腹部大動脈瘤の重症度を決定するための交互に配置された電極表面でのmicroRNA-335-5pの検出

はじめに

腹部大動脈瘤（AAA）は生命を脅かす疾患であり、直径が通常よりも3cm以上大きい腹部大動脈として定義されます[1,2]。この状態は、アテローム性動脈硬化症またはプラークの蓄積で発生し、腹部大動脈の壁を弱め、バルーンのように外向きの膨らみをもたらします。時間の経過とともに動脈壁が広がり、この状況はガーデンホースの老化に匹敵します。大動脈を介してポンプで送られる血液からの圧力により、この弱くなった領域が外側に膨らみます。これは動脈瘤と呼ばれます。 AAAは、大動脈の弱くなった部分が合併症を引き起こすときに形成されます[3,4,5,6]。 AAAは、小さな動脈瘤の破裂によって引き起こされる死につながる可能性があります。現在、この状態の診断には、身体検査、コンピューター断層撮影血管造影、磁気共鳴画像法、および超音波超音波検査が使用されています[7、8、9、10]。ただし、他の健康問題を分析する際に一般的に識別されるAAAの検出方法はありません。この状況では、AAAの識別が遅れ、最終的には不要な健康上の問題が発生します。この問題を克服するには、研究者は早期発見方法を開発する必要があり、1つの潜在的な戦略はセンシングシステムの開発です。

定量的な方法での疾患の早期、迅速、かつ高感度の検出は、臨床診断の重要な目標です。現在のバイオセンシングプラットフォームはいくつかの要求を満たし、適切な実験室設定とトレーニングを必要とします。したがって、ほとんどの方法は移植性がなく、理想的なポイントオブケア検出に必要です[11、12]。さらに、医師が正確かつ迅速に意思決定を行うのを支援するために、バイオマーカーレベルの変化の分析が非常に望ましい。特定の領域で発現する循環バイオマーカーは、AAAを診断し、治療の進行状況を追跡するためにさらに調査する必要があります。これらのタイプの循環バイオマーカーの特定は、疾患の診断と治療後の患者のフォローアップの実施に役立ちます。これらのニーズを満たすために、この研究では、AAAの適切なバイオマーカーのセンサーを生成することを提案しています。この研究で提案されたセンサー（交互嵌合電極）は、幅広いバイオマーカーを用いた高性能分析の可能性を秘めています。これは、誘電測定の下で動作する交互のギャップとフィンガーを備えたダイ電極システムです[13、14、15]。

バイオマーカーは、DNA、RNA、タンパク質、炭水化物、脂質、およびそれらの修飾型を含む任意の生体分子である可能性があります[16、17]。さらに、研究者らは、ノンコーディングRNAなどのさまざまなバイオマーカーが細胞系で発現されることを提案していますが、それらはタンパク質に翻訳されません[18]。ノンコーディングRNAは通常タンパク質に翻訳されず、一般的に短い配列を持っています[18、19、20、21]。マイクロRNA（miRNA）、リボソームRNA、トランスファーRNA、核内低分子RNA、核内低分子RNA、テロメラーゼRNA、snRNA、Xist RNA、ボールトRNA、7SL RNAなど、さまざまなクラスの非コードRNAが報告されています。 miRNAは主に遺伝子発現の転写および転写後調節で機能し、しばしば遺伝子サイレンシングを引き起こします[22]。最近、研究者らは、AAAの予測におけるmiRNAの重要性を説明し、AAA患者におけるmiRNA-335-5pの発現の減少を報告しました[23]。臨床的要因とマイクロRNAの発現の組み合わせにより、疾患の予測が大幅に改善され、精度が向上することが証明されています[24]。研究者は特にmiRNA-335-5pに焦点を当てており、これは急速に成長しているAAAの個人で有意に最小の範囲を示しました[2、23]。さらに、miRNA-335-5pレベルの低下により、成長するAAAの検出の信頼性が高まりました。言い換えると、miR-335-5pの負の出力（より高いレベル）は、AAAの重大度を示し、面倒なスクリーニングを最小限に抑えます。この発見は、Wanhainenらによって実証されました。 [23]そして、miRNAがAAAをスクリーニングし、急速に成長するAAAのリスクを排除するための有用なバイオマーカーであることを明らかにしました。現在の研究は、影響を受けた個人のAAAの重症度を判断するために、かみ合う電極（IDE）センサーによるmiRNA-335-5p検出の適用を示しています。

材料と方法

試薬と生体分子

ストレプトアビジン、1,1'-カルボニルジイミダゾール（CDI）、およびリン酸緩衝液（PBS）は、米国のSigma-Aldrichから購入しました。エタノールアミンは、英国のフィッシャーサイエンティフィックから購入しました。すべてのオリゴは、Apical ScientificSdnから商業的に合成されました。 Bhd。、マレーシア。

Chromeマスクでのパターンデザイン

当初、誘電体センサーのパターンは、AutoCADソフトウェアを使用して設計されました。望ましい寸法は、長さ7500μm、幅4100μm、20本の指とギャップのペア、85μmのギャップサイズ、100μmの電極サイズ、40μmの電極の厚さ、4000μmの指の長さでした。パターンは空白のフォトマスクに印刷され、クロムガラスの表面に貼り付けられました。このクロムガラスは、パターン転写手順のためにUV露光システムの下で固定されました。アルミニウム薄膜で堆積された二酸化ケイ素基板は、クロムガラスに対して反対方向に配置され、10秒間UV光にさらされました。パターンが転写された後、レジスト現像液を使用して現像プロセスが行われました。

インターデジタル電極の製造

表面電極は、以下のように表面を製造するための従来のマイクロエレクトロニクス製造プロセスを介して製造された。（ｉ）既存の自然酸化物を有する４インチのウェーハが調製された。 （ii）バッファ酸化物エッチング（BOE）とピラニア溶液を使用してウェーハを洗浄し、自然酸化物と無機汚染物質を除去しました。 （iii）2800Åの厚さの酸化物層を、1000°Cの温度で1時間の湿式熱酸化によって成長させました。 （iv）酸化物層を備えたウェーハは、取り扱いを改善するために4つに分割されました。 （v）金属層は導電層の接着層としてlで堆積された。アルミニウム層（40 nm）は、熱蒸発器ベースの物理蒸着法により、長さ3cm、直径0.5mmで製造されました。（vi）ポジ型フォトレジストの層は基板上のスピンコートでした。（vii）ウェーハは90°Cで60秒間ソフトベークしました。 （viii）ウェーハをクロムマスクで位置合わせし、UV光に10秒間露光しました。 （ix）ウェーハをRD6現像液で15秒以内にリンスして未露光領域を除去し、酸化物とのかみ合った電極（IDE）パターンを作成しました。 （x）ウェーハを90°Cで120秒間ハードベークしました。 （xi）王水を使用してウェーハをエッチングし、両方の層の露出領域を除去しました。 （xii）表面パターンを作成し、残りのフォトレジストをアセトンを使用して洗い流した。次に、3Dナノプロフィロメトリー（Hawk 3D-プロフィロメトリー、米国）分析を実行して、電極間のギャップの鮮明な画像を観察しました。電流測定（A）は、Keithley 6487を使用して、0.1 V（20 s）のステップで0〜2Vの線形掃引で実行されました。

表面の化学的機能化：4価のストレプトアビジン-ビオチン戦略

表面の化学的機能化のために、シリカ表面を最初に1 M水酸化カリウム（pH 9.0）で完全に洗浄して表面を活性化しました。この表面は、1時間のインキュベーション期間でCDI（0.5 M）によってさらに修飾され、10 mMリン酸緩衝生理食塩水（PBS; pH 7.4）で元のストックから希釈された100 nMストレプトアビジン（1時間）と反応しました。このステップに続いて、未反応のスペースを1 Mエタノールアミンを使用してブロックしました（1時間）。次に、4価のストレプトアビジンを1μMのビオチン化プローブmiRNA-335-5p（10分間）と室温で反応させました。各修飾が完了したら、特に明記しない限り、表面をPBSで完全に洗浄しました。

miRNA-335-5pからのプローブおよびターゲット配列の設計

アクセッションコードMIMAT0000765の完全長miRNA-335-5p（5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3 '）がデータバンクから収集されました。ターゲットとしてのこの研究の望ましい領域は、5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3 'です。ターゲットmiRNA-335-5p領域をキャプチャするために、プローブは5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3 'として設計されました。 3 '末端で、ビオチンはセンシング表面に固定化されたストレプトアビジンと相互作用するようにタグ付けされました。全長miRNA-335-5pの二次構造は、オンラインmfoldソフトウェア（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold）によって予測されました。

プローブとターゲットの相互作用：miRNA-335-5pシーケンス

上記のようにビオチン化プローブがストレプトアビジン表面に結合すると、ターゲットmiRNA-335-5p配列は、周囲室温で低フェムトモルから低ナノモル濃度まで相互作用しました（10分間）。これらの濃度は、PBSで10倍段階希釈した場合に1fMから1nMの範囲でした。付着物は低濃度から高濃度まで独立してテストされ、二重鎖が形成されたら、表面を5倍量のPBSで洗浄し、測定を行いました。

I-V測定

電気的特性評価は、電圧/電流供給を備えたキースリー6487ピコアンメーターを使用したI-V測定によって実行されました。測定値は、裸の表面で上記のボルトで記録され、続いて各表面の化学修飾で記録されました。同様に、各濃度でのプローブとターゲットmiRNA-335-5pの間のインタラクティブな分析では、10反応量の洗浄ステップの後に測定を行いました。特に明記されていない限り、すべての変更、相互作用、および測定は、湿潤条件下で維持されました。

結果と考察

IDEセンサーの作成と表面分析

現在の研究では、miRNA-335-5pをツールとして使用し、交互嵌合電極（IDE）センサーのインタラクティブ分析によってAAAの重症度を解明しました（図1）。 miRNA-335-5pの全長から設計されたプローブとターゲットを使用したインタラクティブな分析のために、IDE表面は、従来のフォトリソグラフィー技術を使用して設計および製造されました。段階的な表面改質が実行され、電流計によって測定されました（図2b、c）。 IDEの製造用に設計されたマスクの位置合わせと均一性は、高解像度の3Dナノプロフィロメトリー分析によって確認されました。この観察により、製造と各指の間の距離が適切に整列していることが確認されました（図2d）。 IDEの電極サイズは約100μm、間隔は約85μmで、数百万のバイオマーカーが直列/並列に配置された大規模な挿入ネットワークが形成されます。製造されたIDEの成功を確実にするために、誘電体システムでの再現性を判断するために、さまざまなベアデバイスを使用しました。このシステムは、双極子モーメントによって引き起こされる双極子間の分子振動を測定します（図2c）。この誘電体IDEは、さまざまな生体分子および化学分析に広く使用されている広く受け入れられているシステムです[15、25、26、27、28]。この研究では、すべての表面化学修飾とインタラクティブ分析がI-V電流モードで測定されました。

IDEでのmiRNA-335-5pの検出の表現。設計されたプローブとターゲットは、IDE表面の二重構造とともに表示されます

IDEでの表面測定。 a 測定手順。 b 測定モード。 IDEパターンと接続システムが表示されます。誘電測定値も表示されます。 c 測定中の表面メカニズム。双極子モーメントが表示されます。 d 製造されたIDEの3D形状測定プロファイル

高密度表面分子集合：ストレプトアビジン-ビオチン戦略

センシング表面またはバイオチップへの高密度分子付着は重要であることが示されており、表面の機能化に大きく依存しています[29、30]。この研究は、遺伝子発現、発見、および分子分析に必須である、多数の分子調節に必要な適切な表面を決定することを目的とした。これらの潜在的なアプリケーションでは、分析システムの表面を生成するには、分子を適切な形式で固定化するために分子を適切に結合する必要があります。これらの材料表面は、安価であり、さまざまな程度の充填密度、形態、および厚さを提供するため、表面の相互作用メカニズムを調査するために研究されました。この発見は、分子の適切な付着を促進し、生体分子活性の喪失を防ぎます。さらに、生体分子の固定化の正しい方向は、適切な二次構造の確認によって維持されます。

表面に高密度の分子を作るために、最初にシリカ表面をアルカリ溶液で徹底的に洗浄し、CDIで修飾しました。 CDI表面で高レベルのビオチン化プローブを捕捉するために、ストレプトアビジンでプローブを固定化しました。ストレプトアビジンは、ビオチンに結合する4つの部位を持つ4価のタンパク質であり、生物科学では高親和性分子と見なされています[31、32]。 IDEの表面の電流レベルは2.08E-10 Aでしたが、CDIを取り付けた後、9.2E- 06 Aに増加しました。この結果は、CDIによって変更されたIDEの表面が分析に適していることを明確に示しています。ストレプトアビジンを添加すると、電流レベルはさらに2.36E- 05 Aに増加しました。この戦略を使用して、全長miRNA-335-5pから設計された多数のビオチン化プローブをIDE表面に固定化しました（図3a）。ビオチンの相互作用は、未反応の領域をマスクするためにIDE表面でのブロッキングステップの後に実行されました。表面を変更するたびに、電流の変化が測定されました（図3b）。図3cに示すように、エタノールアミンの添加後の電流変化は2.53E- 05 Aであり、1 nMのビオチン化捕捉配列を添加すると、電流レベルは1.29E- 08Aに減少しました。電流により、IDE検出面へのキャプチャプローブの固定が確認されました。一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドは、露出した5炭酸リン酸骨格（プローブ）に対してより負の電荷を帯びますが、エタノールアミンの正味電荷は、サプライヤーが述べているように中性です。この大きな電荷の違いにより、図3cに示すように、測定された電流に明らかな変動が生じました。さらに、このパラメーターは、標的鎖との二重鎖形成時に再び元に戻された。この発見は、リン酸骨格の露出が減少したことによるものであり、追加の正電荷はmiRNA鎖の核酸塩基に由来します（図4a）。

a miRNA-335-5pの予測される二次構造。全長miRNA-335-5pは、ステム領域とループ領域とともに表示されます。インタラクティブ分析のために選択されたターゲット領域が示されます。 b 表面の化学的および生物学的修飾に関するIDEでのI-V測定（黒丸、裸、赤丸、CDI、紺色円、ストレプトアビジン、緑丸、エタノールアミン）。図の挿入図は図式的に示されています。 c プローブ接続用のIDEでのI-V測定。 （緑色の円、エタノールアミン、暗赤色の円、プローブ）。 AAA合併症の画像は、図の挿入図として示されています

プローブとターゲットのインタラクティブな分析。 a プローブとmiRNA-335-5p（ターゲット）の高用量相互作用。 （濃い赤の円、プローブ、黒の円、ターゲット）。 b miRNA-335-5pの用量依存的分析。下部フェムトモルから下部ナノモル範囲までのテスト。 （濃い赤の円、プローブ、オレンジの円、1 fM、青の円、10 fM、緑の円、100 fM、紫の円、1 pM、ピンクの円、10 pM、水色の円、100 pM、黒の円、1 nM）

IDEでの用量依存のインタラクティブ分析

センシング表面にビオチン化プローブを取り付けた後、ターゲットのインタラクティブ分析をさまざまな用量で実行しました。この検証は、低フェムトモルから低ナノモルの範囲で実行されました。この範囲を確保するために、1nMのターゲットmiRNA-335-5p配列を使用して予備分析を行いました。キャプチャープローブで修飾された表面に1nMのターゲットmiRNA-335-5p配列を追加した後、電流レベルを1.29 E- 08Aから1.29E-07 Aに変更しました（図4a）。この結果は、キャプチャープローブとターゲット配列の間でハイブリダイゼーションが起こったことを示しています。この確認後、検出限界を決定するために、ターゲット配列を1fMから1nMまで滴定しました。これは、キャプチャープローブで修飾された表面に独立して落下しました。現在の変化は、固定化の前後に検出されました。 1 fM、10 fM、100 fM、1 pM、10 pM、100 pM、および1 nMハイブリダイゼーションの電流の差は、それぞれ2.87、3.87、5.04、6.88、8.59、11.21、および11.61E− 08Aでした。得られた結果に基づいて、ターゲットシーケンスのすべてのテストされた濃度で明確な用量依存的な電流変化が検出されました（図4b）。

高い分析パフォーマンス：感度、特異性、再現性

濃度依存の増分による上記の結果に基づいて、線形回帰分析が実行されました。検出感度は3σ計算で推定したところ、1 fMで低下しました（図5a、b）。濃度は1fM未満であり、バックグラウンドシグナルと低い値を示しています。さらに、特異性分析を実施して、標的配列を非相補的および単一および三重の不一致配列から区別した。設計されたプローブは、他の配列よりも完全なmiRNA-335-5p相補配列との強い反応を示したことは明らかでした（図6a）。単一の不一致のシーケンスは、プローブシーケンス上の単一の不一致のシーケンスによる部分的な二重鎖形成のために、非相補的および三重の不一致のシーケンスよりも高い電流応答をもたらした。再現性分析は、IDE表面のすべての化学的および生物学的修飾を3回繰り返して実行され、データが平均化されました。平均化されたデータは、さまざまな実験が実行されたときに有意な変化がなかったことを示しています（図6b）。さらに、IDEのパフォーマンスをサポートするために、現在利用可能なメソッドの特性を比較しました（表1）。

用量依存性。 a miRNA-335-5pとプローブの用量依存的な相互作用。 b さまざまな濃度のmiRNA-335-5pを使用した線形回帰分析。 LODは、バックグラウンドシグナルに対する分析物の最低濃度と見なされました（S / N =3：1）

高性能分析。 a 特異性分析。標的配列は、非相補的および単一および三重の不一致配列から区別された。 b 再現性テスト。平均値は3回の実験で表示されます

結論

生物学的バイオマーカーを使用した分析方法の開発は、身体検査中のAAAの診断に役立ちます。現在の研究では、miRNA-335-5pがAAAで発現していることがわかったため、AAAの重症度を予測するためのmiRNA-335-5pを介した検出が開発されました。生成されたIDE検出の出力は、AAAの重大度の予測を容易にするために、低い検出レベルから高い検出レベルに表示されました。低い検出レベルは1fMで、高性能分析の特異性と再現性が高くなっています。この研究で使用された4価のストレプトアビジン-ビオチン法は、良好な出力をもたらし、他のバイオマーカー分析に利用できます。

データと資料の可用性

すべてのデータは制限なしで完全に利用可能です。

略語

AAA：

腹部大動脈瘤

CDI ：

1,1'-カルボニルジイミダゾール

PBS：

リン酸緩衝液

IDE：

かみ合った電極

UV：

紫外線