櫛形電極を用いたmiRNA-335-5p高感度検出による腹部大動脈瘤重症度評価

概要

腹部大動脈瘤（AAA）は腹部大動脈の下部動脈の拡大を指し、診断のための早期検出ツールの特定が急務です。本研究では、AAA形成を反映するmiRNA-335-5pを特定するため、櫛形電極（IDE）センシング表面を使用しました。シリカ材料の均一性を3Dプロフィロメトリーで観察し、化学修飾された高導電性表面がI-Vモードでの検出を改善。標的miRNA-335-5pは用量依存的に検出され、線形回帰と3σ解析に基づき、ビオチン修飾プローブを用いて感度1 fMを決定。非相補配列、1塩基および3塩基ミスマッチ配列から標的配列を識別することで高い特異性を示しました。これらの出力は、AAA重症度判定のためのmiRNA-335-5p高性能検出と良好な再現性を実証しています。

はじめに

腹部大動脈瘤（AAA）は、腹部大動脈の直径が3 cm超または正常より大きいと定義される生命を脅かす疾患です。この状態は動脈硬化やプラーク蓄積により発生し、腹部大動脈壁を弱化させ、風船のように外側に膨らみます。時間とともに動脈壁が拡大し、これは庭用ホースの老化に例えられます。大動脈を流れる血液の圧力によりこの弱化領域が外側に膨らみ、瘤を形成。弱化した大動脈部分が合併症を引き起こすとAAAとなります。小さな瘤の破裂により死に至ることもあります。現在、身体検査、CTアンギオグラフィ、MRI、超音波検査で診断されますが、AAA専用の検出法はなく、他の健康問題分析中に偶然発見されるのが一般的です。これによりAAA特定が遅れ、不必要な健康問題を招きます。この問題を克服するには早期検出法の開発が必要で、その一つの戦略がセンシングシステムの開発です。

疾患の早期、迅速、感度良く定量的検出は臨床診断の重要な目標。現在のバイオセンシングプラットフォームはいくつかの要求を満たしますが、適切な実験室環境とトレーニングが必要で、携帯性に欠け、理想的なポイントオブケア検出には不向きです。さらに、医師が正確かつ迅速に意思決定できるよう、バイオマーカー濃度変化の分析が強く望まれます。特定領域で発現する循環バイオマーカーをさらに調査し、AAA診断と治療経過追跡に役立てる必要があります。これらの循環バイオマーカーの特定は疾患診断と治療後の患者フォローアップに貢献。これらのニーズを満たすため、本研究ではAAA用適切バイオマーカーのセンサー生成を提案。本研究で提案するセンサー（櫛形電極）は、幅広いバイオマーカーで高性能分析の可能性を秘めています。これは交互に隙間と指を持つ二重電極システムで、誘電測定下で動作します。

バイオマーカーはDNA、RNA、タンパク質、炭水化物、脂質、それらの修飾形態などあらゆる生体分子が対象。さらに、非コーディングRNAが細胞系で発現するがタンパク質に翻訳されないことが提唱されています。非コーディングRNAは通常タンパク質に翻訳されず、一般に短い配列。マイクロRNA（miRNA）、リボソームRNA、トランスファーRNA、小核仁RNA、小核RNA、テロメラーゼRNA、snRNA、Xist RNA、ヴォールトRNA、7SL RNAなど様々なクラスが報告。miRNAは主に遺伝子発現の転写・転写後制御に機能し、しばしば遺伝子サイレンシングをもたらします。最近、AAA予測におけるmiRNAの重要性が記述され、AAA患者でmiRNA-335-5p発現の低下が報告。臨床因子とマイクロRNA発現の組み合わせが疾患予測を大幅に改善し、精度を向上させることが証明されています。研究者らは特にmiRNA-335-5pに注目し、急速増大型AAA患者で有意に最小範囲を示すことを発見。さらに、miRNA-335-5pレベルの低下が増大AAA検出の信頼性を高めることを示唆。つまり、miR-335-5pのネガティブ出力（高レベル）はAAA重症度を示し、煩雑なスクリーニングを最小化。この発見はWanhainenらによって実証され、miRNAがAAAスクリーニングと急速増大AAAリスク排除に有用なバイオマーカーであることが明らかに。本研究では、櫛形電極（IDE）センサーによるmiRNA-335-5p検出を応用し、罹患者のAAA重症度判定を実証します。

材料と方法

試薬と生体分子

ストレプトアビジン、1,1'-カルボニルジイミダゾール（CDI）、リン酸緩衝液（PBS）はSigma-Aldrich社（米国）製。エタノールアミンはFisher Scientific社（英国）製。すべてのオリゴはApical Scientific Sdn. Bhd.（マレーシア）で商業合成。

クロムマスク上のパターン設計

最初に、誘電センサーのパターンをAutoCADソフトで設計。希望寸法：長さ7500 μm、幅4100 μm、指-隙間ペア20、隙間サイズ85 μm、電極サイズ100 μm、電極厚40 nm、指長4000 μm。パターンをブランクフォトマスクに印刷し、クロムガラス表面に貼付。このクロムガラスをUV露光システム下で固定しパターン転写。アルミニウム薄膜堆積酸化シリコン基板をクロムガラスと反対方向に配置し、10秒UV露光。レジスト現像液による現像プロセスでパターン転写。

櫛形電極の作製

表面電極を従来のマイクロエレクトロニクス作製プロセスで作製：(i) 既存ネイティブ酸化膜を持つ4インチウェハーを準備。(ii) 緩衝酸化エッチング（BOE）とピラニア溶液でウェハー洗浄、ネイティブ酸化膜と無機汚染物質除去。(iii) 1000℃で1時間ウェット熱酸化し2800Å厚酸化層成長。(iv) 酸化層ウェハーを4分割し取り扱い容易化。(v) 金属層を接着層として導電層に堆積。熱蒸着法でアルミニウム層（40 nm）を3 cm長、0.5 mm径で作製。(vi) ポジティブフォトレジストを基板にスピンコート。(vii) 90℃で60秒ソフトベーク。(viii) クロムマスクとアライメントし10秒UV露光。(ix) RD6現像液で15秒以内にリンス、未露光領域除去し酸化膜付きIDEパターン形成。(x) 90℃で120秒ハードベーク。(xi) 王水エッチングで両層の露光領域除去。(xii) 表面パターン完成、残留フォトレジストをアセトンで洗浄。その後、3Dナノプロフィロメトリー（Hawk 3Dプロフィロメトリー、米国）で電極間隙の鮮明画像観察。電流測定（A）をKeithley 6487で、0-2 Vを0.1 Vステップ（20秒）でリニアスイープ実施。

表面化学機能化：四価ストレプトアビジン-ビオチン戦略

表面化学機能化では、シリカ表面を1 M水酸化カリウム（pH 9.0）で十分洗浄し表面活性化。さらにCDI（0.5 M）で1時間インキュベートし反応、10 mMリン酸緩衝液（PBS、pH 7.4）で希釈したオリジナルストックから100 nMストレプトアビジン（1時間）と反応。この後、未反応スペースを1 Mエタノールアミン（1時間）でブロッキング。その後、四価ストレプトアビジンを室温でビオチン修飾プローブmiRNA-335-5p（1 μM、10分）と反応。各修飾完了後、特に記載ない限りPBSで十分洗浄。

miRNA-335-5pからのプローブと標的配列設計

フルレングスmiRNA-335-5p（5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3'、アクセスコードMIMAT0000765）をデータバンクから取得。本研究の標的領域：5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3'。標的miRNA-335-5p領域を捕捉するプローブ設計：5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3'。3'末端にビオチンを標識し、センシング表面に固定化したストレプトアビジンと相互作用。フルレングスmiRNA-335-5pの二次構造をオンラインmfoldソフトウェアで予測。

プローブ-標的相互作用：miRNA-335-5p配列

上記詳細の通りビオチン修飾プローブがストレプトアビジン表面に結合後、標的miRNA-335-5p配列が周囲室温で相互作用（10分）、低フェムトモルから低ナノモル濃度範囲。濃度は1 fMから1 nMまで10倍逐次希釈でPBS中。結合は低濃度から高濃度へ独立にテスト、二重鎖形成後、PBS 5倍量で洗浄し測定。

I-V測定

電気的特性評価をKeithley 6487ピコアンメーター（電圧/電流供給）でI-V測定実施。測定は上記電圧でベア表面、次に各表面化学修飾後に記録。同様に、プローブと標的miRNA-335-5pの各濃度での相互作用分析は、10反応量で洗浄ステップ後に実施。すべての修飾、相互作用、測定は特に記載ない限り湿潤条件下で維持。

結果と考察

IDEセンサーの作製と表面分析

本研究では、miRNA-335-5pをツールとして、櫛形電極（IDE）センサー上の相互作用分析によりAAA重症度を解明（図1）。フルレングスmiRNA-335-5pから設計したプローブと標的の相互作用分析のため、従来のフォトリソグラフィ技術でIDE表面を設計・作製。段階的表面修飾を実施しアンメーターで測定（図2b、c）。IDE作製用マスクアライメント設計と均一性を高分解能3Dナノプロフィロメトリー解析で確認。作製と各指間距離が良好にアライメントされていることを確認（図2d）。IDEは電極サイズ約100 μm、間隔約85 μm、数百万のバイオマーカーが直列/並列に形成される大きな介在ネットワークを構築。作製IDEの成功確認のため、異なるベアデバイスで誘電システム下の再現性を確認。このシステムは双極子モーメントによる誘電電極間の分子振動を測定（図2c）。この誘電IDEは、様々な生体分子・化学分析で広く使用される確立されたシステム。本研究ではすべての表面化学修飾と相互作用分析をI-V電流モードで測定。

高密度表面分子アッセンブリ：ストレプトアビジン-ビオチン戦略

センシング表面やバイオチップへの高密度分子固定化は極めて重要で、表面機能化に強く依存。本研究では、遺伝子発現、発見、分子解析に必須の多数分子収容に適した表面を特定することを目的。これら潜在的応用のため、分子を適切なフォーマットで固定化するための適切なカップリングが必要。これら材料表面を調査し表面相互作用メカニズムを解明。安価で多様な充填密度、形態、厚さを提供。この発見は分子の適切な固定化を促進し、生体分子活性喪失を防止。さらに、適切な二次構造確認で生体分子固定化の正しい配向を維持。

表面高密度分子化のため、シリカ表面をアルカリ溶液で十分洗浄しCDIで修飾。CDI表面で高レベルビオチン化プローブ捕捉のため、プローブをストレプトアビジンで固定化。ストレプトアビジンはビオチン結合4サイトを持つ四価タンパク質で、生物科学では高親和性分子と見なされます。IDE表面の電流レベルは2.08E-10 A、CDI付加後9.2E-06 Aに増加。このことはCDI修飾IDE表面が本分析に適していることを明確に示します。ストレプトアビジン添加後、電流レベルさらに2.36E-05 Aに増加。この戦略で、フルレングスmiRNA-335-5pから設計したビオチン修飾プローブをより多くIDE表面に固定化（図3a）。ビオチン相互作用はIDE表面のブロッキングステップ後、未反応領域をマスクするために実施。各表面修飾での電流変化を決定（図3b）。図3cに示す通り、エタノールアミン添加後電流変化2.53E-05 A、1 nMビオチン修飾捕捉配列添加後1.29E-08 Aに減少。この電流変化が捕捉プローブのIDEセンシング表面への固定化を確認。一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドは露出した5-炭酸リン酸骨格によりより負電荷（プローブ）、一方エタノールアミン正味電荷は中性（供給元情報）。この電荷の大きな差が測定電流の顕著な変動を生じさせます（図3c）。さらに、このパラメータは標的鎖との二重鎖形成で再び反転。これはリン酸骨格露出減少と、miRNA鎖の塩基由来の追加正電荷によるものです（図4a）。

IDE上の用量依存的相互作用分析

センシング表面へのビオチン修飾プローブ固定後、異なる用量で標的相互作用分析を実施。低フェムトモルから低ナノモル範囲で検証。確実な範囲確保のため、標的miRNA-335-5p配列1 nMで予備分析。捕捉プローブ修飾表面に標的miRNA-335-5p配列1 nM添加後、電流レベルが1.29E-08 Aから1.29E-07 Aに変化（図4a）；捕捉プローブと標的配列間のハイブリダイゼーション発生を示唆。この確認後、検出限界決定のため、標的配列を1 fMから1 nMまで滴定、捕捉プローブ修飾表面に独立滴下。固定化前後の電流変化を検出。1 fM、10 fM、100 fM、1 pM、10 pM、100 pM、1 nMハイブリダイゼーションの電流差はそれぞれ2.87、3.87、5.04、6.88、8.59、11.21、11.61E-08 A。得られた結果に基づき、テストした全標的配列濃度で明確な用量依存的電流変化を検出（図4b）。

高分析性能：感度、特異性、再現性

上記濃度依存的増加結果に基づき線形回帰分析実施。検出感度を3σ計算で推定、1 fMに達することが判明（図5a、b）。1 fM未満の濃度はバックグラウンド信号と低値を示す。さらに、標的配列を非相補、1塩基および3塩基ミスマッチ配列から識別する特異性分析実施。設計プローブが完全相補miRNA-335-5p配列と他配列より強く反応することが明確（図6a）。1塩基ミスマッチ配列は、プローブ配列上での部分的二重鎖形成により、非相補および3塩基ミスマッチ配列より高い電流応答。再現性分析はIDE表面上のすべての化学・生物学的修飾で三重実験実施、データ平均化。平均データは異なる実験で有意な変化なしを示唆（図6b）。さらに、IDE性能を裏付けるため、現在利用可能な手法の特性を比較（表1）。

結論

生物学的バイオマーカーを用いた分析法開発は、身体検査時のAAA診断を支援。本研究では、AAAで発現することが判明したmiRNA-335-5p媒介検出によるAAA重症度予測を開発。生成されたIDE検出出力は、低検出レベルから高検出レベルまで表示し、AAA重症度予測を促進。低検出レベルは高特異性と再現性を持つ1 fMで、高性能分析を実現。本研究で用いた四価ストレプトアビジン-ビオチン法は良好な出力を生み、他のバイオマーカー分析にも利用可能。

データと材料の入手可能性

すべてのデータは制限なく完全に入手可能です。

略語

AAA:

腹部大動脈瘤

CDI:

1,1'-カルボニルジイミダゾール

PBS:

リン酸緩衝液

IDE:

櫛形電極

UV:

紫外線