酸化チタン検知面での頭頸部がんのナノ検出

要約

頭頸部がんは、喉頭（ボイスボックス）、口、咽頭（喉）、鼻腔、唾液腺の内側を覆う扁平上皮細胞に発生する不均一な疾患です。後期の頭頸部がんの診断は、患者の生存率に大きく影響します。適切なバイオマーカーを使用して、発生の初期段階でこの癌を特定することは必須の状況になります。扁平上皮癌抗原（SCC-Ag）は循環血清腫瘍バイオマーカーであり、頭頸部癌患者でレベルの上昇が見られ、腫瘍体積と高い相関があります。本研究は、酸化チタン（TiO ₂）上のSCC-Agのレベルを検出および定量化するために実施されました。）-SCC-Ag抗体による修飾されたインターデジタル電極センサー（IDE）。 SCC-Agの検出は100fMのレベルで検出されましたが、抗体が金ナノスターと結合すると10 fMに改善され、10倍の改善を示しました。興味深いことに、この感度の向上は、他の基板よりも1000倍高くなっています。さらに、2つの異なるコントロールタンパク質を使用して特異性分析を行ったところ、抗体がSCC-Agのみを認識し、IDE-TiO ₂での特異的検出を示していることがわかりました。検出面。

はじめに

頭頸部がんは、頭頸部の領域で異常な細胞増殖を示し、広く報告されています。これは、喉、口、粘膜、口腔の上皮、唾液腺、および鼻腔に由来します[1]。世界で6番目に多く報告されている癌です。毎年644,000人以上に影響を及ぼしています[2]。影響を受けた患者のほとんどは、進行した段階で診断され、彼らの生存に大きな影響を与えます。頭頸部がんの早期発見は、生存率とライフスタイルを改善するために必須です。血清学的腫瘍マーカーは、頭頸部がんのフォローアップ治療を診断および管理するために使用されてきました。扁平上皮細胞は優勢な扁平上皮癌抗原（SCC-Ag）を放出し、その存在は癌患者で上昇し、SCC-Agは、婦人科癌、肺癌、食道癌、肛門癌などの扁平上皮細胞関連癌の有望な腫瘍マーカーであることが示されています[3、4]。頭頸部がんを考慮すると、がん患者を対象としたさまざまな研究で証明されているように、高レベルのSCC-Agは、疾患の転移、再発、および死亡率と関連しています[5、6、7]。研究者は、血清SCC-Agが下咽頭、口腔および喉頭の癌の重大なリスクレベルにあることを発見しました[8、9]。さらに、頭頸部がん患者のSCC-Agレベルと腫瘍体積の間には相関関係がありました[10]。早期の治療を提供するために、頭頸部がんの状態を特定するためにSCC-Agのレベルを定量化することが賢明です。現在の研究は、SCC-Ag抗体によるインターデジタル電極（IDE）センサー上のナノ粒子を使用して、より低いレベルでSCC-Agを検出することに焦点を当てていました。

IDEは、低コスト、ポータブル、高感度などの有望な機能を備えた電気化学バイオセンサーであり、特に環境モニタリングや医療診断など、幅広いアプリケーションに対応します[11、12]。検出面の電気的特性を強化すると、生体分子の検出が向上します。ナノマテリアルアプリケーションは、センシング表面での生体分子検出を強化するためにバイオセンサーで広く使用されています。ナノ材料は、サイズが小さく、表面積が大きく、熱伝導率と電気伝導率が高く、生体分子と互換性があり、バイオセンサーの分野で適用できる驚異的な能力を示します[13、14]。ナノマテリアルは、目的のために2つの異なる方法で適用されています。1つは表面機能化であり、もう1つは検出を改善するために分析物またはターゲットを結合することです[15]。金は定評のあるナノ材料の1つであり、表面プラズモン共鳴、導波路モードセンサー、電気化学センサー、測色などのさまざまなセンサーに適用されています[16、17、18]。それとは別に、銀、グラフェン、銅、チタンのナノ材料もさまざまな生物医学的用途に応用されました。環境にやさしい半導体であり、低コストの酸化チタン（TiO ₂ ）は、SCC-Agを検出するためのIDEの表面改質にここで利用される広いバンドギャップを持っています。 TiO ₂の高い電気的および光学的特性のため、それは超容量の目的、光触媒および光電変換に広く使用されています[19、20、21、22、23]。さらに、その親水性とより大きな表面積の性質は、表面修飾に適しており、より低いレベルで生体分子を検出するのに役立ちます。この調査では、TiO ₂ 生体分子の相互作用が起こっているときの電気の流れを強化するために、IDEセンシング表面にコーティングされました。 SCC-Agの検出を改善するために、抗体を金ナノスター（GNS抗体）と結合させ、TiO ₂に固定化しました。 -コーティングされた表面。金ナノ材料結合生体分子はより高い安定性を示し、適切に配向された表面固定化生体分子を提供することが証明されているため、検出限界を改善する能力があります[24、25]。さらに、より多くの生体分子を単一の金粒子に固定化することができ、これにより、標的分子のレベルが上昇します。この研究では、2つの異なるナノ材料、すなわちTiO ₂ （表面修飾用）およびGNS（抗体結合用）を使用して、IDEセンシング表面でのSCC-Agの検出を改善しました。 GNSのアプリケーションは、より多くの抗体を捕捉するために、より大きな表面によって電流センサーのパフォーマンスを向上させることが期待されています。

材料と方法

試薬と生体分子

SCC抗原（45〜55 kDaのアイソフォームを持つ糖タンパク質）は、Randox Life Sciences（マレーシア）から購入しました。抗SCC抗体はNextGene（マレーシア）から調達しました。（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）、エタノールアミン、アルブミン（45 mg / mLの主要な血液タンパク質、分子量66.5 kDaの血液タンパク質の50〜70％）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）チタンIVイソプロポキシドはSigmaAldrich（USA）から入手しました。セルピン（分子量40〜50 kDaの一般的に分布するセリンプロテアーゼ阻害剤）は、Sino Biological（中国）から入手しました。金ナノスターは、Shanらによって説明されているように合成されました。 [26]。得られた試薬と化学薬品はすべて、メーカーの推奨する場所に保管されていました。

インターデジタル電極の製造

IDEの基本的な設計と製造は、以前に報告されたように行われました[27]。最初に、シリコンウェーハは標準的な洗浄液で洗浄され、アルミニウムIDE電極は従来のウェットエッチング法でシリコンウェーハ上に堆積されました。次に、ポジ型フォトレジストをシリコンウェーハの表面に堆積させ、続いて熱酸化を行った。アルミニウムの堆積は、フォトリソグラフィー技術によって行われた。 3つのステップが含まれ、ステップ1は1200 rpmで10秒間、ステップ2は3500 rpmで20秒間、続いて500rpmで10秒間でした。次に、紫外線（UV）を検出面に露光して、IDEのパターンをサンプル面に転写しました。その後、RD-6現像液を15秒間使用して現像プロセスを実行しました。未露光領域を除去するために写真抵抗が行われました。現像したサンプルを100℃でベークし、不要な水分を取り除き、SiO ₂間の密着性を向上させました。層とアルミニウム。最後に、23秒間のアルミニウムエッチャントを使用して、未露光領域を除去し、アセトンで洗浄しました。最終的な表面は、TiO ₂によって変更されました SCC-Agを検出します。作製したIDE表面を高倍率顕微鏡と3Dナノプロファイラーで観察しました。画像は、関連するシステムを使用して×50の倍率でキャプチャされました。

TiOのコーティング₂ IDEセンシングサーフェス上

製造されたIDE表面では、TiO ₂ 溶液をコーティングし、チタンIVイソプロポキシドを前駆体として使用してTiO ₂の溶液を調製しました。。そのために、エタノールをチタンIVイソプロポキシドと混合し、5分間激しく撹拌しました。次に、安定剤（100μLの酢酸）を攪拌条件下で滴下し、85℃のホットプレート上で加熱しました。モル比混合物を9：1：0.1（エタノール対TIP対酢酸）に固定した。 3時間混合した後、透明な溶液が得られました。 24時間のエージングプロセスで、溶液を二酸化ケイ素（SiO ₂ ）2000rpmの速度でスピンコーターを使用して基板。コーティング後、表面を175°Cの温度で15分間乾燥し、450°Cで1時間アニーリングしました。 TiO ₂ 薄膜は3層コーティングした後、十分な厚さになります。

GNS結合抗SCC-Agの調製

SCC-Ag抗体は、リンカー16-メルカプトウンデカン酸（16-MDA）を使用してGNSに固定化されました。最初に、5 mMの希釈16-MDAを100μLのGNSと混合し、室温（RT）で30分間保持しました。 GNSと結合した16-MDAは、13,000× g での遠心分離によって除去されました。、 5分。次に、収集した金ペレットをEDC（400 mM）とNHS（50 mM）で、室温で15分間インキュベートすることにより、1：1の比率で活性化しました。溶液混合物からの未結合のEDCおよびNHSは、13,000× g での遠心分離によって除去されました。、 5分。活性化されたGNSを含むペレットを収集して抗体を結合させた。続いて、200 nMのSCC-Ag抗体をEDC-NHSで活性化されたGNSと混合し、RTで1時間維持しました。最後に、13,000× g での遠心分離により未結合の抗体を除去しました。、 5分。 GNSとの結合抗体は、さらに使用するために4°Cに保たれ、結合はUV-Vis分光スキャンによって確認されました。スキャンは480〜560 nMの領域で実行され、ピークの最大値が見つかりました。

TiO上のGNS抗体への固定化₂ -IDEサーフェス

TiO ₂ コーティングされたIDE表面は、GNS抗体を固定化するために、APTESによってさらにアミンに修飾されました。 3％（30％エタノールで希釈）のAPTESをTiO ₂に滴下しました。表面を形成し、RTで3時間保持しました。表面を30％エタノールで3回洗浄し、未結合のAPTESを除去しました。抗体を固定化するために、活性化ステップが上記のように続いた。抗体またはGNS抗体を表面に滴下し、1時間待って固定化プロセスを完了しました。最後に、表面をPBSバッファーで5回洗浄して、結合していない抗体を完全に除去しました。これらの抗体またはGNS抗体で修飾された表面を使用して、SCC-Agを検出し、比較しました。 GNS抗体で固定化されたTiO ₂ 表面は、前述のように、原子間力顕微鏡（AFM）、電界放出型透過型電子顕微鏡（FETEM）、およびエネルギー分散型X線（EDX）分析装置によって分析されました[15]。 AFM観察は5μmスケールでしたが、SEMは15kVで動作する100nMスケールでした。要素の存在はEDXによって発見されました。

抗体/ゴールドナノスター抗体表面でのSCC抗原の検出

SCC-Ag、抗体、または金ナノスター抗体で修飾されたTiO ₂を検出するには -IDE表面を1Mエタノールアミンでブロックして抗体のない表面領域をマスクし、RTで30分間保持しました。エタノールアミンでブロックされた表面では、1 nMのSCC-Agが相互作用し、SCC-Agの添加の前後で電流応答が認められました。検出限界を評価するために、SCC-Agを10fMから1nMまで滴定し、抗体またはGNS抗体で修飾された表面に個別に滴下し、電流による応答を記録しました。実験は3回行い、統計を計算しました。測定には、0.01 Vのステップ電圧で0〜2Vの線形掃引電圧を追跡しました。検出限界（LOD）は、バックグラウンドシグナル（ S ）に対する（低濃度の検量線からの）分析物の最低濃度と見なされました。 / N =3：1）、言い換えると、LOD =ベースラインの標準偏差+3 σ 。

SCC-Agの選択的検出

SCC-Agとその抗体との選択的相互作用を確認するために、2つの異なるタンパク質、すなわちセルピンとアルブミンを使用して対照実験を実施しました。これらのコントロールタンパク質の1nM濃度を抗体またはGNS抗体修飾表面に滴下し、相互作用の前後で電流の変化に気づきました。これらの電流レベルは、その抗体およびGNS抗体によるSCC-Agの特異的検出と比較されました。他の対照実験のセットアップには、SCC-AgとGNSのみの相互作用、およびSCC-AgとTiO ₂の相互作用が含まれます。 -非免疫抗体標識GNSでコーティングされたIDE表面。実験は3回行い、統計を計算しました。測定には、0.01 Vのステップ電圧で0〜2Vの線形掃引電圧を追跡しました。

結果と考察

頭頸部がんは、鼻、口、喉頭、副鼻腔内またはその周辺にさまざまな腫瘍が発生することが報告されています[28]。患者の生存率を向上させるには、適切なバイオマーカーによる早期診断と治療が必須です。 SCC-Agは、頭頸部がんに適した血清バイオマーカーとして発見されました。ここでは、実験は、TiO ₂上のSCC-Agのレベルを検出および定量化するために実施されました。 -その抗体によって変更されたインターデジタル電極（IDE）センサー。 TiO ₂ ここでは、生体分子の相互作用中の電流応答を改善するために使用されます。他のナノ材料と比較して、TiO ₂ 電極に沿った表面でのアクティブな動作と電極触媒活性の向上により、電気化学センサーでは魅力的であると考えられています。さらに、表面の安定性が高まり、電極による応答の再現性が得られ、ピーク電流が増加することで検出限界が向上します[29、30、31]。このポジティブな特徴を利用するために、この研究では、コーティングされたTiO ₂ IDE表面（IDE-TiO ₂ ）電流の流れを改善します。別のナノマテリアルGNSを使用して、IDE-TiO ₂に抗SCC-Ag抗体を固定化しました。表面と削除の制限を強化します。金結合生体分子固定化表面が標的の検出を改善することが証明されているため[32、33]、ここでは、SCC-Agを検出し、抗体およびGNS抗体で修飾されたIDE-TiO _{2 > 表面。他の場所で一般化されているように、ナノ粒子の表面積が増加すると、生体分子の付着が強化されます。この文脈では、GNSは球状の金ナノ粒子と比較してより大きな表面を持っています。このアイデアを実装するために、現在の実験は感度を高めるためにGNSを使用して実行されました。}

表面の特性評価とGNS抗体の固定化

図1は、IDE-TiO ₂でSCC-Agを検出する概略図を示しています。センシング面。図1aに示すように、最初はIDEの検出面がTiO ₂でコーティングされていました。次に、GNSコンジュゲーションの有無にかかわらず抗体を固定化しました。これらの抗体修飾表面は、SCC-Agのレベルを検出するために使用されました。検出を行う前に、GNSと抗体の結合をUV-Vis分光法で確認しました。抗体との結合の前後の所望の波長範囲でのGNSスキャンプロファイルが決定された。固定化後、シフトが535から545 nMに移動したことがはっきりとわかりました（図1b）。この結果は、GNSの表面での抗体の結合を確認します。一方、作製したセンシング面は形態学的に観察された。図2aは高倍率の顕微鏡画像を示し、図2bは3Dナノプロファイラーイメージングからキャプチャされた画像を示しています。両方のイメージングプロファイルは、指を形成するギャップと電極領域で明確に示されています。隙間と指の配置は均一で無傷のようでした。

抗体とGNS抗体固定化TiO ₂の比較 -IDEセンシングサーフェス

SCC-AgがTiO ₂で検出されました -抗体またはGNS抗体で固定化された表面によるIDE表面。 TiO ₂へのGNSのアタッチメント表面は、AFM、SEM観察、およびEDX分析によって確認されました（図2c）。 AFMの観察では、TiO ₂の間に明確な区別が見られました。それぞれダークスポットとブライトスポットによるGNS。これは、SEMおよびEDX分析によって裏付けられ、顕著な金と中程度のチタンのピークが観察されました。これらの結果は、TiO ₂でのGNSの発生を証明しています。水面。図3は、アミン修飾IDE-TiO ₂への抗体とGNS抗体の固定化プロセスを示しています。センシングサーフェス。 TiO ₂ 変更されたIDEセンシングサーフェスは、現在のレベルを4.65E-12として表示します（図3a）。 APTESを追加した後、現在のレベルは5.37E-11に増加しました。この電流の増加は、表面がAPTESによってアミンに修飾されたことを示しています。抗体が固定化されると、電流レベルは5.375E-11から1.05E-9に変更されました。電流の違いは1.04E-9として認識されました（図3a）。この固定化は、抗体のAPTESのアミン基とCOOH基の化学的相互作用が原因で発生しました[18]。電流の変化により、APTES修飾表面への抗体の結合が確認されました。その後、残りの表面を1 Mエタノールアミンで覆い、検出表面での生体分子の非特異的結合による生物付着の影響を低減しました。同様に、GNS抗体はTiO ₂に固定化されました -IDE表面、およびGNS抗体がAPTES修飾表面に固定化された場合、電流レベルは4.41E-12から1.23E-9に増加しました（図3b）。抗体をGNS表面に固定化すると、アミン修飾表面でより高い応答を示すことが明確にわかりました。これは、単一のGNSの表面に結合する抗体の数が多いことと、アミン修飾表面にこの複合体が強く結合していることが原因である可能性があります。この結合は、APTESのアミノ末端基がGNSのクエン酸基を置換し、APTESで修飾されたIDE表面に化学的に固定されているために発生しました[34]。検知面での生体分子の検出は、主に2つの要因、すなわち、相互作用分子の結合親和性と検知面での分子の適切な表面固定化に依存することはよく知られています。センシング表面への生体分子の固定化が進むと、ターゲットの低レベルでの検出が大幅に向上しました。この研究では、GNSを使用して抗SCC-Ag抗体をIDE-TiO ₂に固定化しました。より高い抗体結合の可能性を高めるために表面を形成し、効率的なSCC-Ag検出を導きます。

IDE-TiO ₂でのSCC-Agの比較検出抗体またはGNS抗体による表面

抗体GNSはIDE-TiO ₂への効率的な固定化を示すため表面では、同様の1 nM濃度のSCC-Agが抗体表面とGNS抗体表面の両方で検出され、電流レベルの変化を比較しました。図4aは、抗体修飾表面での1nMのSCC-Ag検出を示しています。検出を行う前に、生体分子の非特異的結合を避けるために、抗体修飾表面をブロッキング剤エタノールアミンで覆った。エタノールアミンは4.65E-12として電流変化を示します。 1 nMのSCC-Agを追加した後、現在のレベルは1.33E-09に増加しました。これらの現在の変化は、SCC-Agがその抗体に結合していることを明確に示しています。 GNS抗体表面の場合、エタノールアミンは1.33E-11として電流レベルを示します。 1 nMのSCC-Agを追加した後、1.62E-09に増加しました（図4b）。 GNS抗体による現在の変化は、同様の濃度のSCC-Agの抗体修飾表面のみと比較して高かった。これは、IDE-TiO ₂に結合している抗体の数が多いことが原因である可能性があります。 GNSを介して表面化します。

IDE-TiO ₂でのSCC-Agの検出限界抗体またはGNS抗体による表面

抗体またはGNS抗体で修飾された表面は、SCC-Agの明確な検出を示し、検出限界は比較のために両方の表面で推定されました（図5a、b）。そのために、10fMから1nMのSCC-Agの濃度を希釈し、これらの表面に個別に滴下し、電流の変化を記録しました。図5aは、抗体修飾表面に結合するSCC-Agのさまざまな濃度を示しています。エタノールアミンの後、10 fMのSCC-Agが相互作用し、現在の変化は認められませんでした。濃度を100fMに上げると、電流が4.65E-12から6.54E-11にわずかに変化しました。さらに、濃度は1 pM、10 pM、100 pM、1 nMに増加し、電流レベルはそれぞれ4.69E-10、7.91E-10、8.78E-10、1.33E-09に増加しました。これらの結果は、濃度の増加に伴い、結合も増加していることを明確に示しています。検出限界は3 σに基づいて計算されました、100 fMでした（図6a）。

同じ濃度のSCC-Agは、GNS抗体で修飾された表面で独立して相互作用しました。 10 fMのSCC-Agを表面に滴下すると、電流が1.33E-11から3.74E-11に明らかに変化しました。この結果は、10 fMのSCC-Agでさえ、GNS抗体が固定化された表面と明確に相互作用できることを示しています。これは、抗体のみの場合では検出できません。さらに、濃度が100 fM、1 pM、10 pM、100 pM、および1 nMに増加すると、電流レベルはさらに4.69E-10、9.23E-10、1.41E-09、1.48E-09、およびそれぞれ1.62E-09（図5b）。標準偏差を使用した統計計算は、±0.1〜0.15×10 ^-9 の範囲です。 A.上記の2つの表面での検知と比較すると、GNS抗体で修飾された表面は、テストしたSCC-Agのすべての濃度で電流の変化が大きいことを示しています（図6b）。 3 σに基づく、検出限界は10 fMであることがわかります（図6a）。これは、抗体で修飾された表面のみに比べて10倍優れた（低い）検出です。標準偏差を使用した統計計算は、±0.1〜0.15×10 ^-9 の範囲です。 A.以前は、SCC-Agは、ストロンチウムナノ粒子やグラフェンなどのさまざまなナノ材料で評価されていました。ただし、これらの表面は、現在の研究[35]と比較して約1000分の1の感度を示しました。

抗体/ GNS抗体修飾表面でのSCC-Agの選択的検出

SCC-Agの選択的検出を、血流に豊富に含まれる2つのコントロールタンパク質、すなわちセルピンとアルブミンと比較しました。セルピンは、さまざまな人間の生理学的機能と生物学的プロセスを実行するプロテアーゼ阻害剤ですが、アルブミンは45 mg mL ^-1 を占めます。血清の50〜70％に寄与します。図に示すように、これら2つのコントロールタンパク質とSCC-Agの1 nM濃度を、表面抗体またはGNS抗体に個別に滴下しました（図7a）。現在の変化は両方の場合でSCC-Agでのみ認められ、抗体がSCC-Agのみを認識できることを示していることがはっきりとわかりました。対照タンパク質の相互作用による現在の変化に気づいた有意な変化はありません。この実験は、現在の実験装置がSCC-Agを特異的に検出/診断できることを確認しています。 SCC-AgとGNSのみ、およびSCC-AgとTiO ₂の相互作用による他の対照実験によって、さらなるサポートが提供されました。 -非免疫抗体標識GNSでコーティングされたIDE表面。特定のインタラクションと比較して、現在通知されているものに大きな変化はありませんでした（図7b）。

結論

頭頸部がんは、口、喉、唾液腺の領域に影響を与える一般的ながんです。適切なバイオマーカーで頭頸部がんを診断することは、患者に必要な治療を施し、患者のライフスタイルを改善するために必須です。 SCC-Agは、癌の重要なバイオマーカーの1つであることがわかっています。ここで、SCC-Agは、酸化チタンでコーティングされた交互に配置された電極検出表面（IDE-TiO ₂ ）。 SCC-Agの抗体はIDE-TiO ₂に固定化されました表面およびSCC-Agを検出しました。検出限界は100fMであり、抗体を金ナノスター（GNS抗体）と結合させることにより、検出限界をさらに高めることができました。検出限界が10倍（10 fMまで）改善されました。これは、アミン修飾TiO ₂に結合した抗体の数が多いことが原因である可能性があります。 GNSを介して表面。さらに、対照実験は2つの異なるタンパク質で実施され、抗SCC-Agによって認識できず、SCC-Agの選択的検出を示しています。実証済みのIDE-TiO ₂ 表面を感知すると頭頸部がんの診断に役立ち、早期発見のための戦略に従うことができます。