アプタマーゴールドナノ粒子をロードしたpH感受性リポソームの設計は、癌治療のためにモリンをカプセル化します

はじめに

最も一般的な死因の1つである癌は、実質的な経済的損失と人間への危害につながる可能性があります。癌治療のためのスマートドラッグの開発にかなりの努力が向けられてきました[2]。薬物が標的部位に到達するまで薬物を保護する能力があるため、ポリマーナノ粒子は治療薬の送達を改善できる可能性があります[3]。治療薬が活性部位に確実に送達されるようにするために、反応性の高いナノ粒子が使用されます。このようなナノ粒子は、さまざまな生物学的刺激の下で材料特性が変化するように設計できます。反応性ナノ粒子は、外部刺激（温度や光など）や生物学的刺激（pHや酸化還元条件など）など、さまざまな刺激を使用して設計されています。ナノ粒子エンドサイトーシス後のpHの変化により、pHに反応するNPが研究の関心を集めています。 pH応答機能をさまざまなポリマー構造に簡単に統合して、pHに応答するナノ粒子のセットを設計できるため、pHに応答する材料も注目を集めています。ナノ粒子は、表面の化学的性質の変化、粒子のサイズまたは形状の変化、および物質の分解または放出によってpHに応答することができます。ナノ粒子の特性のこの変化は、細胞の取り込みと制御された放出を調節するために使用することができます。したがって、pH応答性ナノ粒子は、治療用デリバリーシステムの設計に強力な戦略を提供します。

モリン水和物（3,5,7,2 '、4'-ペンタヒドロキシフラボン）（図1）は、中国の漢方薬または植物から分離された天然の活性物質です[4]。それはプロゲステロン化合物であり、植物中のフェノールの二次代謝産物です。モリンは自然界に広く分布しており、優れた抗酸化作用、抗癌作用[5]、および重要な抗炎症作用を発揮します。さまざまな用途でのモーリンの可能性はかなりの関心を集めていますが[6]、そのような可能性は物質の低い水溶性と生物学的利用能によって大幅に制限されています[7]。

モリン水和物の化学構造

とりわけ、レシチンとセラミドで構成されるリポソーム（中空）は、両親媒性脂質分子からなる二重層構造を持っています[8]。リポソームは、生体適合性、機能性、副作用の軽減、大量の薬をカプセル化する能力などの望ましい機能を提供します[9、10]。それらは、親水性および疎水性の薬剤を効率的に運び、それらを外部条件から保護し、それらを標的組織領域に首尾よく輸送することができる[11]。改善された有効性が設計に組み込まれ、pH感受性リポソームを介した腫瘍間質内での抗癌物質のpH誘発放出を促進します[12、13、14、15]。これらのpH感受性リポソームは、組織環境で薬物を放出し、癌組織のエンドソームなどの酸性環境で急速に不安定化する特殊なリポソームです[16、17、18]。

腫瘍治療の選択性と有効性を高めるには、pH感受性リポソームを修飾して腫瘍標的ナノ粒子を形成する必要があります[19]。 DNAアプタマーは、最近、高度に選択的で感度の高いバイオセンシングおよびイメージングセンサーとして、また癌を標的とした治療法の潜在的な薬剤として開発されました[20]。一本鎖DNAアプタマーAS1411は、癌細胞核に対する結合親和性が高いため、化学療法剤として機能することが示されています[21]。このアプタマー（Apt）をAu NPと組み合わせて、癌細胞の核と相互作用できるAptをロードしたAuNPの2成分ナノコンストラクトを作製しました。いくつかの研究はまた、リポソーム-ナノ粒子ハイブリッドの設計がそのような多機能モダリティの製造のための豊富なツールボックスを提供できることを示した[22]。カチオン性リポソームとAuNPで構成されるハイブリッドリポソーム-AuNP小胞システムは、腫瘍間質内の薬物浸透を改善し、抗癌活性を高めるように設計されています[23、24]。

金ナノ粒子（Au NP）は優れた薬物担体と見なされており、癌を標的とした特異性を高めるために生体関連分子で修飾することができます[25]。 Au NPの表面修飾により、スルフヒドリル基のアプタマーを使用して、Au-S共有結合の標的となるAu NPの表面を修飾でき、ナノゴールド表面の適切なスルフヒドリル基をに結合できます。ナノゴールド表面[26]。エンジニアリングとアプリケーションの観点から、リガンド結合金ナノ材料は、ターゲットを絞った識別、検出、および処理を容易にする強力なプラットフォームを提供します。

現在の研究では、Morinをカプセル化したpH感受性リポソームを使用し、リポソームの表面を修飾したAu-Aptを組み立てました（Apt-Au @ MSL、図3a）。水溶性とバイオアベイラビリティが低いことを特徴とするモリンが形質転換されました。調製されたApt-Au @ MSLの形態、サイズ、およびその他の特性が特徴づけられました。新しいナノ粒子は、腫瘍を標的とした特性と高い抗癌活性を示しました。 Apt-Au @ MSLの抗がん活性は、invitroおよびinvivoで調査されました（図2）。

腫瘍を標的とした特性を持つ癌細胞への薬物送達のためにモーリンを含む設計されたApt-Au @ MSLの提案された概略図。

材料と方法

資料

L-α-ホスファチジルコリン（PC）、コレステロール（Chol）、ヘミコハク酸コレステリル（CHEMS）、モーリン（≥99.99％）、クエン酸ナトリウム（99.9％）、HAuCl ₄ ・3H ₂ O（≥99.9％）、ポリビニルピロリドン（PVP、wt 40,000）、NaOH（≥98.0％）、およびHCl（37％）は、Sigma-Aldrich Chemical Co.（USA）から購入しました。ジスルフィド修飾されたAS1411アプタマーは、TaKaRa（大連、中国）によって次の配列で合成されました：5'-HS-T-（C6-S-S-C6）-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3 '。チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（MTT）、ヨウ化プロピジウム（PI）、カルセイン、およびAlexa Fluor 488アネキシンVは、Sigma-AldrichChemicalから購入しました。すべての水溶液は、二重蒸留水で調製しました。他のすべての試薬は、市販されている中で最高のものでした。

AuNPの合成

最大1mLのHAuCl ₄ ・4H ₂ O（1％）を25 mLのMilli-Q水（pH =5.5）に溶解し、50mgのPVPを溶液に加えました。得られた溶液を三口フラスコ（150 mL）に注ぎ、マイクロ波（MW）照射により5分間機械的に攪拌しながら処理した。続いて、1.5 mLのクエン酸ナトリウム溶液（1％）を溶液にすばやく加え、3分間MW照射しました。溶液は、10000rpmで5分間の遠心分離によって収集されました。

Apt-AuNPの合成

アプタマーのジスルフィド結合は、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィンを使用して切断されました。 30分後、アプタマー（100μL、100μM）溶液をAuNPの10mL 5 nM溶液に添加し、24時間インキュベートしてAu-AptNPを形成しました。 1日後、混合溶液を2.5mLの500mM NaCl溶液で2回塩漬けし、4時間間隔で塩漬けにしました[27]。

pH感受性リポソームの調製

33：13：5のモル比の卵PC対CHEMS対Cholおよび5％モーリンからなるリポソームをフィルム水和により調製した。 Egg PC、CHEMS、Chol、および2mgのMorinを8mLのCHCl ₃ に溶解しました。 、および有機溶媒をロータリーエバポレーターで40℃で除去した。 Morin-リポソームの場合、得られた薄い脂質フィルムを2％（w / v）PBSを使用して水和し、次に氷浴プローブを使用して15分間超音波処理しました。最終的なリポソームは、コロイド系で合成され、安定化された。 Apt-Au @ Morin pH感受性リポソーム（Apt-Au @ MSL）の場合、脂質フィルムを5％デキストロース中の475μg/ mLのAu-AptNPで水和した後、超音波処理しました[23]。

特性評価

紫外可視分光法（UV–Vis、S-3100 Photodiode Array、Scinco Co.、Ltd。、韓国）およびフーリエ変換赤外分光法（FT–IR）（Nicolet iS50、米国、Thermo Fisher Scientific）を実施しました。 Apt-Au @ MSLの形態は、透過型電子顕微鏡（TEM、HT7700、東京、日立）によって調べられました。モーリンの放出パーセンテージは、UV-vis分光法によって検出されました。 Morin-リポソームとApt-Au @ MSLの形態は、走査型電子顕微鏡（SEM、S-4800、日立、日本）でも観察されました。動的光散乱（DLS）とゼータ電位測定を使用して、ブルックヘブンZetaPALS電位アナライザーでMorin-リポソームとApt-Au @MSLの光学特性とサイズを特性評価しました。

細胞培養

ヒト癌細胞株SGC-7901、BGC-823、A549、HeLa、MCF-7、およびHs68は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から購入し、10％ウシ胎児血清を含むRPMIで37°Cおよび5％CO ₂ 。

インビトロ抗癌活性研究

SGC-7901、BGC-823、A549、HeLa、MCF-7、およびHs68を96ウェルプレートに播種しました（2.0×10 ³ 細胞/ウェル）、その後、さまざまな濃度（0、5、10、15、20、および30μg/ mL）のApt-Au @MSLで培養しました。対照群としてAuNPとMorinを割り当てた。ブランクグループは未処理の細胞で構成されていました。 96ウェルプレートを加湿インキュベーターでインキュベートしました。インキュベーション後、9.6 mLのMTT溶液（5 mg / mL）を各ウェルに添加し、さらに2時間インキュベートしました。各グループは3回テストされ、IC ₅₀ 値は、3回の試験と薬物濃度曲線の平均OD値から導き出されました。各グループの明るさは、共焦点蛍光顕微鏡法によって得られました[28]。

リアルタイムの細胞電子センシングシステム（RT-CES; ACEA Biosciences、Inc。）を使用して、細胞接着を10分ごとに75時間モニターしました。細胞接着を測定するために、プレートの各ウェルに細胞を播種しました（1.0×10 ⁴ 細胞/ウェル）を新鮮な培地で最終容量200μLにし、Apt-Au @ MSL溶液でさまざまな濃度（10、20、および30μg/ mL）で10時間インキュベートし、12時間インキュベートします[29]。 。ブランクグループは未処理の細胞で構成され、コントロールグループはモーリンおよびモーリン-リポソームグループで構成されました。

蛍光顕微鏡

SGC-7901細胞は、48ウェルプレートで37°C、5％CO ₂ で一晩培養しました。 。次に、細胞をさまざまな濃度のApt-Au @ MSL溶液（10および30μg/ mL）で12時間処理しました。対照群は、モーリンおよびモーリン-リポソーム群から構成されていた。その後、培地を除去した。ブランクグループは未処理の細胞で構成されていました。細胞をPBSで3回洗浄した。細胞を染色した後、生細胞と死細胞を共染色して測定しました（LIVE / DEADアッセイ）。カルセイン-AM / PIで30分間共染色した後、細胞をPBSで2回洗浄して過剰な色素を除去し、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）（カルセイン-AMの場合、Ex =488 nm）によって蛍光画像を取得しました。およびEm =515 nm; PI Ex =535nmおよびEm =615 nm [30]）。

アポトーシス細胞死分析

Apt-Au @ MSLの抗がん効果を測定するために、6ウェルプレートの各ウェルにSGC-7901細胞（1.0×10 ⁵ ）を播種しました。 細胞/ウェル）、その後、さまざまな濃度（5、10、20、および30μg/ mL）のApt-Au @MSL溶液で12時間インキュベートします。ブランクグループは未処理の細胞で構成され、コントロールグループはMorinおよびMorin-リポソームグループで構成されました。処理後、細胞を収集し、PBSで2回洗浄した。細胞をPIおよびアネキシンV–FITCで染色し、CytoFLEXアナライザー（Beckman Coulter）を使用して分析しました（PIの場合、Ex =535nmおよびEm =615nm;アネキシンV–FITC、Ex =488nmおよびEm =525 nm ）[31]。

壁の破壊に関する研究

抗癌アッセイで細胞壁破壊を研究するために、SGC-7901細胞を6ウェルプレートで37°C、5％CO ₂ で増殖させました。 。材料なしで培養された細胞をブランクグループとして使用した。細胞をさまざまな濃度（5、10、20、および30μg/ mL）のApt-Au @ MSLで12時間培養した後、トリプシン-EDTA溶液0.25％で処理しました。すべての細胞（培地中の浮遊細胞を含む）を2000 r / minで5分間収集しました。次に、収集した細胞を2.5％グルタルジアルデヒド溶液で4時間後固定しました[32]。固定された細胞は、アセトン勾配系列で20分間脱水されました。細胞は最終的に一連の手順にかけられ、銅グリッドに取り付けられ、TEM（HT-7700、日立、日本）によって観察されました。

ウエスタンブロットアッセイ

SGC-7901細胞のタンパク質発現はウエスタンブロット分析によって検出されました。 SGC-7901細胞（4.0×105細胞/ウェル）を9cm培養プレートと20μg/ mLApt-Au @ MSLに1、6、12、24時間接種しました。処理後に細胞を回収し、氷上の細胞溶解バッファーに1時間懸濁しました。混合物を11,000 g の遠心分離機に入れました。 4℃で10分間、全細胞タンパク質を含む上清を回収しました。上清中の総タンパク質濃度は、BCA法を使用して決定されました。次にタンパク質をローディングバッファーに再懸濁し、100℃で10分間煮沸しました。等量のタンパク質（40μg/レーン）を含むサンプルをSDS-PAGE（10％トリシンゲル）にかけました。次に、それらを100 Vで1.5時間ニトロセルロース（NC）メンブレンに転写し、0.1％Tween-20（TBST）を含むトリス緩衝生理食塩水中の5％脱脂乳を1時間使用してブロックしました。次に、NCメンブレンを一次抗体および二次抗体とそれぞれインキュベートしました。 ECLウエスタンブロッティング検出試薬を使用して、ターゲットタンパク質のバンドをメンブレン上で視覚化しました。 β-アクチンは、等しいタンパク質のローディングとトランスファーの内部コントロールとして使用されました。タンパク質の発現はQuantity-OneSoftwareによって定量化され、発現速度はバンド[33]の下にラベル付けされました。

動物モデル

BALB / cオスヌードマウス（〜17 g）は南京大学のモデル動物研究センターから購入し、無菌環境（特定病原体除去動物）で飼育しました。腫瘍モデルは、細胞懸濁液の皮下注射によって確立されました（SGC-7901細胞、100μL、1×10 ⁶ / mL）ヌードマウスの肩に。腫瘍の明るい画像は、皮下注射腫瘍細胞の15日後に生成されました。すべての動物実験は、安徽農業大学実験動物センター（許可番号：SYXK 2016-007）によって承認されたプロトコルに従って実施されました。ノギスを使用して、各腫瘍の最大縦径（長さ）と最大横径（幅）を決定しました。次に、式の長さ×幅 ² を使用して腫瘍体積を計算しました。 ×0.5 [34]。

InVivo抗がん研究

腫瘍体積が50mm ³ に達したときに、フォローアップテストを実施しました。 。ランダムに5つのグループに分けられたマウスは、次の静脈内治療を受けました：PBS（100μL）、Morin、Morin-リポソーム、Au-Apt、およびApt-Au @MSL。マウスは、治療用材料の2 mg / kgの用量で尾に静脈内注射された。マウスの腫瘍サイズは24日後に測定されました。マウスの体重と生存率も測定された。マウスを安楽死させ、H＆E染色のためにマウスの腫瘍および臓器組織を収集した[35、36]。

ブロッキングおよび透過処理後、腫瘍スライドをPBSで洗浄し、TUNELアッセイで染色し、DAPI対比染色を行いました。蛍光画像はCLSMによって取得されました。 DAPIイメージングの場合、Ex =358nmおよびEm =461 nm、TUNELアッセイの場合、Ex =450–500nmおよびEm =515–565 nm [37]。

毒性評価アッセイ

重要な臓器に対するApt-Au @ MSL治療の毒性を評価するために、4つの治療グループのマウスを30日後に犠牲にしました。すべてのグループのマウスの重要な臓器（肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、腫瘍）を収集し、H＆Eで染色しました。血液サンプルも採取し、血糖値を測定しました。さらに、マウスの体重が測定されました[38]。

結果と考察

特性評価

本研究は、ナノ粒子（AptをロードしたAu NP）の利点を持ち、抗がん剤として効果的に使用できる新しいリポソームの開発を目的としています。新しいリポソームの基本的な特性は、さらなる研究を行うために重要です。 Apt-Au @ MSLは、以前の研究[23]で説明されているように、わずかな変更を加えて合成され、さまざまな方法を使用して特性評価されました（図3）。図3bは、UV-vis分光法の結果を示しています。これは、特徴的なピークを示し、AuNPの形成を監視できます。特徴的なピークは、約530nmのAuNPのUV-visスペクトルで観察されました。具体的には、UV-visスペクトル分析は、表面のApt修飾の影響を受けた強いUV吸光度を示しました。同じ結果が観察されました。特徴的なピークは、pH感受性リポソームがモーリンでコーティングされた後に置き換えられました。製造されたApt-Au @ MSLの特徴的なピークは、362および550nmにありました。これらの結果は、合成が正常に完了したことを示しています。さらなる特性評価のために、FT-IR分光法を実施して、合成の結果を検証しました。 Morin-リポソームとApt-Au @ MSLの特徴的なピークの赤方偏移は、Morinの修飾が成功したことをさらに示しています（図3c）。 Apt-Au @ MSLのpH感度を決定するために、さまざまなpHレベルでPBSでモーリン放出アッセイを実行しました。これらの3つのpH値は、血液循環の中性環境、腫瘍の弱酸性環境、および細胞内体の酸性環境をシミュレートします。モーリンの放出パーセンテージは、UV-vis分光法によって検出されました。 pH 5.0では、モーリンの約54％が24時間以内に放出され、次の96時間で継続的な放出が観察されました。一方、pH 7.4では、24時間以内にモーリンの約10％しか放出されませんでした。これらの結果は、Apt-Au @ MSLが通常の生理学的条件下で良好な安定性を示し、薬物の漏出を防止することを示しています。しかし、薬は核体内ですぐに放出されます。この薬物放出挙動は、治療の効果を効果的に改善することができます（図3d）。リポソームとApt-Au @ MSLの構造を解明するためにTEMとSEMを実施しました（図3f）。 TEMはAuNPの構造を解明するために実施されました。図3gに示すように、AuNPの粒子サイズは約10 nmであり、これはリポソームの修飾のサイズと一致しています（図3g）。図3eのSEMの結果は、生のリポソームが、DLSによって決定されたサイズと一致する約120nmの不均一な直径を持つ単層ベシクルのみを形成することを示しています。対照的に、Apt-Au @ MSLは、ハイブリッドベシクルの形態がAu-Apt修飾に起因することを示しています。 150 nmの直径も、DLSによって決定されたサイズと一致していました（図3i）。特に、pH感受性リポソームとAu-Apt間の相互作用のTEM調査により、Au NPはほぼ排他的に小胞脂質二重層と関連しており、小胞の周辺に局在していることが明らかになりました（図3h）。 ζ電位の測定値は図3jに示され、AuNPとAu-Aptのゼータ電位は負です。結果は、Au NP（−57.1±0.3mV）とAu-Aptの両方が負に帯電している（−31.7±0.2mV）ことを示しています。 Apt-Au @ MSLは、正に帯電したMorin-リポソームで修飾され、電位は36.4±0.3mVに変化しました。正および負の電荷吸着は、Au-AptとMorin-リポソームが結合するメカニズムです。さらに、図3kは、粒子のカプセル化率の経時変化を表しており、一定期間にわたる粒子の安定性を示しています。図3kに示すように、粒子のカプセル化率は24時間以内にほとんど変化せず、粒子が一定期間にわたって良好な安定性を示すことを示しています。モーリン-リポソームおよびApt-Au @ MSLのカプセル化率を調べるために、モーリン濃度とモーリンのUV-Vis吸光度の標準曲線を作成しました。その結果、表S1および図S1に示すように、Morin-リポソームおよびApt-Au @ MSLの捕捉効率は90.2％および89.6％に達する可能性があることが明らかになりました。

特性画像。 a Apt-Au @MSLの合成の概略図。 b Morin、Au NP、Au-Apt、Morin-リポソーム、およびApt-Au @MSLの紫外線吸収スペクトル。 c Morin、Morin–liposome、およびApt-Au @MSLのFT-IR分光計。 d さまざまなpH条件でのApt-Au @ MSLからのモーリンの放出挙動。 e モーリン-リポソームのSEM画像。 f Apt-Au @MSLのSEM画像。 g AuNPのTEM画像。 h Apt-Au @MSLのTEM画像。 i Morin-リポソームおよびApt-Au @ MSLの直径は、DLSを介して少なくとも3回決定されました。 j ζ-AuNP、Apt-Au、およびApt-Au @MSLの電位。 k Morin-リポソームおよびApt-Au @ MSLの捕捉効率率（EE％）

Apt-Au @MSLの抗がん活性テスト

インビトロ

モリンは優れた抗腫瘍活性を示しますが、水溶性が低いためバイオアベイラビリティは低くなります。モーリンをpH感受性リポソームでカプセル化し、水溶性物質に変換した後、Au-Aptを使用してリポソームの表面を修飾し、目的の抗腫瘍効果を得ました。図4aは、invitroでのMTTアッセイによるApt-Au @ MSLの抗がん活性を示しています。薬物濃度は、モーリン濃度によって定義されます。モーリン治療群は、ブランク群と比較して、明らかな抗癌活性を示さなかった。しかし、pH感受性リポソームによってカプセル化されたモーリンで処理されたグループは、増強された抗癌活性を示した。この結果は、モーリン-リポソームの抗腫瘍活性が生のモーリンよりも優れていることを示唆している。同時に、Apt（Apt-Au @ MSL）で修飾されたリポソームの抗腫瘍活性が改善されることを発見しました。表1に、IC ₅₀ を示します。 Morin、Morin–liposomes、Apt-Au @ MSL、およびシスプラチンの値。 Morin、Morin–liposomes、およびApt-Au @ MSLは、腫瘍細胞に対して幅広い抗がん活性を示しました。彼らは、正常なヒト細胞に対して高い効力と低い毒性を持つSGC-7901細胞に対して明確な好みを示しました。 IC ₅₀ Apt-Au @ MSLの値は、SGC-7901セルで15.6±1.5μg/ mLでした。これらの結果は、RTCAテストによってさらに確認されました。 SGC-7901細胞は、さまざまな濃度のApt-Au @MSLで培養されました。ブランクグループはPBSで処理され、コントロールグループはモーリンとモーリンリポソームで構成されていました。接着と拡散はiCELLigenceを使用して監視されました（図4b）。結果は、MTTテストで得られた結果とほぼ同じでした。 Apt-Au @ MSLの抗腫瘍活性は、MorinおよびMorin-リポソームの抗腫瘍活性よりも有意に高かった。 Apt-Au @ MSLは、濃度の増加とともにSGC-7901細胞の増殖を阻害する可能性があります。 Apt-Au @MSL処理後の細胞形態の変化も蛍光顕微鏡で観察されました。図4cに示すように、Apt-Au @ MSLのないSGC-7901セルは、セルの構造的完全性を維持します。対照的に、細胞をさまざまな濃度のApt-Au @ MSLで処理すると、細胞の完全性が損なわれます。

a さまざまな濃度（0、5、10、15、20、および30μg/ mL）のさまざまな材料（Morin、Au-Apt、Morin-リポソーム、およびApt-Au @ MSL）とインキュベートしたSGC-7901細胞の細胞生存率。 PBSで処理した細胞をブランクグループとした。 b SGC-7901細胞の細胞増殖曲線はRT-CESシステムによって検出されました。異なる化合物を10時間で添加しました。 a の濃度 、 b 、および c それぞれ異なるApt-Au @ MSL（10、20、および30μg/ mL）です。 c さまざまな濃度（0、2.5、5、10、20、および30μg/ mL）での明るい細胞の画像

アポトーシス細胞死分析

アポトーシスの定量分析は、アネキシン-FITC染色を使用したフローサイトメトリーによって実行されました。細胞をPIおよびアネキシンV–FITCで染色し、CytoFLEXフローサイトメーター（Beckman Coulter）を使用して分析しました。アネキシンVは、曝露されたホスファチジルセリンに結合した初期アポトーシス細胞を検出するために使用され、PI標識は、後期アポトーシス細胞を染色するために使用されました。ブランクグループのアポトーシス率は1.57％でした。モーリンで処理された細胞は3.51％のアポトーシス率を示しました。さまざまな濃度のApt-Au @ MSLは、7.44％、10.75％、15.53％、および40.77％のアポトーシス率でより高い誘導能力を示しました（図5）。増強されたアポトーシスはまた、Apt-Au @MSLによって誘導される卓越した抗癌活性を確認した。 SGC-7901細胞のアポトーシス率は、Apt-Au @MSL濃度の増加とともに増加しました。

さまざまな方法で処理した後のSGC-7901アポトーシスのアネキシンV-FITC / PI染色ベースのフローサイトメトリー分析。 a の濃度 、 b 、 c 、および d それぞれ5、10、20、30μg / mLです

蛍光アッセイによる抗癌活性研究

Apt-Au @ MSLによって誘発されたSGC-7901細胞に対する抗腫瘍効果は、LIVE / DEAD蛍光アッセイによって直感的に評価されました。細胞をMorin、Morin-liposomes、およびApt-Au @ MSLとさまざまな濃度でインキュベートした後、暗条件下でLIVE / DEADキットと30分間共染色しました。図6では、空白のグループのセルは、すべての緑色の蛍光セルが生細胞を表していることを示しています。 MorinおよびMorin–liposomesを含むコントロールグループは、赤色蛍光細胞の数を示しています。しかし、異なる濃度のApt-Au @ MSLで処理された細胞は、明らかに多数のアポトーシス細胞を示しました。濃度の増加に伴い、生細胞は徐々に減少しました。死細胞の割合は主に増加し、細胞密度は減少しました。その結果、Apt-Au @MSLが腫瘍のアポトーシスを効果的に促進できることが確認されました。

異なる濃度のApt-Au @ MSLとインキュベートしたSGC-7901の蛍光顕微鏡画像とその後の簡単な染色。ブランクグループはPBSでした。モーリンとモーリン-リポソームを対照群として設定しました

セルの整合性の調査

Apt-Au @ MSLのSGC-7901細胞への取り込みと輸送の影響を確認するために、TEMアッセイを実施しました。細胞形態の変化をTEMで観察した。細胞の内部構造を観察し、抗がんメカニズムのリファレンスを提供するために、TEM画像が実施されました。図7に示すように、処理なしのSGC-7901細胞の空白の画像は、透明な細胞壁の形態と外観に大きな変化を示しました。対照群（モリンおよびモリン-リポソーム）では、細胞形態が部分的な損傷を示し、核領域が収縮した。ただし、Apt-Au @ MSLへの曝露後、細胞壁と内部構造の有意な変化も観察されました。細胞質が漏れ、核構造が不明瞭になりました。多くの細胞断片が中空細胞の周りに形成されました。さらに、細胞壁が崩壊したか、破壊されました。プロファイル全体が不明確になり、細胞が損傷し、細胞質が漏出した。赤い矢印はAuNPエリアを表しています。 As the concentration of the Apt-Au@MSL increased, more Au NP regions appeared in the nucleus. This occurrence suggested the release of Morin after Apt-Au@MSL entered the cell interior, hence the appearance of a large amount of Au NPs. These aforementioned results suggest that antitumor activity was associated with compromised cell integrity and nuclear structure.

TEM images of SGC-7901 cells treated with different concentration of Apt-Au-MSL (10, 20, and 30 μg/mL). The blank group was PBS. The Morin and Morin–liposome were set as control group. The red square is the enlarge area. The red arrow point to Au NPs

Molecular Mechanism Induced by Apt-Au@MSL

To explore the molecular mechanism of Apt-Au@MSL-induced apoptosis, we detected the expression levels of caspases and PARP. Activation of caspase-3, -8, and -9 was first detected with specific substrates. As shown in Fig. 8a, Apt-Au@MSL treatment induces dose-dependent activation of caspase-3, -8, and -9. Caspase-9 promotes mitochondria-mediated apoptosis more than does caspase-8, indicating that the mitochondria-mediated apoptosis signaling pathway is dominant. Western blot analysis further confirmed the existence of Apt-Au@MSL-induced apoptosis at the protein level. Figures 8b and c show that after cells are treated with Apt-Au@MSL, activation of caspases and cleavage of PARP shows time and dose dependence (Figs. 8b, c). In Fig. 8d, e, the Western blot analysis confirmed our results. In conclusion, Apt-Au@MSL inhibits the growth of SGC-7901 cells mainly by inducing apoptosis.

Apt-Au@MSL induced apoptosis in SGC-7901 cells. a SGC-7901 cells were treated with indicated concentrations of Apt-Au@MSL for 24 h. Then, the total protein was extracted and incubated with synthetic Apt-Au@MSL substrates for measuring caspase activities. Dose-dependent (b ) and time-dependent (c ) effects of Apt-Au@MSL on PARP and caspases expression. d 、 e Quantitative analysis of PARP, caspase-7, caspase-9, and caspase-3 expressions. Data are means ± SD, *P <0.05、** P <0.01

Apt-Au@MSL Inhibits Tumor Growth

In Vivo

The in vivo antitumor activities of Apt-Au@MSL were evaluated using an SGC-7901 tumor xenograft model. A comparison of the images of the tumors with those of the control group (Morin and Morin–liposomes) showed that mice treated with Apt-Au@MSL markedly reduced the weight and size of the tumor (Fig. 9a). The relative tumor volume curves and the mice weight curves indicate that the Apt-Au@MSL in vivo exhibits a higher anticancer efficiency (Fig. 9b) than those of the other treatment groups. No significant difference in average tumor volume was indicated between the control group (Morin and Morin–liposomes) and the blank group. The tumor volume of the Apt-Au@MSL group was only nearly a tenth of the blank group and nearly a sixth of the control group. The result indicated that raw Morin and Morin–liposomes at 40 mg/kg exerted no effect on the growth rate of tumors. However, Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth. The body weight of mice in the different groups (PBS, Morin, Morin–liposomes, and Au-Apt groups) showed no marked fluctuation (Fig. 9c) during the treatment period. This result suggested that the treatment was tolerated and caused no acute side effects. Notably, we found that the mice with Apt-Au@MSL treatment showed markedly prolonged survival (Fig. 9d). The surviving mice in this group behaved normally, showing no apparent sign of unhealthy condition. These results demonstrated that the administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models.

a In vivo applications of Apt-Au@MSL and photographs of the mice tumor taken 24 days. A dosage of 2 mg/kg was administrated intravenously for all mice (n = 6–8). b Tumor weight of mice in different groups after 24 days. c Tumor volume index for the different treatment groups. The tumor sizes were measured at the indicated time points. d Survival rate of the mice in different group after tumor inoculation. Data are means ± SD (n  = 6-8). The intravenous injection of PBS was set as blank group (100 μL); the treated by Morin and Morin–liposome were set as control group. In vivo therapeutic effects of Apt-Au@MSL in SGC-7901-bearing mice. Data are means ± SD, *P <0.05、** P <0.01

Histological Analysis of Anticancer Activity

H&E staining of tumor tissue and organ samples was conducted after fixation and treatment. Treatment efficacy with respect to tumor cell death was also evaluated by H&E staining of tumor tissue from different groups. In Fig. 10a, the mice treated with Au-Apt, Morin, and Morin–liposomes show the same extent of thermal damage as that of the mice in the blank group. No apparent apoptosis was observed in the blank group. The tumor tissue sections consisted of tightly packed tumor cells. However, Apt-Au@MSL treatment exhibited the most significant damage to the tumor tissue, with moderate cell apoptosis in the tumor. The result suggested anticancer activity in the mouse models treated with Apt-Au@MSL. To further investigate the ratio of apoptotic cells in tumors tissue in vivo, TUNEL assay was performed for the detection of apoptotic cells. As shown in Fig. 10b, the apoptotic cells in tumors can be stained with green fluorescence to indicate apoptosis. The merged images show fewer green fluorescent regions in the blank group and the control group (Morin and Au-Apt), indicating the presence of fewer apoptotic cells. The cells of the mice treated with Morin–liposomes appear partly apoptotic. Moreover, a large number of green fluorescent regions were observed in the group treated with Apt-Au@MSL, indicating a large amount of apoptotic cells. The results were consistent with that of H&E staining, confirming that Apt-Au@MSL can promote tumor apoptosis in vivo.

a H&E staining analysis of the tumors in mice. Histological analysis of the tumors in mice following different treatments as PBS, Morin, Morin–liposome, Au-Apt, and Apt-Au@MSL group. b Apoptotic cells were detected by a TUNEL assay (green) and co-stained by nuclear staining DAPI (blue)

In Vivo Toxicity Evaluation

The potential in vivo toxicity is often a significant concern for the clinical application of anticancer medicine. To verify the applicability of Apt-Au@MSL in vivo, the mice were evaluated under different treatments (Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL). Blood biochemical assays were also conducted to examine possible changes in the biochemistry of mice after treatment. As shown in Fig. 11a, the blood glucose index for blood function of the Apt-Au@MSL groups was similar to those of the blank and control groups. No difference in body weight was found in each group. A steady increase was observed, indicating that the drug exhibited no toxicity (Fig. 11b). H&E staining of organ sections (Fig. 11c) showed no sign of damage or inflammation in the group treated with Apt-Au@MSL, compared with the blank and control group. This finding indicated that PBS, Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL were negligible side effects in vivo. These results, as well those of H&E staining, further indicate safety in the use of Apt-Au@MSL for tumor treatment.

In vivo toxicity evaluation. a Blood glucose data detected in the mouse toxicity model. b Weight of mice in different groups after 24 days. c Images of H&E-stained major organs. Each value represents the mean ± SD (n =3）

Conclusions

In conclusion, this study presents the synthesis of an antitumor nanomaterial, Apt-Au@MSL. Apt-Au@MSL exhibited excellent monodispersity and tumor-targeting properties. The polarity of Morin was modified, and the antitumor activity was enhanced. The pH of the solution was 5.0, and the release rate of Morin from Apt-Au@MSL was the maximum in the characterization experiments. Apt-Au@MSL showed that the morphology of hybrid vesicles was attributable to Au-Apt modification. The diameter of 150 nm was consistent with the size determined by DLS. We screened our model cancer cell by MTT assay and found that SGC-7901 cells could effectively suppress proliferation. IC ₅₀ of Apt-Au@MSL was 15.6 ± 1.5 μg/mL for the SGC-7901 cells. Fluorescent flow cytometric assays confirmed that Apt-Au@MSL could be used as an effective anticancer material and induced apoptosis in vitro. The Apt-Au@MSL found in the internal cell, as shown in the TEM images, suggested that Apt-Au@MSL could target the cancer cell. The administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models, as determined from tumor weight testing. H&E staining and TUNEL assay further confirmed that Apt-Au@MSL could promote tumor apoptosis in vivo. Both blood biochemistry testing and H&E staining suggested that these materials exhibit negligible acute toxicity and good biocompatibility in vivo.

データと資料の可用性

The authors declare that the materials, data, and associated protocols are promptly available to the readers without undue qualifications in material transfer agreements. All data generated and analyzed during this study are included in this article.

略語

Apt:

Aptamers

Apt-Au:

Aptamers and Au nanoparticle

MSL:

Morin pH-sensitive liposome

AuNPs：

金ナノ粒子

ROS：

活性酸素種

Apt-Au@MSL:

Aptamers and Au nanoparticle-modified Morin pH-sensitive liposome

PC：

L-α-Phosphatidylcholine

Chol:

Cholesterol

CHEMS:

Cholesteryl hemisuccinate

PVP：

ポリビニルピロリドン

PI：

Propidium iodide

FT–IR:

フーリエ変換赤外分光法

UV–Vis：

紫外可視分光法

TEM：

透過型電子顕微鏡

SEM：

走査型電子顕微鏡

DLS：

動的光散乱

PDI：

多分散度指数

ATCC:

American Type Culture Collection

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

TUNEL：

TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling

H&E staining:

Hematoxylin-eosin staining

RTCA:

Real-time unlabeled cell analysis