターゲット領域組織不可逆損傷に重要役割[33]。HIFUは周囲正常組織へ影響限定的で本質的に非侵襲的腫瘍治療。しかし、超音波携帯エネルギーは伝播距離増大、ターゲット領域血流吸収、体内骨やガス遮蔽により減衰し、ターゲット領域伝達エネルギー減少。しかしアブレーション時間延長と治療出力増加は皮膚熱傷、神経血管損傷など正常組織損傷リスク増大[34]。したがってHIFU効率向上必要。多く研究がマイクロバブルとSDT両方ともHIFU効率向上確認[15, 16, 35]。本研究調製N₂O負荷マイクロバブルは粒子径小さいが超音波マイクロバブル造影剤と類似特性。ナノ/マイクロバブルはin vitroでマイクロバブルと同等画像能力、in vivoでより高能力持つ研究[36]。したがってN₂O-mbsはHIFU治療超音波ガイダンス・局在化用いるだけでなく、外因性マイクロバブルとしてHIFU効率増強可能（追加ファイル6: Figure S6）。同時にN₂O-mbsソノダイナミック効果がHIFU効率効果的向上。超音波励起後ROS生成はソノセンシタイザー最重要因子一つ[16]。N₂O-mbsソノセンシタイザー感受性検証のため、本研究で細胞外・細胞内環境両方でROS生成検出。両試験一貫結果でN₂O-mbsが水溶液中と細胞内両方でROS生成可能示す。溶液中空洞核捕捉ガス（N₂、O₂）が切断反応起こしNとOフリーラジカル生成する研究[37, 38]：

N₂O → N₂ + O₂, O₂ → 2•O, N₂ → 2N• + HO• → NO + H•, NO + HO• → HNO

空洞効果とマイクロバブル包装利点がN₂O反応難易度低下[39]。細胞と共培養時N₂O-mbs良好生体適合性示す。ナノ粒子の高選択性、高親和性、高薬物担持[40]、細胞能動的貪食がN₂O-mbs癌細胞効率的結合促進。ナノバブルは浸透性、安定性、細胞侵入・凝集容易性増加[36]。さらに超音波ソノポレーション効果がマイクロバブル細胞内移行効果的促進[41]。

従来型マイクロバブル造影剤C₃F₈-mbsと対比し、N₂O-mbsは超音波照射後細胞増殖抑制効果大、細胞内ROS増加、細胞生存率低下、アポトーシス・壊死増大で特徴付け。これら結果はN₂O-mbsソノダイナミック毒性効果を予備的示唆。

HIFU相乗実験で実験群処理パラメータ125 W、5秒に設定、実験結果解析比較と文献参照により検証、低HIFU出力でも十分アブレーション効果誘導し副作用低減可能。結果N₂O-mbsが更多く腫瘍細胞壊死増加とアポトーシス進行誘導示す。N₂O-mbsはナノスケールマイクロバブル相乗剤として作用、HIFU応答ソノダイナミック効果が実験結果差理由と推測。マイクロバブルとしてN₂O-mbsはターゲット領域HIFUエネルギー堆積増加、ターゲット領域温度上昇、HIFU治療熱効果増強[11]。空洞効果生成は空洞閾値と空洞核濃度密接関連[42]。N₂O-mbsは空洞核としてHIFU空洞閾値低下、空洞効果促進。したがってN₂O-mbs効果的細胞壊死促進。ナノスケールマイクロバブル相乗剤としてN₂O-mbsは超音波応答で溶解しフリーラジカルと窒素酸化物生成。ROSがアポトーシス誘導重要因子確認[43]。多種フリーラジカルが細胞損傷引起こす注目。酸素ラジカル生成に加え、N₂Oは切断反応で窒素フリーラジカル等他タイプフリーラジカル生成可能、腫瘍細胞殺傷寄与。HIFU治療後細胞上清液で少量一酸化窒素（NO）生成検出、N₂O切断反応発生さらに示唆。Anら[44]報告NO抗腫瘍機能、機序はNO疑似鉄酵素攻撃し細胞成長分裂不能誘導。不安定NOが酸素分子と相互作用しヒドロキシルラジカル（HO•）とNO₂形成。ヒドロキシルラジカル極めて細胞毒性強く腫瘍細胞アポトーシス促進。NOは血管内皮由来弛緩因子。NO生成がHIFU手術中患者高血流と異常腫脹理由可能性。分離牛肝実験でN₂O-mbs、C₃F₈-mbs、PBS存在下HIFUアブレーション後Bモード超音波画像エコー強度、病理変化、ターゲット領域凝固壊死体積慎重比較。全結果一貫。PBS比較でN₂O-mbs効果的HIFUアブレーション効果増強。相乗効果はin vivo固形腫瘍アブレーションでより良好実証、腫瘍細胞アポトーシス増加、腫瘍体積減少、腫瘍増殖抑制で顕在。この知見はN₂O-mbsがHIFU熱腫瘍アブレーション促進新規超音波補助剤となり得ることさらに示唆。HIFUにおけるN₂O-mbs相乗効果と相乗メカニズムがHIFU相乗剤研究に新アイデアと理論実践提供。しかし他関連相乗メカニズム更探索必要。N₂O-mbs併用HIFU腫瘍アブレーション効果更検討必要。

結論

まとめると、N₂O-mbナノ粒子を開発しました。N₂O-mbs特性評価と生体適合性決定。水溶液中と細胞内ROS生成検出でN₂O-mbsソノセンシタイザー感受性検証。C₃F₈-mbsと比較しN₂O-mbsはROS生成し腫瘍細胞アポトーシス・壊死促進、並外れたソノセンシタイザー感受性示す。HIFU相乗実験でN₂O-mbsソノダイナミック効果がin vitro腫瘍細胞アポトーシス・壊死有意増加、ex vivo分離牛肝ターゲット領域凝固壊死体積とエコー強度増大、in vivo腫瘍増殖効果的抑制。これら結果はN₂O-mbsが新型ソノセンシタイザーであり、HIFUによる腫瘍アブレーションに使用できる新規超音波治療補助剤となり得ることを示唆。

略語

N₂O-mbs:

N₂Oマイクロバブル

C₃F₈-mbs:

C₃F₈マイクロバブル

HIFU:

高強度集束超音波

LIFU:

低強度集束超音波

SOSG:

一重項酸素センサーグリーン

SDT:

ソノダイナミック療法

DPPC:

1,2-ジヘキサデカノイル-rac-グリセロ-3-ホスホコリン

DSPE-mPEG2000:

1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]

DAPI:

4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインダール

DiI:

1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレート

DCFH-DA:

2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート

DAF-FM:

3-アミノ,4-アミノメチル-2',7'-ジフルオレセイン,ジアセテート

CAM:

カルセイン-AM

CCK-8:

セルカウンティングキット-8

CLSM:

共焦点レーザー走査顕微鏡

TEM:

透過電子顕微鏡

DMEM:

ダルベッコ変法イーグル培地

FBS:

胎仔牛血清

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水

DI:

脱イオン水

ROI:

関心領域

ROS:

反応性酸素種

NO:

一酸化窒素