神経保護のための脳を標的としたポリソルベート80乳化ドネペジル薬物負荷ナノ粒子

はじめに

ADは、進行性の認知機能障害を引き起こす複雑な病理学的メカニズムを伴う中枢神経系疾患ですが、薬物投与が困難であり、脳組織に到達する可能性のある薬物の濃度が低いため、治療が非常に困難です[1、2]。 BBBの通過は、ドラッグデリバリーシステム（DDS）の研究において大きな困難になっています[3、4]。ほとんどの薬は、生物学的、化学的、または物理的な手段でBBBを開きます。それらの中で、物理的方法は現在、臨床的に最も一般的に使用されています[5]。侵襲的技術に基づく頭蓋内薬物送達の卓越した欠陥のために、薬物表面の化学修飾による親油性プロドラッグまたは能動輸送基質の生成には、より多くの利点があります[6]。それらの中で、ナノ粒子は、BBBを積極的に標的とすることによって頭蓋内薬物送達を達成するための最良の選択の1つです[7,8,9]。

ナノDDSは脳標的研究の焦点となっており、治療と診断を提供するように設計されたポリマーナノ粒子、有機ナノ粒子、リポソーム、ナノファイバー、ミセルが含まれます[6、10、11、12]。薬物をロードしたナノ粒子と低分子の親油性薬物の両方がBBBを通過できます。違いは、薬物をロードしたナノ粒子は、脳の毛細血管壁への吸着によって受動拡散を通過する可能性が高いことです。さらに、遊離薬物は2番目の障壁である血液脳脊髄液障壁（B-CSF）に直面します[13]。他のバリア対応物とは異なり、ほとんどの薬剤はCSFを比較的透過し、脳実質に拡散します。しかし、拡散プロセスが非常に遅いため、CSF中の遊離薬物の濃度は脳実質よりもはるかに高く、CSF中の高濃度はある程度の毒性を引き起こします[14、15]。このプロセスでは、ナノ粒子には独自の重要な利点があります。ナノキャリアの表面が親水性界面活性剤でコーティングされている場合、ApoEは表面に吸着し、CSFは血管周囲の空間を通って脳実質に向かうナノ粒子の移動を促進することができます[16]。 Kreuterらによって調製された非イオン性界面活性剤ポリソルベート80でコーティングされたナノ粒子。 [17]は、脳系への送達に成功し、血漿中の血清タンパク質ApoEの吸着を介して輸送された最初の薬剤でした。したがって、ナノ粒子の表面をポリソルベート80で修飾して薬物特異的複合体を形成すると、薬物の標的化と内因性BBB受容体の認識が可能になり、薬物のバイオアベイラビリティが大幅に向上します[18、19、20]。

現在、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害剤であるドネペジル（DZP）は、中等度のADの治療に一般的に使用されていますが、脂溶性のため、 vivo での溶解性が低い 、および経口バイオアベイラビリティが低いため、治療効果を維持するために、従来のドネペジル錠を毎日服用する必要があります[21、22]。 AD患者の認知能力は著しく損なわれ、投薬スケジュールを維持する上で大きな不便を引き起こすため、長時間作用型徐放性DZP製剤の開発が急務となっています。アミロイドカスケード仮説は、ADの原因が脳実質および脳血管壁の周りのアミロイド斑の沈着であることを示唆している。多数のびまん性スポットが脳領域にも観察されます。これは、アモルファスで、線維性が高く、不溶性の細胞外Aβ沈着物で構成されています[23、24]。 Boridy etal。非毒性で分解しやすいプルラン多糖ナノ粒子は、Aβタンパク質と複合体を形成し、タンパク質の凝集を効果的に防止し、細胞から迅速に除去して細胞毒性を阻害できることを発見しました[25]。コレステロール-疎水性修飾プルラン（CHP）は、水溶液中で疎水性コアと糖鎖親水性シェルを備えたナノ構造に自己組織化できる両親媒性物質です[26、27]。同時に、CHPナノ粒子はAβタンパク質を吸着してその沈着と凝集を防ぎ、相乗的な役割を果たします。ナノキャリアとして、CHPには大きな優位性があります。

上記の知識に基づいて、研究チームは初期段階でDZP-CHPナノ製剤を設計し、ナノキャリアに対する薬剤の最適な投与比率を決定しました。次に、ポリソルベートをナノ粒子の表面に吸着させ、BBBの通過を積極的に標的にして脳の濃縮を達成しました。この研究では、一連のDZP-CHPナノ溶液の特性を明らかにし、invitroでの薬物放出プロセスを調査および研究しました。ナノ粒子の調製に成功した後、Aβ25-35を使用して神経細胞の損傷を誘発し、AD細胞モデルを確立しました[28、29]。次に、DZP-CHPナノソリューションの保護効果をPC12およびSH-SY5Yセルモデルで調査しました。

材料と方法

資料

以下が使用されました：コレステロール-疎水的に修飾されたプルラン（自家製）[30];ドネペジル（上海Ziqiバイオテクノロジー株式会社）;ポリソルベート80（Tianjin Fuchen Reagent Institute）;インドシアニングリーン（ICG）染料（Tianjin Baiying Biological Technology Co.、Ltd。）;ポリソルベート80（Tween 80、PS）（Tianjin Fuchen Reagent Office）;黒ネズミ（Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co.、Ltd。）; Aβ25-35（USシグマ）;テトラメチルアゾゾール塩（MTT）（US Sigma）;新生ウシ血清（米国ギブコ）;乳酸デヒドロゲナーゼキット（LDH）（Nanjing Jiancheng Biological Co.、Ltd。）; AO / EB二重染色蛍光キット（Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co.、Ltd。）;中南大学第2Xiangya病院神経内科から入手したPC12細胞（ラット副腎褐色細胞腫細胞）。 SH-SY5Y細胞（ヒト骨髄神経芽細胞腫細胞）は、ATCCセルバンク（マナッサス、バージニア州、米国）から購入しました。

ナノ粒子の調製

DZPとCHPの比率（w / w）が異なる3種類のナノ粒子（10：20、4：20、2：20）は、文献で報告されている方法[31]に従って、水透析によって最初に正常に調製されました。特定の濃度のDZP-CHPナノ粒子を一定量の10mLのビーカーに加え、ポリソルベート80（PS）乳化剤（濃度0.7 mmol）を含む別のビーカーに吸引して1時間静置しました。次に、混合物をEPチューブに入れ、3分間超音波処理しました（出力電力100 W、断続的なパルス動作モード：パルス幅2.0秒、断続的な時間2.0秒）。均一な分散が得られるまで、この操作を3回繰り返した[32]。ポリソルベート80乳化ドネペジル薬物負荷ナノ粒子（PS-DZP-CHP）は、不純物がろ過によって除去された後、最終的に得られました。

ナノ粒子の特性評価

ナノ粒子の形態

DZPとCHPの比率が1：2、1：5、および1:10のDZP-CHPナノ粒子（DCP）の形状、表面形態、およびサイズを、TecnaiF20透過型電子顕微鏡で分析しました。 CHP、DZP-CHP、およびPS-DZP-CHPナノ粒子の液滴を、カーボンコーティングされた銅メッシュ上に配置して、薄い液膜を形成しました。次に、2％（w / v）リンタングステン酸溶液を使用して、フィルムを自然乾燥させた後、サンプルのネガティブ染色を得ました。新たに調製したナノ粒子水溶液をきれいなシリコンウエハーに滴下し、室温で乾燥させた後、JSM-6700F電界放出型走査電子顕微鏡の下に置いて表面構造を観察しました。

ナノ粒子のサイズとゼータ電位

DZP-CHPおよびPS-DZP-CHPナノ粒子のサイズ、多分散係数（PDI）、およびゼータ電位は、動的光散乱（DLS）を使用して分析されました。得られた均質懸濁液の平均粒度とサイズ分布をそれぞれ3回測定しました。

インビトロ薬物放出

ドネペジルの放出は、動的水透析を使用して測定されました。 1ミリグラムのDZP-CHPおよびPS-DZP-CHPナノ粒子を5mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4、濃度0.01 M）に溶解し、透析バッグに移しました。磁気撹拌しながら37°Cの一定温度。 0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72時間の4ミリリットルのPBSを、同じpHの同量のPBSで希釈しました。紫外可視分光光度法を使用して、さまざまな時点での312nmでの透析液の吸光度を検出しました。溶液の含有量は標準曲線で決定され、放出試験はインビトロで３回繰り返された。ドネペジルの放出率は、次の式に従って計算されました。

Cnは、Tn時点でのサンプル濃度μg/ mLです。 Vは、PBS放出溶液の総量（mL）です。 Vnは、Ti時点でのPBS放出液量（mL）です。 Ciは、Ti時点でのドネペジル濃度μg/ mLです。

等温滴定カロリメトリー（ITC）

特定の濃度のPS溶液をCHPナノ粒子溶液に滴下し、熱の変化をITC（vip-itc、Microcal、マサチューセッツ州ノーサンプトン、米国）で測定しました。 CHPナノ粒子溶液には、DZPとCHPの比率が異なる3種類のナノ粒子（1：2、1：5、1：10）が含まれていました。滴定前にすべての溶液を脱気しました。システム全体の温度は25°Cで一定に保たれました。

脳のターゲティングを観察するための動物実験

ICG標識ドネペジルCHPナノ粒子の調製

分析天びんを使用して、400ミリグラムのCHP-DZPと20 mgのICGを秤量し、適切な量のDMSOを添加して、完全に混合および溶解しました。次に、上記で得られた溶液をピペットで透析バッグに滴下し、蒸留水を１時間に１回交換した。 3時間後、蒸留水を2時間ごとに交換し、DMSOが完全に透析されるまで、毎回400〜800mLの蒸留水を48時間追加しました。その後、上記の溶液をピペットでメスフラスコに移して一定の容量を得た後、超音波で2分間処理しました。 0.45μmのフィルターメンブレンでろ過すると、ICG標識DZP-CHPナノ粒子（ICG-DZP-CHP）が生成され、別々に梱包され、将来の使用のために4°Cの冷蔵庫に保管されました。

乳化蛍光ドネペジルCHPナノ粒子の調製

適切な量​​のICG-DZP-CHPを10mLビーカーに入れ、1‰（v / v）ポリソルベート80（PS）乳化剤を添加しました。ビーカーを1時間保持した後、EPチューブに移して100 Wで2分間超音波処理しました。均一なナノ溶液が得られるまで、上記の操作を3回繰り返しました。最後に、ろ過され、ICGで標識された乳化ドネペジル薬物負荷ナノ粒子が得られました（PS-ICG-DZP-CHP）。

APOEのナノ粒子への結合を検証するためのMST実験

すべてのMST実験は、Monolith NT.115システム（201810-BR-N024）で実行されました。すべての溶液は、脱イオン水と分析グレードの試薬を使用して調製しました。緩衝液を調製し、室温で保存した。タンパク質サンプルは使用するまで氷上に置いた[33]。 PS-ICG-CHPナノ粒子（55.6μM）を脱イオン水で40 nMに希釈し、蛍光用にICGをロードしました。 APOE溶液（30μl、55.6μM）を調製し、16本のキャピラリーチューブに1〜16のラベルを付けました。まず、20μlのAPOEをチューブ1に加え、10μlをチューブ2〜16に加えました。次に、10μLの溶液をチューブ1からチューブ2に移し、完全に混合しました。その後、10μlの溶液をチューブ2から取り出し、チューブ3に移しました。この操作を繰り返して、最後に10μLの溶液をチューブ16から取り出し、各チューブの溶液が同じ量になるようにしました。 10マイクロリットルの希釈ナノ粒子を各チューブに加え、完全に混合して測定を開始しました。 MSTテストデータはNT分析ソフトウェアで分析され、KDフィッティングはソフトウェアの指示に従って質量作用の法則に従って実行されました。

脳標的観察のためのinvivo蛍光イメージング技術

それぞれ約18〜22 gの健康な黒マウスのバッチを選択し、PS-ICG-DZP-CHPグループとICG-DZP-CHPグループの2つのグループにランダムに分けました。すべてのマウスに200μlの200μg/ mlの上記グループの薬剤を尾静脈から注射し、0.5時間後、マウスを1％ペントバルビタールナトリウム（50 mg / kg）で麻酔しました。その後、すべてのマウスをライブイメージャの撮影エリアに配置し、イメージングパラメータを励起波長765 nm〜815 nm、吸収波長815 nm〜845 nmに設定して、動物全体の蛍光画像を取得しました。 。画像化後、すべてのマウスを解剖し、腎臓、心臓、脾臓、肺、肝臓、および脳を取り出して、蛍光画像を得た。イメージングパラメータは上記のパラメータと一致していました。

ナノ粒子の組織分布に関する研究

マウスのグループ化とサンプリング

45匹のC57BL / 6マウスをランダムに15のグループに分けました：5つのグループに遊離ドネペジル（遊離グループ）を注射し、5つのグループにドネペジルナノ粒子（ナノグループ）を注射し、別の5つのグループにPS修飾ドネペジルナノ粒子（PSグループ）を注射しました。静脈尾部から0.25mg / kg。次に、注射の1時間後、3時間後、6時間後に採血しました。その後、すべての動物を犠牲にし、心臓、脳、肝臓、および腎臓の組織を収集して細断した。次に、上記の組織0.2 gを正確に秤量し、約1 mlの0.9％NaCl溶液に加え、ホモジナイザー（65 Hz、150秒）でホモジナイズしました。 100マイクロリットルの組織ホモジネートを0.7mLのメタノールを含む1.5mL EPチューブに正確に引き込み、ボルテックスして30秒間混合し、タンパク質を沈殿させた後、12,000r・min ^-1 で遠心分離しました。 10分間。最後に、100μLの上清を分析のために注入ボトルに移しました。

決定方法

最初にHPLCを使用して検査しましたが、感度が十分に高くありませんでした。そのため、フォローアップLC-MS実験を実施しました。これは、強い特異性を示し、薬物の測定に干渉する内因性物質はありませんでした。 LC-MSプロトコルは、生物学的サンプルの測定に関するガイドラインに準拠しています。クロマトグラフィー条件は次のとおりです。移動相A、水（0.1％ギ酸を含む）。移動相B、メタノール（0.1％ギ酸を含む）;アイソクラティック溶出：A30％-B70％;流量、0.3 mL・min ^-1 ;カラム温度、35°C;注入量、10μL。衝突条件は次のとおりです。エレクトロスプレーイオン化源（ESI）温度、150°C。荒廃ガス流量、550L・h ^-1 ;荒廃ガス温度、500°C。陽イオン検出の条件は次のとおりです。毛細管電圧、3kV。コーン電圧、30 V;スキャンモード、マルチプルリアクションモニタリング（MRM）。

細胞実験

細胞培養と継代

PC12およびSH-SY5Y細胞は、10％（v / v）の熱不活化ウシ胎児血清（FBS）および1％（v / v）のペニシリンとストレプトマイシンを添加した高糖DMEMで培養し、5を含むインキュベーターで保存しました。 ％CO ₂ 37°Cで。細胞はさまざまな実験で使用されるか、80％のコンフルエンスに達したらすぐに継代されました。実験の前に、PC12およびSH-SY5Y細胞を、実験スケールに応じて必要な細胞密度でI型コラーゲンプレコートプレートに播種しました。

細胞凍結保存

顕微鏡下で対数増殖期に成長するのが観察された場合、PC12およびSH-SY5Y細胞を凍結し、PBSで2回洗浄し、トリプシン処理して細胞懸濁液を形成し、遠心分離収集のために滅菌遠心分離管に入れました（1000r×min ^{- 1} 、3分）。その後、細胞凍結保存液を添加し、細胞名と日付を記したチューブに細胞を保存しました。細胞を4°Cで1時間、-20°Cで2時間、-80°C（凍結）の冷蔵庫に一晩置き、最後に液体窒素タンクに移しました。

細胞生存率を検出するためのMTTメソッド

細胞生存率は、MTT還元アッセイを使用して測定されました。簡単に説明すると、PC12およびSH-SY5Y細胞を96ウェルプレート（I型コラーゲンでプレコート）に1×10 ⁴ の密度で播種しました。 細胞が各ウェルに付着できるようにするためのcells / mL。 24時間のインキュベーション後、細胞をさまざまな濃度のドネペジルCHPナノ溶液または遊離ドネペジル溶液と2時間プレインキュベートしました。続いて、Aβ25-35（最終濃度20μM）を各ウェルに添加しました。処理した96ウェルプレートを37℃で24時間インキュベートしました。その後、MTT（50μL、5 mg / mL）を添加し、処理した細胞と37°Cで4時間インキュベートしました。最後に、培地を注意深く除去し、ホルマザン結晶を150μLのDMSOに溶解しました。マイクロプレートリーダーを使用して、490nmで吸光度を取得しました。細胞生存率は、治療群の生細胞の割合と未治療の対照群の生細胞の割合として表されます。

細胞上清中のLDH活性の測定

PC12およびSH-SY5Y細胞を、2×10 ⁵ の密度で96ウェル培養プレート（I型コラーゲンでプレコート）に播種しました。 および3×10 ⁵ それぞれ細胞/ mL。 24時間のインキュベーション後、細胞をさまざまな濃度のドネペジルCHPナノ溶液または遊離ドネペジル溶液と2時間プレインキュベートしました。続いて、Aβ25-35（最終濃度20μM）を各ウェルに添加しました。 LDH活性は、キットの説明書に従って測定しました。簡単に説明すると、培地を含む培養細胞を収集し、3500rpmで遠心分離しました。上澄み（50μL）を等量の反応物と混合して、LDH反応を開始した。マイクロプレートリーダーを使用して450nmで吸光度を取得し、LDH活性を計算しました。

アポトーシスの形態を観察するためのAO / EB染色法

AO / EB蛍光色素を使用して、アポトーシス細胞の特性を評価しました。 PC12およびSH-SY5Y細胞を、3×10 ⁵ の密度で黒色の12ウェル培養プレート（I型コラーゲンでプレコート）に播種しました。 および4×10 ⁵ それぞれ細胞/ウェル。 24時間のインキュベーション後、細胞をさまざまな濃度のドネペジルCHPナノ溶液または遊離ドネペジル溶液と2時間プレインキュベートしました。続いて、Aβ25-35（最終濃度20μM）を各ウェルに添加しました。処理後、キットに従って手術を行った。実験中、光は避けた。最後に、細胞の形態が観察されました。

ミトコンドリア膜電位を検出するためのローダミン123染色法

MMPは、ローダミン123（Rh123）蛍光色素を使用して測定されました。これは、細胞透過性のカチオン色素であり、その非常に負の特性のためにミトコンドリアに優先的に分布します。 PC12およびSH-SY5Y細胞を、2×10 ⁵ の密度で黒色の24ウェル培養プレート（I型コラーゲンでプレコート）に播種しました。 および3×10 ⁵ それぞれ細胞/ウェル。 24時間のインキュベーション後、細胞をさまざまな濃度のドネペジルCHPナノ溶液または遊離ドネペジル溶液と2時間プレインキュベートしました。続いて、Aβ25-35（最終濃度20μM）を各ウェルに添加しました。処理後、細胞をPBSで洗浄し、10μg/ mLのローダミン123とともに、37°C​​の暗所で30分間インキュベートしました。インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光プレートリーダーを使用して488nmと510nmで蛍光強度を測定しました。

統計的処理とデータ分析

すべての実験は3回繰り返され、結果は平均±標準偏差として表されます。 GraphPad Prism統計ソフトウェアを使用し、一元配置分散分析、Student's t 統計分析には、テストおよびその他の方法が使用されました。 P <0.05は、差が統計的に有意であることを示します。

結果

ナノ粒子の特性

CHPは自己凝集して、疎水性コアを備えたナノ粒子を形成します。これにはDZPをロードできます。薬物とナノ材料の比率が1：2、1：5、および1:10のDZPをロードしたCHPナノ粒子（DCN）は、DCN1、DCN2、およびDCN3と名付けられました。走査型電子顕微鏡の結果によると、CHPナノ粒子は球形の構造を示し、DZPをロードした後、図1に示すように、DCNも球形になりました。CHPナノ粒子の平均サイズとゼータ電位は257±3.05nmと-2.81でした。それぞれ±0.27mV。 DZP負荷後、平均サイズは273±3.72、260.7±1.76および266.8±4.56 nmであり、ゼータ電位はそれぞれ-6.20±0.40、-5.75±0.64および-9.30±0.64および-9.30±0.39mVでした。 、表1に示すように、薬物捕捉率は42.00±5.65％、86.54±1.31％、59.71±4.43％、薬物負荷率は12.02±1.90％、13.42±2.03％、7.40±±でした。それぞれ。

走査型電子顕微鏡画像（ a 、a-CHP、b-DCN1、c-DCN2、d-DCN3）、サイズ分布（ b a-CHP、b-DCN1、c-DCN2、d-DCN3）およびゼータ電位（ c ナノ粒子のa-CHP、b-DCN1、c-DCN2、d-DCN3）

ITC測定

DCNの場合、反応プロセス全体で、反応は主に上向きのピークを示し（図2）、上向きのピークは熱放出反応を示しているため、反応は吸熱反応でした。したがって、PSはDCN表面に自発的に吸着することができます。 PSアフィニティは（14.7±2.76）×10 ⁴ でした。 M ^-1 、（29.8±1.66）×10 ⁴ M ^-1 および（36.7±3.84）×10 ⁴ M ^-1 、およびPSカバレッジの程度は、DCN1、DCN2、およびDCN3でそれぞれ2.65±0.193、2.70±0.372、および1.49±0.434でした。この結果は、PSがDCN表面に高い親和性で吸着し、DCN2の被覆量が多かったことを示しています。 ∆H > 0および ∆S > 0は、3つの粒子が主にPSとの疎水性相互作用を介して結合したことを示します。

a へのPS（0.9 mM）滴定の等温熱量測定データ DCN1、 b DCN2および c 25°CでのDCN3（0.02 mM）ソリューション。 NP溶液への滴定後のナノ粒子（NP）とのPS結合のカバレッジ、親和性（KA）、エンタルピーおよびエントロピーの変化の程度

3つのナノ粒子タイプの特性評価

透析によって調製されたCHPNPおよびDCNは、均一な球形を示しました（図3a）。上記の研究によれば、以下の実験の対象として、薬物とナノ材料の比率が1：5のDZP-CHPナノ粒子を選択しました。 DZP-CHPナノ粒子の粒子サイズは260.7±1.76nmと比較的均一で、分散指数は0.196±0.019でした。粒子サイズは薬物負荷後も比較的安定していましたが、PS吸着後は335.2±5.46nmに急激に増加しました。 DZP-CHPナノ粒子のゼータ電位は-0.66±0.04mVであり、ポリソルベート80でコーティングした後、ゼータ電位は-2.22±0.86 mVに低下しました（図3b）。

さまざまなナノ粒子の特性評価。 a CHP NPの透過型電子顕微鏡写真、 b DZP-CHP NPの透過型電子顕微鏡写真、 c PS-DZP-CHPNPの透過型電子顕微鏡写真。 B：CHP-DZP NP（供給比1：5）およびポリソルベート80で修飾されたDZP-CHP NP（供給比1：5）の粒子サイズ図とゼータ電位図

ナノ粒子のinvitro薬物放出

結果は、遊離ドネペジルと比較して、DZP-CHPNPおよびPS-DZP-CHPNPが72時間DZPを放出し、明らかな制御放出効果があることを示しました。薬物をロードしたナノ粒子の初期の急速な放出速度は、薬物分子の急速な溶解と放出に起因する可能性があり、その後、速度低下は、溶解と拡散によってのみ影響を受ける可能性がある薬物濃度の低下によって引き起こされる可能性があります。次に、ポリソルベート80でコーティングされたおよびコーティングされていないDZP-CHPNPのinvitro薬物放出を研究した。 PS-DZP-CHP NPの放出が遅い理由は、ポリソルベート80が小さな疎水性分子薬物に強く吸着するためである可能性があります（図4）。

DZP、DZP-CHP NP（1：5）、およびPS-DZP-CHPNPのinvitro薬物放出曲線

ナノ粒子脳ターゲティング効果

ライブ蛍光イメージングテクノロジーを使用した脳ターゲティングの観察

遊離ICGを注射したマウスの脳は蛍光を示さなかったが、PSで乳化したナノ粒子を注射した脳は、尾静脈から注射した後に両方のナノ粒子が脳に到達できたため、非乳化ナノ粒子を注射した脳よりも強い蛍光を示した（図。5a）。これを確認するために、ICG-DZP-CHPおよびPS-ICG-DZP-CHP溶液の静脈内注射の30分後にマウスを解剖し、研究に必要なすべての臓器を除去してから、蛍光イメージングを実行しました。 PS-ICG-DZP-CHPナノ粒子は脳で強い蛍光を示しましたが、他の臓器では観察されませんでした（図5b）。画像は、PSで修飾されたナノ粒子が脳組織で最も強い蛍光を示したのに対し、修飾されていないナノ粒子は弱い蛍光を示したことを示しました。遊離ICGを注射したマウスの脳組織では蛍光は観察されませんでした（図5c）。

異なる溶液を尾静脈から注入した後のinvivo蛍光画像。 a 尾静脈から200μg/ mlのDZP-CHPまたはPS-DZP-CHPナノ粒子を染色としてICGをロードして注入した動物全体の蛍光画像。無料のICGソリューション（蛍光強度×10 ⁹ ）、 b ICG-DZP-CHPナノ粒子（蛍光強度×10 ⁷ ）、 c PSによって修飾されたICG-DZP-CHPナノ粒子（蛍光強度×109）。 b 尾静脈を介してPSによって修飾されたDZP-CHPナノ粒子の注入後のさまざまな臓器の蛍光画像。 c 解剖後の脳の蛍光画像。 d ICG-PS-DZP-CHPナノ粒子を注射したマウスの脳 e PSで修飾されたICG-DZP-CHPナノ粒子を注射されたマウスの脳 f 無料のICGを注射したマウスの脳

マウスにおけるナノ粒子の組織分布

ドネペジルは、PS-DZP-CHPナノ粒子の注射後、さまざまな組織、主に脳に分布していました。ドネペジルは腎臓を介して代謝されるため、特定の時期に腎臓でドネペジルの濃度が非常に高くなります（図6a）。脳内では、遊離ドネペジルの濃度は非常に短時間でピークに達し、その後急速に減少しました。ただし、ドネペジルナノ粒子の濃度は、はるかにゆっくりとピークに達し、その後減少しました。特にPSで修飾されたナノ粒子は、ピークの遅延と保持時間の延長を伴う徐放効果を示しています。明らかに、ナノ粒子は薬物の生物学的利用能を改善しました（図6b）。

a 異なる時点での脳、心臓、肝臓、腎臓におけるドネペジルの濃度。 b 異なる時間に脳組織でPSで修飾された遊離DZP、DZP-CHPナノ溶液およびDZP-CHPナノ溶液の濃度

MSTの結果

MSTの結果は、リガンド濃度の増加に伴って熱サージが定期的に変化し、K _D 値は3.63μMでした。これは、リガンドがターゲットタンパク質に効果的に結合することを示しています。これは、PSがApo Eに結合でき、比較的安定していることを確認します。 PSで表面修飾した後、CHPナノ粒子はApo Eの吸着を促進できます。理論的には、ナノ粒子がApo Eを吸着し、血液脳関門の通過を仲介する可能性があるため、設計したナノ粒子が脳組織を特異的に標的化できることを確認します（図7）。

a 生のMSTデータ。蛍光標識された分子が5秒間観察されました。このとき、赤外線レーザーをオンにし、キャピラリーチューブのごく一部を2〜5℃に加熱しました。分子は温度勾配に沿って移動し、蛍光強度が変化しました。赤外線レーザーをオフにすると、分子は濃度勾配に沿って拡散します。 b 結合曲線は、初期蛍光強度と熱存在下の強度の差によって生成され、曲線は標準の1：1結合モデルに準拠しています

Aβ _25–35 によって誘発される神経損傷モデルの確立

MTTテストを使用して、PC12およびSH-SY5Y細胞の活性に対するさまざまな濃度のAβ25-35の影響を検出しました[図。 8a（i）、図8b（i）]、および結果は、Aβ _25–35 の増加に伴って 濃度、PC12およびSH-SY5Y細胞増殖活性は、正常対照群と比較して徐々に減少しました。 PC12およびSH-SY5Y細胞を20μMAβ _25–35 で処理した場合 、PC12細胞活性は対照群で観察された49.5±3.3％に減少しました（ P <0.01）、SH-SY5Y細胞活性は49.7±0.8％に減少しました（ P <0.01）。 LDHキットを使用して、さまざまな濃度のAβ _25–35 の効果を検出しました。 両方の細胞上清のLDH活性について。比色試験では、Aβ25–35濃度の増加に伴い、両方の上清の活性が徐々に増加することが示されました。 20μMAβ _25–35 で細胞を処理した後 、PC12細胞のLDH放出は、対照群（ P ）の359.3±18.3％に増加しました。 <0.01）、SH-SY5Y細胞のLDH放出は360.0±18.2％に増加しました（ P <0.01）。ローダミン123染色を使用して、さまざまな濃度のAβ _{25 – の効果を検出しました。 35} 両方の細胞株のミトコンドリア膜電位に関する研究[図。 8a（ii）、b（ii）]。この試験は、両方の細胞株のミトコンドリア膜電位が、Aβ _{25 – の増加とともに徐々に減少することを示しました。 35} 濃度（5、10、20、40μmol / L）。 20μMAβ _25–35 による細胞の処理 PC12細胞ミトコンドリア膜電位を対照群の51.3±1.6％に減少させました（ P <0.01）; SH-SY5Y細胞の場合、MMPは対照群の47.9±1.7％に減少しました（ P <0.01）。

異なる濃度のAβ _25–35 の効果 PC12およびSH-SY5Y細胞の損傷について。 a 、 b 異なる濃度のAβ _25–35 の効果 PC12細胞およびSH-SY5Y細胞における細胞生存率、LDH活性および細胞ミトコンドリア膜電位に関する研究（* P <0.05、** P <0.01 vs対照群）。 c 異なる濃度のAβ _{25 – の効果 35} PC12細胞の形態への損傷について： a 対照群、 b Aβ _{25 – 35} （5μM）傷害グループ、 c Aβ _{25 – 35} （10μM）傷害グループ、 d Aβ _{25 – 35} （20μM）傷害グループ、 e Aβ _{25 – 35} （40μM）傷害グループ。 D：異なる濃度のAβ _{25 – の効果 35} SH-SY5Y細胞の形態への損傷について：f-対照群、 g Aβ _{25 – 35} （5μM）傷害グループ、h-Aβ _{25 – 35} （10μM）傷害グループ、i-Aβ _{25 – 35} （20μM）傷害グループ、j-Aβ _{25 – 35} （40μM）傷害グループ

逆蛍光顕微鏡を使用して、さまざまな濃度のAβ _{25 – によって損傷したPC12およびSH-SY5Y細胞の形態学的変化を観察しました。 35} （図8c、d）。対照群のPC12およびSH-SY5Y細胞は、密度が高く、紡錘形で、細胞体がより完全で、突起が長かった。 Aβ _{25 – の濃度として 35} 増加し（5、10、20、40μmol / L）、両方の細胞株の細胞数が徐々に減少し、細胞体がわずかに収縮し、突起が急激に収縮し始めました。 Aβ _{25 – の濃度が 35} 40μmol/ Lに増加すると、突起が大幅に壊れ、ほとんどの細胞が急激に収縮し、形状が不規則になり、一部の細胞が剥がれて溶液中に浮遊しました。

したがって、PC12およびSH-SY5Y細胞を20μMAβ25-35で24時間処理して、神経損傷モデルを確立しました。

薬物をロードしたナノ粒子（DZP-CHP）の神経保護効果

MTTアッセイを使用して、PC12およびSH-SY5Y細胞におけるさまざまな濃度のDZPおよびDZP-CHP（2.5μM、5μM、10μM）の活性を検出しました[図。 9a（i）、b（i）]。テストでは、PC12細胞を20μMAβ25-35のみで処理すると、細胞生存率が対照群の48.4±2.8％に大幅に低下することが示されました（ P <0.01）。ただし、DZPおよびDZP-CHP（2.5μM、5μM、10μM）溶液で前処理した後、PC12細胞の生存率は大幅​​に増加しました。 DZP-CHPグループのPC12細胞の生存率は、DZPグループの生存率よりも高かった（ P <0.05）。同様に、SH-SY5Y細胞を20μMAβ _{25 – で処理 35} 単独では、細胞生存率が対照群の48.5±4.0％に大幅に低下しました（ P <0.01）、DZPおよびDZP-CHP溶液（それぞれ2.5μM、5μM、10μM）で前処理した後、SH-SY5Y細胞の生存率は大幅​​に増加しました。 DZP-CHPグループのSH-SY5Y細胞の生存率は、DZPグループの生存率よりも高かった（ P <0.05）。

Aβ25-35で損傷したPC12およびSH-SY5Y細胞に対するDZP-CHPの効果。 a および b Aβ25-35（＃ P ）によって損傷したPC12およびSH-SY5Y細胞の細胞生存率、LDH活性、およびミトコンドリア膜電位に対するDZP-CHPの影響 <0.05、## P <0.01vsAβ25-35グループ; ▲ P <0.05対DZPグループ）。 c Aβ25-35によって損傷を受けたPC12細胞のアポトーシス形態に対するDZP-CHPの効果。 a-対照群、b-Aβ25-35損傷群、c-DZP（5 µM）、d-DZP -CHP（5 µM）、e-DZP（10 µM）、f-DZP-CHP（10 µM）。 D：Aβ25-35によって損傷を受けたSH-SY5Y細胞のアポトーシス形態に対するDZP-CHPの効果。 g-コントロールグループ、h-Aβ25-35損傷グループ、i-DZP（5 µM）、j-DZP-CHP（5 µM）、k-DZP（10 µM）、l-DZP-CHP（10 µM）。 E：赤/緑の蛍光比

LDHキットを使用して、PC12およびSH-SY5Y細胞から培地へのLDHの放出に対するさまざまな濃度のDZPおよびDZP-CHP（5μMおよび10μM）の影響を検出しました[図。 9a（ii）、b（ii）]。比色測定では、20μMAβ25-35のみに曝露されたPC12細胞からのLDHの放出が、355.1±16.6％（ P ）大幅に増加したことが示されました。 <0.01）。 DZPおよびDZP-CHP（5μMおよび10μM）の存在下では、PC12細胞からのLDH放出が大幅に低下しました。 DZP-CHPグループの効果はDZPグループの効果よりも高かった（ P <0.01）。同様に、20μMAβ25-35に曝露されたSH-SY5Y細胞からのLDHの放出は、357.8±12.5％（ P ）に大幅に増加しました。 <0.01）。ただし、DZPおよびDZP-CHP（5μMおよび10μM）で前処理した後、SH-SY5Y細胞からのLDH放出は大幅に減少しました。 DZP-CHPグループの効果はDZPグループの効果よりも高かった（ P <0.05）。

以前の報告によると、MMPの脱分極はミトコンドリアからのRh123の喪失につながり、それが次に細胞内蛍光の低下につながります。したがって、Aβ25-35、DZP、およびDZP-CHP（5μM、10μM）で処理されたPC12およびSH-SY5Y細胞のミトコンドリア膜電位の変化を特徴づけるために、ローダミン123を検出に使用しました[図。 9a（iii）、b（iii）]。結果は、ローダミン123の蛍光強度が44.3±3.8％（ P ）に大幅に減少したことを示しました。 <0.01）PC12細胞を20μMAβ25-35と24時間インキュベートした後。ただし、DZPおよびDZP-CHP（5μM、10μM）溶液で前処理すると、用量依存的に蛍光強度が大幅に増加し、DZP-CHPグループの効果はDZPグループの効果よりも高かった（ P <0.05）。同様に、SH-SY5Y細胞を20μMAβ25-35で24時間処理した後、ローダミン123の蛍光強度は42.5±4.6％に大幅に減少しました（ P <0.01）。しかし、DZPとDZP-CHP（5μM、10μM）で前処理した後、蛍光強度は大幅に増加し、DZP-CHPグループの効果はDZPグループの効果よりも高かった。

AO-EB二重染色キットを使用して、さまざまな濃度のDZPおよびDZP-CHP（5μMおよび10μM）で処理したPC12およびSH-SY5Y細胞の形態学的変化を検出しました（図9c、d）。 AO-EB二重染色後、生細胞の核は蛍光下で緑色の蛍光を示し、アポトーシス細胞の蛍光はオレンジレッドでした。アポトーシスの程度が高いほど、蛍光は明るくなります。未処理の対照群と比較して、Aβ25-35のみで処理されたPC12およびSH-SY5Y細胞は、高度に凝縮および破壊された核および明らかな細胞損傷などの典型的なアポトーシス特性を示した。ただし、DZPおよびDZP-CHP溶液（5μMおよび10μM）で前処理すると、細胞の損傷が大幅に抑制され、細胞の形態が改善されました。

ディスカッション

ナノ粒子は神経系疾患の効果的な送達媒体であることが示されていますが、その構造と性能の複雑さにより、ナノ粒子の物理化学的特性と生物学的安全性の検出と評価が困難になっています[34、35、36]。したがって、ナノドラッグが設計された後、細胞および動物レベルでのナノ材料の安全性と有効性を検証するための実験が非常に必要です。実験室の初期段階では、PS-DZP-CHPナノ粒子の合成に成功し、薬剤とCHPの最適な投与比率を1：5に設定しました。 PSのアポリポタンパク質ApoBおよびApoEへの安定した吸着により、ナノ粒子の脳標的化は、BBBを透過することによって達成できます[37]。期待される目標は、ナノ粒子が脳に到達した後に分解し始めることです。 DZPが放出され、コリンエステラーゼの濃度が上昇します。 CHPはAβタンパク質の沈着を減らし、脳環境を改善します。ナノ粒子からの持続放出のために投与頻度が減少します[38,39,40,41]。

したがって、この研究では、ナノ粒子の徐放効果を評価するために、invitroでの薬物放出試験を実施しました。遊離DZPと比較して、ナノ粒子は脳内で局所的な持続放出を達成し、PSは血漿タンパク質を吸着してナノ粒子の損失を減らし、放出時間を延長して長いサイクルを達成することができます。 ICG標識DZP-CHPおよびPS-DZP-CHPナノ粒子をラットに注射した後、乳化したナノ粒子は、Tween 80で乳化していないナノ粒子よりも脳内で強い蛍光を示しました。臓器生検後、さまざまな臓器の蛍光イメージングにより、脳のみが提示されたことが明らかになりました。強い蛍光を発しましたが、他の臓器はそうではありませんでした。これは、ナノ粒子が脳に到達するまで薬物を放出しなかったことを示しています。これは、期待される目標を達成しました。さらに、ポリソルベート80で修飾されたナノ粒子はApoEを表面に吸着し、低密度リポタンパク質をシミュレートして、内皮細胞の表面のリポタンパク質受容体に結合し、LDLR誘導によって脳に入ります[42、43]。さらに、ナノ粒子が内皮細胞間の密着結合を調節し、P糖タンパク質を阻害するメカニズムは、脳実質への経細胞輸送に相乗効果をもたらす可能性があります[44]。ただし、ポリソルベート80は、低血圧、呼吸困難、ショックなどの有害な反応を引き起こす有毒物質を生成する傾向があるため、投与量を厳密に制御する必要があります[45、46]。中枢神経系疾患の治療のために多数のナノドラッグが開発されていますが、そのほとんどは効果が低いことが示されています[4]。この研究では、脳に対するナノ粒子の保護効果を評価するために、AD患者の脳モデルを構築しました。神経細胞に対するAβタンパク質の毒性は濃度によって異なるため、AD患者の脳環境をより適切にシミュレートするには、適切な濃度をスクリーニングすることをお勧めします。モデルは、Aβ25-35によって誘発されるPC12およびSH-SY5Y細胞損傷に対するDZP-CHPの保護効果を調査するために、事前にDZPおよびDZP-CHPナノソリューションで処理されました。結果は、両方の溶液がAβ25-35によって引き起こされる細胞増殖活性を改善し、LDH放出が低下し、ミトコンドリアの可能性が上昇したことを示しました。 Aβ25-35によって誘発される細胞損傷に対するDZP-CHPナノ溶液の阻害効果は、遊離DZP溶液よりも有意に優れており、10 M DZP-CHPナノ溶液の濃度が最良であることが証明されました。これは、最適なためである可能性があります。薬物濃度アプローチ。

基本的に、この研究は vivo におけるナノ粒子の活性プロセスを推定しました 、PS-DZP-CHPナノ粒子が強力な脳ターゲティング、優れた徐放効果、および優れたAD治療効果を持っていることを検証し、臨床的に有望なナノ薬物であることを示しています。脳を薬で治療することの難しさは、研究者にとって常に大きな問題でした。 BBBは、パーキンソン病、脳腫瘍、脳卒中などの中枢神経系疾患の治療を困難にします[47]。 PS-DZP-CHPナノ粒子は、BBBを破壊することなく効果的に通過させることができ、DZPはモデル薬物として置き換えることができます。 vivo での脂溶性が高く、溶解性が低い他の薬物をロードする NPの疎水性中心に入ると、脳のターゲティングが向上するだけでなく、薬物の水溶性も向上します。さらに、CHPナノ粒子溶液の設計は単純であり、疎水性中心の薬剤投与量を柔軟に制御して、細胞毒性を最小限に抑えながら最高の治療効果を確保できます[48、49]。今後の作業では、 vivo で実施します 薬物代謝や副作用の評価など、DZP-CHPナノ粒子に関する研究。これらの研究は、脳のドラッグデリバリーのための新しい戦略を提供し、AD治療を伴うナノドラッグの臨床応用に有利です。

結論

DZP-CHPナノ粒子は、1：5の最適な薬物対ナノ材料の投与比を示しました。これにより、PSの適用範囲と薬物の負荷が高くなりました。 PS吸着を伴うDZP-CHPナノ粒子は、徐放と有意な脳標的化を示しました。 PSによるナノ粒子の表面修飾は、Apo Eの吸着を促進する可能性があるため、脳のターゲティングに不可欠です。 DZP-CHPナノ粒子は神経毒性に対して保護効果があり、遊離ドネペジルよりも優れていました。

データと資料の可用性

該当なし。