多剤耐性胃癌に対する相乗的化学療法のためのパクリタキセルとP-gp輸送阻害剤をロードしたPD-L1モノクローナル抗体で装飾されたナノリポソーム

はじめに

単一の薬剤レジメンに基づく現在の化学療法治療は完全にはほど遠いものであり、高用量で重篤な副作用に苦しみ、同時に薬剤耐性の発生につながります[1]。過去10年間で、癌治療における併用薬レジメンの高い治療効果が見られました[2]。 2つ以上の薬剤の組み合わせは、併用薬の異なる薬理作用により、相乗的な抗がん効果をもたらすことが実証されています[3、4]。ただし、薬物の適切な組み合わせの選択は、癌細胞の種類、親水性/疎水性薬物、生化学的活性、および薬物の薬物動態パターンを含む複数の要因に依存します。とりわけ、薬物の組み合わせは特定の種類の癌に選択的です[5]。

胃がんは世界的な健康上の負担であり、世界で2番目に多いがん関連死の原因です。胃がんの有病率は、日本、韓国、中国などの東アジアで高く、後者は世界で最も高い死亡率を報告しています[6]。中国では平均して毎年40万人の新規症例が登録されており、ほとんどの症例は進行/後期段階で診断されています[7、8]。治療戦略は目覚ましい進歩を遂げました。しかし、それは生存率を改善せず、治療の失敗をもたらしました。治療の失敗は、主に化学療法抵抗性の発現と化学療法用量の重度の毒性、および胃癌エピソードの再発に起因していました[9]。したがって、治療効果を改善し、胃癌の転移と再発を克服するための緊急の課題があります。

パクリタキセル（PTX）は、胃がんの治療に適応となる重要な薬剤の1つです[10]。 PTXは微小管の分解を妨害することにより細胞複製を阻害し、それにより細胞周期の停止を引き起こします。しかし、多剤耐性（MDR）の獲得は、化学療法の成功の間の大きな問題です[11、12]。 p糖タンパク質（p-gp）が豊富な因子であると考えられているATP結合カセット（ABC）ファミリーの膜貫通トランスポーターによって媒介されるATP依存性の流出は、胃の癌で過剰発現しています[13]。他の方法では、PTXはp-gp受容体の基質として機能し、薬物の流出により細胞内の薬物濃度が低下し、有効性が低くなり、耐性が高くなります[14]。この点で、タリキダール（TQD）は強力な第3世代p-gp阻害剤であり、いくつかの癌細胞でp-gp受容体の過剰発現を逆転させることが報告されています[15、16]。ただし、報告によると、TQDの投与は、正常な生理学的システムのp-gp機能を妨げるため、早期に終了する必要があります。 P-gpの発現は、血液脳関門（BBB）を維持し、正常組織から毒素を除去するために必要です[17]。 p-gpは正常組織に存在し、細胞毒素に対するバリアとして機能するため、PTXまたはTQDの非特異的阻害は、正常な生理学的機能を妨害し、有害な毒性を引き起こす可能性があります。さらに、PTXとTQDは親油性が高く、水溶液や全身の血液への溶解度が限られているため、体内の胃がんを標的とした安定したドラッグデリバリーシステムが必要です[18]。

ドラッグデリバリーシステム（DDS）は、癌組織内のカプセル化された薬物の濃度を大幅に増加させ、長期間にわたって薬物の持続放出を提供しました[19]。この点で、リポソームは、癌の治療効果を改善するために広く使用されている薬物担体の1つです。リポソームは、その生体適合性、構造表面修飾、親水性/親油性薬物負荷、および高い薬物負荷容量のためにますます重要性を増しています[20]。薬物はリポソームの脂質二重層に安定して組み込まれ、強化された透過性と保持（EPR）効果によって容易に長い循環能力（PEG化）を与えることができます[21]。最近、リポソームは、静脈内投与後に複数の薬物比を保持する能力が報告されています[22]。このアイデアは、白血病の治療にシタラビン：ダウノルビシンの比率を含むVyxeos®（リポソーム製剤）がFDAの承認を受けた後、2017年に実証されました[23]。非標的製剤と比較して、リガンド標的製剤は非常に魅力的で前向きでした。この点で、PD-1は免疫系のダウンレギュレーションで知られる細胞表面受容体であり、T細胞の炎症活性を抑制します。 PD-L1の発現は、PD-L1をナノ粒子内在化の標的受容体として製造している胃癌患者の50％で報告されています[24、25]。 PD-L1モノクローナル抗体（mAb）は、PD-L1タンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する可能性があり、抗がん効果を改善するための優れた治療戦略となる可能性があります[26]。

本研究の主な目的は、胃癌に対する抗癌効果を高めるために、併用薬、PTXおよびTQDの送達を改善することでした。この目的のために、PTXおよびTQDをロードしたPD-L1 /ナノリポソームを処方し、invitroおよびinvivo条件での抗​​がん効果を評価しました。インビボでの有効性は、胃癌細胞ベースの異種移植モデルで評価され、免疫組織化学（IHC）が実施されました。

結論

結論として、私たちの仕事は、プログラムされた送達戦略によるMDR腫瘍に対する併用療法を実現しました。多剤耐性SGC7901 / ADR異種移植腫瘍の腫瘍負荷を阻害する上で、PTXとp-gp阻害剤（TQD）の組み合わせの可能性を実証しました。多機能ナノキャリアでのPTXとTQDの同時送達により、同時充填された抗がん剤のレシオメトリック制御が可能になり、p-gp排出ポンプが阻害され、相乗的な抗がん効果が示されました。抗がん剤とp-gp阻害剤の併用は、薬剤耐性腫瘍の治療に向けた潜在的な方向性を提供できると信じています。

材料と方法

PD-L1mAb結合PTX / TQDをロードしたナノリポソームの処方

卵ホスファチジルコリン（EPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N- [メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（ DSPE-PEG）、およびDSPE-PEG2000-マレイミド（DSPE-PEG2000-Mal）を、PTXおよびTQDとともに3/2 / 0.5 / 0.25のモル比でクロロホルム溶液に混合し、次に有機溶媒をロータリーエバポレーターを使用して蒸発させた続いて3時間凍結乾燥します。脂質フィルムは、pH7.0に維持された250mM硫酸アンモニウム溶液で水和された。大きな多層リポソームは、65°Cに維持されたバス型ソニケーター（Branson超音波浴、米国）で30分間超音波処理されました。リポソームを大量の蒸留水に対して厳密に1時間透析して、遊離薬物と初期成分を交換しました。リポソームをリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）に再分散させた。 PD-L1 mAbは、8：1（リポソーム：mAb）の比率で混合することによりリポソームに結合させ、4°Cで4時間インキュベートしました。 PD-L1 mAbは、リポソームのC末端マレイミド基に対する抗体のスルフヒドリル残基間で相互作用することにより、DSPE-PEG2000-Malに結合します。 PD-L1結合リポソームを10,000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去してPBSバッファーに再分散させ、さらに分析するまで4°Cで保存しました。リポソームに封入されたPTXおよびTQDの量をHPLC法で評価した。この研究では、AgilentTechnologiesオートサンプラーとG1315Dダイオードアレイ検出器を備えたAgilentTechnologiesHPLCシステムモデル1260Infinityを使用しました。移動相は、1 ml / minの流速で維持されたアセトニトリル/水（70:30 v / v）の混合物で構成されます。 C18カラム（5μm、150×60 mm、ODS-3）を使用してサンプルを溶出し、227nmで検出しました。前に、PTX / TQDをロードしたリポソームをアセトニトリルに溶解し、15分間ボルテックスし、0.45μmフィルターでろ過し、10μlのアリコートをHPLCカラムに注入しました。

サイズ分布と粒子形態分析

薬物を充填した製剤のサイズ分布とゼータ電位は、25°CでMalvern zetasizer（UK）によって決定されました。実際の実験の前に、ナノ粒子分散液を蒸留水で10倍に希釈し、90°の検出角度で3回実験を行いました。ナノ粒子の形態は、透過型電子顕微鏡（TEM）によって評価されました。ナノ粒子分散液を蒸留水で10倍に希釈し、炭素被覆銅グリッドに配置し、IRランプを使用して乾燥させた後、酢酸ウラニルで染色した後、サンプルをTEM（CM 30、Philips（アイントホーフェン、オランダ））で評価しました。 （1％w / v）。

リリースプロファイル分析

ナノリポソームからのPTXおよびTQDの放出プロファイルを透析法によって評価した。この目的のために、PD-L1 mAb結合PTXおよびTQDをロードしたナノリポソーム（PD-PTLP）の凍結乾燥粉末15 mgを1mlの蒸留水に溶解し、透析膜（MWCO 3.5 kDa）に密封し、 30mlのそれぞれの放出緩衝液を37℃に維持した。所定の時間に、サンプルのアリコートを取り出し、等量の放出緩衝液と交換した。研究は72時間続けられた。サンプルを0.22μmシリンジフィルターでろ過し、HPLCカラムに注入し、上記の方法で評価しました。

細胞取り込み研究

SGC7901 / ADR細胞は、5％CO ₂ の条件下で、10％FBSと100 IU / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養しました。 37°Cの雰囲気。共焦点レーザー走査顕微鏡（BX61WI;オリンパス、東京、日本）を使用して、SGC7901 / ADR細胞におけるPTLPおよびPD-PTLPの細胞分布および細胞取り込みを評価しました。この目的を達成するために、1×10 ⁵ 細胞を12ウェルプレートの各ウェルに播種し、18時間インキュベートしました。次に、細胞をPTLPおよびPD-PTLPに曝露し、3時間インキュベートしました。細胞を冷PBSで3回洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で10分間固定した。細胞を再びPBSで洗浄し、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で10分間染色した。最後に、細胞を注意深く洗浄し、CLSM下で観察しました。 PD-PTLPの取り込みに関する競合実験は、細胞を遊離PD-L1 mAbで30分間前処理し、洗浄することによって実施しました。細胞を2つのグループに分けました。1つは遊離PD-L1mAbで処理し、もう1つは遊離PD-L1mAbで処理しませんでした。細胞をPD-PTLPとインキュベートし、3時間インキュベートし、同じ方法で細胞取り込み分析を評価しました。

ウエスタンブロットアッセイによるタンパク質発現

SGC7901 / ADR細胞は、3×10 ⁵ の播種密度で6ウェルプレートに播種されました。 細胞/ウェルおよび18時間インキュベートした。細胞を異なる製剤（PTX、TQD、PTLP、PD-PTLP）で処理し、24時間インキュベートしました。細胞を洗浄し、ストリッピングバッファーで抽出し、標準的な溶解バッファー（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）を使用して溶解しました。細胞を12,000rpmの速度で15分間遠心分離し、上清を収集し、BCAタンパク質アッセイ（Beyotime）を使用してタンパク質の定量を行った。等量のタンパク質を8％SDS-PAGEゲルにロードし、ニトロセルロースメンブレン（EMD Millipore、Billerica、MA、USA）に転写しました。非特異的結合部位を阻害するために、膜を5％スキムミルクで1時間ブロックしました。メンブレンを一次抗体（p-gpおよびGAPDH、1：1000、米国マサチューセッツ州アブカム）とともに4°Cで一晩インキュベートしました。メンブレンをTBSTで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギまたはマウス抗体（ウサギまたはマウス、1：10,000、アブカム、マサチューセッツ州、米国）の二次抗体と室温で再度インキュベートしました。膜を再びTBSTで洗浄した。ブロットは、強化された化学発光法（EMD Millipore）で視覚化されました。

invitro細胞毒性分析

個々の薬物および製剤の細胞毒性効果は、MTTアッセイによって評価されました。簡単に説明すると、癌細胞は1×10 ⁴ の密度で層状になりました。 96ウェルプレートに細胞/ウェルを入れ、18時間インキュベートします。次に、細胞を遊離のPTX、TQD、PTLP、およびPD-PTLPでそれぞれ24時間処理しました。次に、細胞を注意深く洗浄し、15μlの5 mg / ml MTT溶液を加え、さらに3時間インキュベートした後、100μlのDMSOを加えてホルマザン結晶を抽出しました。得られた吸光度は、自動マイクロプレートリーダーを使用して570nmで測定されました。細胞生存率は、テストグループのOD /コントロールのOD×100％で計算されます。組み合わせ指数は、Calcusyn ^TM によって評価されました。 ソフトウェア。すべての実験は3回行った。

invitroアポトーシスと活性酸素種の分析

アポトーシスアッセイでは、癌細胞を2×10 ⁵ の密度で層状にしました。 12ウェルプレートに細胞/ウェルを入れ、18時間インキュベートします。次に、細胞を遊離のPTX、TQD、PTLP、およびPD-PTLPでそれぞれ24時間処理しました。細胞をストリッピングによって抽出し、遠心分離し、ペレットを100μlの結合緩衝液に再分散させた。細胞を5μlのアネキシン-V / FITCと2.5μlのPIワーキング溶液の組み合わせで共染色し、15分間インキュベートしました。染色された細胞は、BD FACS Calibur（BD Biosciences、CA、USA）を使用したフローサイトメーターによって分析されました。アネキシンVとPIは、それぞれ生細胞と死細胞の構造成分に基づく初期アポトーシス指標と後期アポトーシス指標を表しています。

2,7-ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）は、活性酸素種（ROS）分析のプローブとして使用されました。定量分析の場合、1×10 ⁴ 細胞/ウェルを96ウェルの黒い底のプレートに播種し、18時間インキュベートしました。次に、細胞を遊離のPTX、TQD、PTLP、およびPD-PTLPでそれぞれ24時間処理しました。細胞をPBSバッファーで洗浄した後、メーカーのガイドラインに従って1mlのDCFH-DA溶液と30分間インキュベートしました。続いて細胞を溶解し、10,000rpmで15分間遠心分離しました。得られた上清を新しい96ウェルプレートに移し、自動マイクロプレートリーダーを使用して485nmで蛍光を測定しました。同時に、別々の細胞セットを同様の方法で処理し、蛍光顕微鏡（Nikon A1、日本）を使用して画像を観察しました。

異種移植モデルにおけるPD-PTLPの抗腫瘍効果

抗腫瘍効果の研究は、BALB / cヌードマウスで実施され、ハルビン医科大学第4付属病院の実験動物センターから入手しました。すべての動物実験は、実験動物の品質に関する国家基準に従って実施されました。実験は、ハルビン医科大学第4付属病院の実験動物規則委員会のガイドラインに従って厳密に実施されました。動物に1×10 ⁶ を皮下注射した。 マウスの右脇腹にある150μlの培地中のSGC7901 / ADR細胞。腫瘍は100mm ³ まで成長させた。 実際の実験の前に。マウスを均等に５つのグループに分け、各グループに８匹のマウスを入れた。 PTXとTQDの個別投与量は5mg / kgに固定されましたが、組み合わせでは合計投与量5 mg / kgが使用されました。尾静脈注射は3日ごとに行われ、合計3回の注射が行われました。所定の日に、腫瘍体積および体重を測定した。腫瘍体積は、デジタルノギスを使用して腫瘍の最長径と最短径を測定することによって計算されました。腫瘍体積（ V ）=½×長さ×幅（mm） ² 。研究の終わりにマウスを犠牲にし、腫瘍を摘出し、重さを量った。腫瘍を免疫組織化学的（IHC）分析にかけた。腫瘍を抽出し、薄片にスライスし、10％ホルマリン溶液で固定しました。腫瘍をパラフィンワックスに包埋し、メーカーのガイドラインに従ってTUNELアッセイを実施しました。

血清生化学的分析

マウスにはそれぞれの製剤を投与した。 ２４時間後、マウスを犠牲にし、血液サンプルを対照および試験処置動物群から収集した。血清は全血から分離され、さらに分析するまで-80°Cで保存されます。肝臓の性能を評価するために血清生化学的分析を行った。アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）とアラニントランスアミナーゼ（ALT）を測定して、肝機能を評価しました。すべての測定は、生化学的キットアッセイの手順に従って実行されました。

結果と考察

PTX / TQDをロードしたPD-L1結合ナノリポソームの調製と特性評価

PTXはクリニックで広く使用されており、主に胃がんの治療に使用されています。しかし、大多数の患者は、胃癌の多剤耐性（MDR）のために、明らかに治療反応が悪いことに苦しんでいます。 ＰＴＸの用量の増加は、全身毒性の増加をもたらし、それにより、ＭＤＲは、成功した癌治療治療における主要な障害となった。多数のMDRメカニズムの中で、p-gpを介した薬剤流出が主に癌細胞の薬剤耐性の原因であると考えられています[27]。したがって、この研究では、癌細胞のMDR現象を克服し、PTXの抗癌効果を向上させるために、p-gp阻害剤として2番目の薬剤（TQD）を使用しました。相乗効果を発揮する2剤の重量分率を注意深く調べました。抗がん効果を最大化するためには、単一のナノ粒子システムで複数の薬剤を同時送達することが重要です。 2つの薬剤（PTXとp-gp阻害剤）を同時に送達すると、薬剤の流出メカニズムを効率的に抑制し、癌細胞の細胞内濃度が上昇する可能性が高まります[28]。この目的のために、この研究では、体循環で非常に安定していると考えられるナノリポソームの脂質二重層に2つの薬剤をロードしました（図1）。強化された腫瘍特異的ターゲティングを達成するために、ナノリポソームをPD-L1mAbと表面結合させました。ナノリポソームに存在するマレイミド基は、PD-L1 mAbのチオール基と結合し、安定した共有結合を形成します。しかし、マレイミド結合の考えられる制限は、反応が可逆的であるということです。生成物は、血漿中の生物学的チオールとのレトロマイケル付加反応を受け、マレイミドの放出につながる可能性があります。しかし、マレイミド-リポソーム上での抗体の最大表面結合により、このような反応を克服しました。腫瘍標的化リガンドは、腫瘍組織に治療負荷を特異的に送達し、正常組織における不必要な副作用を回避することが報告されています。以前、Patel etal。 p-gp阻害剤をPTXに組み込むと、invitro条件で卵巣癌細胞のMDRを克服できると報告されています[11]。同様に、Zou etal。およびZhangetal。 SKOV-3TRおよびA2780-Adr多剤耐性細胞に対するPTX細胞毒性は、タリキダールの存在下で有意に増加したと報告しました。ただし、これらの研究では、PTX + TQDの物理的な組み合わせが使用されたか、非標的キャリアが開発されました[29、30]。重要なことに、これらの研究はすべて、invitro条件でのみ実施されています。本研究では、比較的新しいクラスのターゲティング剤であるPDL1抗体を使用してターゲットナノキャリアを設計することに焦点を当てました。さらに、本研究は、異種移植腫瘍モデルにおけるPTX + TQDの有効性を実証し、全身毒性に関連する血液パラメーターも評価しました。

PD-L1モノクローナル抗体（mAb）-表面結合ナノリポソームへのパクリタキセルとタリキダールのローディングの概略図。リポソームは、薄い脂質フィルムの水和によって調製され、超音波処理されて、薬物をロードしたナノリポソームを形成しました

PTLPの平均粒子サイズは135.6±1.26nmでしたが、PD-L1 mAb（PD-PTLP）との結合後は168.59±1.34nmに増加しました。 PD-L1 mAbの分子量が大きいため、粒子サイズが大きくなりました。それにもかかわらず、全体のサイズは200 nm未満であり、球形は注目に値する点でした（図2a）。 200 nm未満のナノ粒子サイズは、強化された透過性と保持（EPR）効果により、腫瘍組織でのより高い蓄積を可能にします。その上、PEGの存在は体循環の延長された血液循環時間を可能にします。 PD-PTLPのゼータ電位は22.1±1.21mVであり、血液成分への非特異的結合を許可しません。 PD-PTLPは、両方の薬剤（PTXおよびTQD）で約95％の高い捕捉効率を示しました。 PD-PTLPは、PTXとTQDでそれぞれ12〜14％w / wの高い薬物負荷も示しました（図2b）。

PTX / TQDをロードしたPD-L1結合ナノリポソームの物理化学的特性。 a 透過型電子顕微鏡（TEM）を使用したPD-PTLPの形態分析。 b PD-PTLPの薬物負荷容量。 c pH7.4バッファーおよび37°CでのpH5.0バッファー条件でのPD-PTLPからのPTXおよびTQDのinvitro放出。 ** p <0.01は、pH7.4とpH5.0の緩衝液間の薬物放出の統計的差異です

invitroでの薬物放出

PD-PTLPからのPTXおよびTQDの放出挙動は、37°C​​のpH7.4およびpH5.0の条件で研究されました。図２ｃに示されるように、薬物（ＰＴＸおよびＴＱＤ）の制御放出が、研究期間（７２時間）を通してＰＤ－ＰＴＬＰから観察された。ナノリポソームの厚い二重層からの薬物の放出は、PD-PTLPからの2つの薬物のゆっくりとした持続的な放出の原因である可能性があります。 pH7.4とpH5.0では、PTXとTQDの放出パターンに有意差は見られなかったことに注意する必要があります。より長い時点では、異なるpH条件で放出が観察されたことに大きな違いがあります。ナノリポソームにpH応答性元素が添加されておらず、酸性条件での薬物放出が多いのは、pHが低い場合の拡散が大きいためである可能性があることに注意してください。たとえば、生理学的pH環境での薬物放出の〜55％と比較して、pH 5.0条件で放出されるPTXの〜85％。酸性条件での小分子の急速な放出と塩基性pH条件でのより遅い放出の同様のパターンは、他の研究者によって実証されています。それにもかかわらず、pH 7.4条件での比較的低い薬物放出は、不必要な全身性副作用を減らし、体循環を延長する可能性があり、pH 5.0でのより高い薬物放出は、腫瘍組織でのより高い治療効果に役立つ可能性があります。

invitro細胞取り込み分析

ターゲット（PD-PTLP）および非ターゲット（PTLP）ナノリポソームの送達効率は、SGC7901 / ADRでテストされました。細胞への取り込みは、蛍光トラッカーとしてローダミン-Bを使用して評価されました。 Rhodamine-Bは、細胞生物学的相互作用のない一般的に使用されるフルオロフォアです。核は青色のDAPIで染色され、赤色はナノ粒子に由来します。 CLSMデータは、PD-PTLPが非標的PTLPと比較して癌細胞で強い赤色蛍光を示したことを明確に示しています。 PD-PTLPで処理された癌細胞の赤色蛍光が高いのは、ナノ粒子の内部移行が高いためです（図3a）。 CLSMデータの結果は、細胞膜に発現したPD-L1受容体が、ナノリポソーム表面に結合したPD-L1mAbによって認識されたことを示しています。非特異的または受動的な取り込みメカニズムは、PTLPで処理された癌細胞で明らかでした。 PD-L1ターゲットの特異性は、PD-L1mAb前処理実験によってさらに確認されました。 SGC7901 / ADR細胞をPD-L1mAbで前処理し、30分間インキュベートしました。次に、細胞をPD-PTLPおよびPTLPに曝露し、3時間インキュベートした。示されているように（図3b）、PD-L1 mAbで前処理された細胞は、未処理の細胞と比較して有意に少ない赤色蛍光を示しました。これは、PD-L1 mAbが表面発現受容体によって消費され、結合に利用できる追加の受容体がないことを示しています。内在化により、ナノ粒子の取り込みが少なくなり、内在化が少なくなります。これらのCLSMは、SGC7901 / ADR癌細胞におけるPD-PTLPのターゲティング特異性を明確に示しました。

a PTLPおよびPD-PTLPと3時間インキュベートした後のSGC7901 / ADR細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像。 PD-PTLPと3時間インキュベートした後、PD-L1mAbを使用して/使用せずに前処理したSGC7901 / ADR細胞のCLSM画像。ローダミンBは蛍光トラッカーとして使用され、DAPIは癌細胞の核を染色するために使用されました

デュアルドラッグロードナノリポソームは抗増殖効果を高めます

併用療法では、2つの薬剤（PTXとTQD）の異なる比率を使用して、耐性胃癌細胞に対する相乗効果または相加効果の程度を確立しました。アイソボログラムとコンビネーションインデックス（CI）を計算するために、CalcuSynソフトウェア（Biosoft、バージョン2.1）を使用しました。アイソボログラムプロットは、Chou-Talalay方程式に基づいて説明できます。 CI値は、相乗的（CI <0.9）、相加的（CI =1）、および拮抗的（CI> 1）によって特徴付けられます。示されているように、PTXとTQDのすべての組み合わせ比は、相乗的な作用機序を意味する<1のCI値を示しました（図4a）。具体的には、1 / 0.5（P / T）の重量分率で最大の相乗効果が観察され、TQD重量分率の増加に伴って相乗効果のレベルが低下し、特定の重量分率に2つの薬剤が存在することの重要性を示しています。併用レジメンでのTQDの濃度が低すぎたり高すぎたりしても、最良の相乗効果は得られませんでした。すべてのinvitro実験で、この研究ではP / T =1 /0.5の比率を使用しました。

a SGC7901 / ADRセルにおけるPTXとTQDの異なる重量分率の組み合わせ指数（CI）。組み合わせ指数は、Calcusyn ^TM によって評価されました。 ソフトウェア。 b さまざまな濃度の遊離PTX、TQD、PTLP、およびPD-PTLPで24時間培養した後の、SGC7901 / ADR細胞のinvitro細胞生存率。 c それぞれの製剤で処理した後のSGC7901 / ADR細胞におけるp-gp発現のウエスタンブロット分析。 ** p <0.01および*** p <0.001は、遊離PTXとPD-PTLP治療群の統計的差異です

個別および併用薬のinvitro細胞毒性効果は、24時間のインキュベーション後にMTTプロトコルによって決定されました。図4bに示すように、ブランクNPは細胞生存率に影響を与えず、最終結果への干渉の可能性を排除しました。しかし、PTXとTQDによる単剤療法は、耐性胃癌細胞において濃度依存性の細胞毒性効果を示しました。それは治療において感知できるほどの有効性には及ばなかった。ナノリポソームにカプセル化された第2の薬剤と組み合わせると、単剤の抗増殖効果が著しく改善されました。 PTXとTQDの組み合わせは、個々の薬剤単独の場合と比較して、明らかな相乗効果をもたらしました。 Moreover, PD-L1 mAb-conjugated nanoliposome (PD-PTLP) exhibited the strongest anti-proliferative effect indicating the influence of the targeting ligand on the nanoparticle surface. This enhanced cell killing in the PD-L1-targeted treatment group might be attributed to the high cellular internalization of PD-L1-targeted nanoliposomes by SGC7901/ADR cells consistent with the cellular uptake analysis. The IC50 value of PD-PTLP was 0.76 μg/ml compared to 6.58 μg/ml and 7.64 μg/ml for PTX and TQD, respectively. A ten-fold decrease in IC50 value of PD-PTLP clearly indicates that resistance to PTX in p-gp overexpressing SGC7901/ADR was reversed by TQD. Our in vitro results showed that TQD was effective in reversing the multidrug resistance in SGC7901/ADR cells. Results also showed that nanoliposomes retained the pharmacological actions of encapsulated drugs and released the drug in a controlled manner in the cancer cells. The combination therapy with PTX and TQD enhanced the anticancer efficacy with increased synergistic activity, outperforming the minimal advantages of monotherapy and possible associated side effects. Overall, combination treatment of PTX with an effective p-gp inhibitor in nanoliposome could be a promising strategy to overcome MDR and treat gastric cancers.

In order to evaluate the molecular mechanism, Western blot analysis was performed on SGC7901/ADR. As shown (Fig. 4c), PTX did not have any effect on the p-gp protein expression while on the contrary, TQD significantly downregulated the p-gp expression confirming its pharmacological role as a p-gp inhibitor. Interestingly, combination drug-based PTLP and PD-PTLP showed insignificant difference in protein expression compared to that of TQD-treated cancer cells. The result demonstrated the advantage of loading PTX and TQD (P-gp inhibitor) together in a single nanocarrier system. The Western blot result could be corroborated with the cell viability results where combination of PTX + TQD reversed the MDR and exhibited higher anticancer efficacy in gastric cancer cells.

Apoptosis analysis by flow cytometer

Apoptosis analysis of individual formulation was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining method using flow cytometer. Results of apoptosis are presented in Fig. 5a. A shown, control cells did not show any sign of apoptosis, whereas free PTX and TQD exhibited obvious increase in the apoptosis cells. Combination drug-based PTLP showed two-fold higher apoptosis compared to that of individual drugs indicating the synergistic anticancer effect of the formulations. More importantly, PD-PTLP showed the highest apoptosis of cancer cells with around 60% under apoptosis region. Enhanced apoptosis effect of PD-PTLP was attributed to higher internalization of dual-drug-loaded nanocarriers and synergistic potential of PTX and TQD in a ratiometric manner. The p-gp silencing effect of TQD in combinational regimen enhanced the anticancer effect of PTX in the cancer cells. The apoptosis rate of individual drug was in the range between 20 and 25% while around 60% of apoptosis cells were observed for PD-PTLP-treated cells. The PD-PTLP induced more apoptosis than free drugs and non-targeted liposomes, suggesting that the PD-L1 could deliver PTX/TQD more efficiently to induce apoptosis of the SGC7901/ADR cells.

a Apoptosis assay of SGC7901/ADR cells after staining with Annexin V/PI combo using flow cytometer. The cells were treated with a fixed concentration of 2 μg/ml. b Reactive oxygen species (ROS) analysis of SGC7901/ADR cells using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a probe. *** p <0.001 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP-treated group

Intracellular ROS level determination

We have explored the ability of individual drug and dual drug to affect the redox state of the cancer cells cell by evaluating the level of reactive oxygen species (ROS) in gastric cancer cells. ROS levels in cancer cell were evaluated by DCFH-DA (green fluorescence). Quantitative ROS data are presented in Fig. 5b. As shown, non-treated cells did not have any sign of ROS; however, PTX or TQD did induce appreciable levels of ROS generation. Importantly, TPLP and PD-TPLP triggered a significantly higher levels of ROS compared to that of free PTX or TQD or non-treated control cells. A remarkably higher ROS indicates the potential of PD-TPLP to promote higher apoptosis. Microscopic images corroborate with the quantitative results with brightest and higher intensity green fluorescence compared to untreated or free PTX or TQD treated cancer cells. The higher intensity of green fluorescence is an indication of higher ROS production. Oxidative stress such as ROS is considered to be an important indicator of cellular cytotoxicity. Studies have shown that induction of ROS induce a scores of physiological events including DNA damage, inflammation, and cell apoptosis.

Combination of PTX and TQD inhibited growth in drug-resistant tumors

Finally, therapeutic efficacy and toxicity parameters of formulations were investigated on drug-resistant SGC7901/ADR xenograft tumor model (Fig. 6a). The drugs were intravenously administered at a fixed dose of 5 mg/kg for every 3 days with a total of three injections. The PTX/TQD was administered at a fixed weight fraction of 1/0.5. On the expected line, free PTX and free TQD did not show any inhibitory effect on the growth of MDR tumors, suggesting the fact that the SGC7901/ADR cells manifest drug tolerance on the proliferation of MDR tumors. P-gp inhibitor (TQD) though efficient in inhibiting the drug efflux pumps however does not convert into improved therapeutic outcome. In comparison, combination of PTX + TQD (PTLP) displayed a significant inhibition of growth of drug-resistant tumors. The best antitumor efficacy was observed with PD-PTLP which was three-fold effective compared to control, 2.5 compared to free drugs, and approximately two-fold effective in reducing the tumor burden compared to non-targeted formulations (p <0.05; p <0.001). The final tumor volume of control, free PTX, TQD, PTLP, and PD-PTLP was ~ 2000 mm ³ , ~ 1650 mm ³ , 1625 mm ³ , ~ 1000 mm ³ , and ~ 650 mm ³ 、 それぞれ。 Free drugs were slightly effective during the initial time point; however, they grew the same as that of non-treated control group. Results clearly reveal the potential of combination of PTX + p-gp inhibitor as a unique strategy to effectively control the tumor burden. The extensive tumor suppression in PD-PTLP clearly suggests the greater antitumor efficacy of the targeted formulations group. The tumors were extracted and weighed; tumor weights were consistent with the tumor volume data (Fig. 6b). PD-PTLP-treated mice group showed the smallest tumor compared to any other formulation-treated group (p <0.001). To further verify the inhibitor effect of individual tumors, tumors were subjected to TUNEL assay (Fig. 6c). As shown, PD-PTLP showed the large swaths of apoptosis staining compared to non-treated control or free drugs. PD-PTLP showed apparent apoptosis traits with disorganized cell arrangements. The prominent tumor killing effect of PD-PTLP displays the greater cancer cell inhibition in drug-resistant tumor cells. The excellent efficacy of PD-PTLP was mainly attributed to the presence of targeted ligand (PD-L1 mAb) which binds with the respective receptors and increases the intracellular concentrations. The presence of combination regimen and release in a controlled manner for prolonged time also contributed for its enhanced efficacy. In addition, dense hydrophilic PEG surface corona might offer excellent physical stability to the particles and could potentially avoid the unnecessary protein absorption and avoid rapid clearance. The long circulation and nano-scaled size in turn benefit the higher accumulation of particles in the tumor tissues [31,32,33].

In vivo antitumor efficacy of different formulations against multidrug resistant (MDR) SGC7901/ADR tumors; a tumor volume, b tumor weight analysis, and c TUNEL assay of tumor tissues. The mice were administered with a fixed dose of 5 mg/kg with duration of three times for three administrations. Apoptotic cells wells were evaluated by TUNEL assay. * p <0.05 and **p <0.05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p <0.001 (PTX vs. PD-PTLP)-treated group.

Systemic toxicity analysis

The change in body weight is a good indicator of systemic toxicity. As shown (Fig. 7a), mice treated with free PTX shed ~ 20% of body weight on day 10 which gradually decreased to regain the original body weight toward the end of the study. Loss of more than 5% of body weight is considered to cause severe internal toxicity and 20% of body weight loss is considered a significant adverse effect of free drugs [31]. On the contrary, PTLP or PD-PTLP did not cause any such loss of body and the mice remain healthy throughout the study period indicating the safety index of the nanoliposomes. Delivery system with no systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy is considered to be highly effective in tumor treatment. The safety of nanoparticles was further studied by measuring plasma levels of enzymes. Plasma levels of aminotransferases (AST and ALT) are measured following the 24-h administration of respective formulations (Fig. 7b, c). As shown, free PTX resulted in significant increase (p <0.01) in the levels of AST and ALT while PD-PTLP and PTLP were insignificantly different compared to that of non-treated control. AST is released in serum upon organ damage such as heart, kidney, or liver while ALT is specifically released in case of liver injury [34]. The levels of AST and ALT serves as a specific indicator of organ damage and in this regard PD-PTLP showed to be a safe carrier.

Systemic toxicity analysis of individual formulations in SGC7901/ADR tumors; a mice body weight analysis; b 、 c blood biochemical evaluation of serum levels of AST and ALT as a systemic toxicity parameters. * p <0.05 and **p <0.01 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP treated group

データと資料の可用性

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略語

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

PD-PTLP:

PD-L1 mAb-conjugated PTX and TQD-loaded nanoliposomes

P-gp:

P-glycoprotein

PTLP:

PTX and TQD-loaded nanoliposomes

PTX:

Paclitaxel

TQD:

Tariquidar