PD-L1抗体によるパクリタキセルとP-gp阻害剤の標的ナノリポソーム送達：多剤耐性胃がんの克服

概要

ATP依存性流出トランスポーター（P-糖蛋白（P-gp））に基づく多剤耐性（MDR）は、化学療法治療の成功における主要な障壁のままです。本研究では、薬剤耐性胃がんにおいて、パクリタキセル（PTX）とP-gp特異的輸送阻害剤（TQD、タリキダール）の共送達のための標的送達プラットフォームとして、PD-L1モノクローナル抗体（mAb）共役ナノリポソームの可能性を調査しました。2つの薬剤、PTXとTQDを、コンビネーション化学療法効果の見込みを高めるため、単一の担体に正確な比率で共封入しました。細胞取り込み研究では、PD-L1受容体を過剰発現するSGC7901/ADR細胞において、非標的PTLPよりもPD-PTLPの方が高い内在化効率を示しました。PTX/TQDの重量比1/0.5で最高の相乗効果が観察され、PTXとTQDの組み合わせは単独薬剤と比較して明確な相乗効果をもたらしました。我々のin vitro結果では、TQDがSGC7901/ADR細胞の多剤耐性を逆転させる効果があることが示されました。PD-PTLPのIC50値は0.76 μg/mlで、PTXの6.58 μg/ml、TQDの7.64 μg/mlと比較されました。PD-PTLPは、フリーPTXやTQDと比較して、反応性酸素種（ROS）と細胞アポトーシスのレベルを有意に高めました。さらに、in vivo抗腫瘍研究では、PD-PTLPのコンビネーション化学療法が、薬剤耐性異種移植腫瘍の腫瘍負担を有意に抑制し、末端デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ dUTP ニック エンド ラベリング（TUNEL）陽性細胞が有意に多く見られました。さらに、フリーPTXはASTとALTのレベルを有意に増加させたのに対し、PD-PTLPはコントロールと有意差がなく、安全性指標を示しました。全体として、抗がん剤とP-gp阻害剤の組み合わせが、薬剤耐性胃腫瘍の治療に向けた潜在的な方向性を提供できると考えられます。

はじめに

単一薬剤レジメンに基づく現在の化学療法治療は完璧から程遠く、高用量では深刻な有害作用を引き起こし、同時に薬剤耐性の発達を招きます[1]。過去10年間、がん治療におけるコンビネーション薬剤レジメンの高い治療効果が見られました[2]。2つ以上の薬剤の組み合わせは、コンボ薬剤の異なる薬理学的作用により、相乗的な抗がん効果をもたらすことが実証されています[3, 4]。しかし、適切な薬剤の組み合わせを選択することは、がん細胞タイプ、親水性/疎水性薬剤、生化学的活性、薬剤の薬物動態パターンなど、複数の要因に依存します。何よりも、薬剤の組み合わせは特定のがんタイプに選択的です[5]。

胃がんは世界的な健康負担であり、世界で2番目に多いがん関連死因です。胃がんの有病率は日本、韓国、中国などの東アジアで高く、中国が世界最高の死亡率を報告しています[6]。平均して年間400,000件の新規症例が中国で登録され、ほとんどの症例が進行/後期に診断されます[7, 8]。治療戦略で著しい進歩があったにもかかわらず、生存率の改善には至らず、治療失敗につながっています。治療失敗は主に、化学耐性の発達、化学療法用量の重度の毒性、胃がんの再発に起因します[9]。したがって、治療効果を改善し、胃がんの転移と再発を克服することが喫緊の課題です。

パクリタキセル（PTX）は胃がん治療に適応される重要な薬剤の一つです[10]。PTXは微小管の分解を妨害することで細胞複製を阻害し、細胞周期停止を導きます。しかし、多剤耐性（MDR）の獲得は化学療法の成功における主要な障害です[11, 12]。ATP結合カセット（ABC）ファミリーの膜貫通トランスポーターによるATP依存性流出において、P-糖蛋白（P-gp）が豊富な因子と見なされ、胃がんで過剰発現しています[13]。別の観点から見ると、PTXはP-gp受容体の基質として機能し、薬剤流出により細胞内薬剤濃度を低下させ、低効率と高耐性を招きます[14]。この点で、タリキダール（TQD）は強力な第3世代P-gp阻害剤であり、いくつかのがん細胞でP-gp受容体の過剰発現を逆転させることが報告されています[15, 16]。しかし、報告ではTQD投与は早期に中止しなければならないとされ、正常な生理系のP-gp機能を阻害するためです。P-gp発現は血液脳関門（BBB）の維持と正常組織からの毒素除去に必要です[17]。P-gpは正常組織に存在し、細胞毒素に対するバリアとして機能するため、PTXやTQDの非特異的阻害は正常な生理機能に干渉し、有害な毒性を引き起こす可能性があります。また、PTXとTQDは水溶液と全身血液での溶解性が限られた高親脂性薬剤であり、体内の胃がんを標的とする安定した薬物送達システム（DDS）の必要性を要請しています[18]。

薬物送達システム（DDS）は、腫瘍組織への封入薬剤濃度を有意に増加させ、長期間にわたる持続的薬物放出を提供します[19]。この点で、リポソームはがん治療での治療効果向上のために広く使用される薬物担体の一つです。リポソームは生体適合性、構造的表面修飾、親水性/疎水性薬物封入、高薬物封入容量により重要性を増しています[20]。薬剤はリポソームの脂質二重層に安定して組み込まれ、浸透保持効果（EPR効果）により長循環能（PEG化）を容易に付与できます[21]。最近、リポソームは静脈内投与後に複数の薬剤比率を保持する能力が報告されました[22]。この考えは、2017年のFDA承認後、白血病治療におけるシタラビン:ダウノルビシン比率を含むVyxeos®（リポソーム製剤）で実証されました[23]。非標的製剤と比較して、リガンド標的製剤は非常に魅力的で有望です。この点で、PD-1は免疫系のダウンレギュレーションとT細胞炎症活性の抑制で知られる細胞表面受容体です。PD-L1発現は胃がん患者の50%で報告されており、PD-L1をナノ粒子内在化のための標的受容体としています[24, 25]。PD-L1モノクローナル抗体（mAb）はPD-L1タンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合し、抗がん効果を改善する優れた治療戦略となり得ます[26]。

本研究の主な目的は、コンビネーション薬剤PTXとTQDの送達を改善し、胃がんに対する抗がん効果を高めることです。この目的で、PTXとTQD封入PD-L1/ナノリポソームを調製し、in vitroおよびin vivo条件で抗がん効果を評価しました。in vivo効果は胃がん細胞ベースの異種移植モデルで評価し、免疫組織化学（IHC）を実施しました。

結論

結論として、我々の研究はプログラムされた送達戦略によりMDR腫瘍に対するコンビネーション療法を実現しました。PTXとP-gp阻害剤（TQD）の組み合わせが、多剤耐性SGC7901/ADR異種移植腫瘍の腫瘍負担を抑制する可能性を実証しました。PTXとTQDの多機能ナノキャリアでの共送達により、共封入抗がん剤の比率制御、P-gp流出ポンプの阻害、相乗的抗がん効果の発現が可能となりました。抗がん剤とP-gp阻害剤の組み合わせが、薬剤耐性腫瘍の治療に向けた潜在的な方向性を提供できると考えられます。

材料と方法

PD-L1 mAb共役PTX/TQD封入ナノリポソームの調製

卵ホスファチジルコリン（EPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（DSPE-PEG）、およびDSPE-PEG2000-マレイミド（DSPE-PEG2000-Mal）をクロロホルム溶液中でモル比3/2/0.5/0.25で混合し、PTXとTQDとともにロータリーエバポレーターで有機溶媒を蒸発させ、3時間凍結乾燥しました。脂質膜をpH 7.0に維持した250 mM硫酸アンモニウム溶液で水和しました。大型多重層リポソームを65°Cでバス型ソニケーター（Branson ultrasonicbath、USA）で30分間超音波処理しました。リポソームを大量の蒸留水に対して厳密に1時間透析し、遊離薬剤と初期成分を交換しました。リポソームをリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）に再分散させました。PD-L1 mAbをリポソームと8:1（リポソーム:mAb）の比率で混合し、4°Cで4時間インキュベートして共役させました。PD-L1 mAbは、抗体上のスルフィドリル残基とリポソームのC末端マレイミド基との相互作用によりDSPE-PEG2000-Malに共役されます。PD-L1共役リポソームを10,000 rpmで10分間遠心分離し、上清を除去してPBSバッファーに再分散させ、4°Cで保存しました。リポソームに封入されたPTXとTQDの量はHPLC法で評価しました。Agilent Technologies HPLCシステム モデル1260 Infinity（Agilent TechnologiesオートサンプラーとG1315Dダイオードアレイ検出器装備）を使用しました。移動相はアセトニトリル/水（70:30 v/v）混合物で、流速1 ml/minで維持しました。C18カラム（5 μm、150 × 60 mm、ODS-3）を用いて試料を溶出し、227 nmで検出しました。測定前に、PTX/TQD封入リポソームをアセトニトリルに溶解し、15分間ボルテックス撹拌、0.45 μmフィルターでろ過し、10 μlの分取液をHPLCカラムに注入しました。

粒子径分布と粒子形態解析

薬剤封入製剤の粒子径分布とゼータ電位は、25°CでMalvernゼータサイザー（UK）で測定しました。実験前に、ナノ粒子分散液を蒸留水で10倍希釈し、検出角度90°で3回測定しました。ナノ粒子の形態は透過型電子顕微鏡（TEM）で評価しました。ナノ粒子分散液を蒸留水で10倍希釈し、カーボン コーティング銅グリッドに置き、IRランプで乾燥させ、ウラニル酢酸（1% w/v）で染色後、TEM（CM 30、Philips（Eindhoven、The Netherlands））で評価しました。

放出プロファイル解析

ナノリポソームからのPTXとTQDの放出プロファイルを透析法で評価しました。PD-L1 mAb共役PTXおよびTQD封入ナノリポソーム（PD-PTLP）の凍結乾燥粉末15 mgを1 mlの蒸留水に溶解し、透析膜（MWCO 3.5 kDa）に密封し、37°Cで維持した30 mlの各放出緩衝液に浸漬しました。所定の時間間隔で試料分取液を採取し、同量の放出緩衝液で置換しました。72時間継続しました。試料を0.22 μmシリンジフィルターでろ過し、HPLCカラムに注入し、上記の方法で評価しました。

細胞取り込み研究

SGC7901/ADR細胞を、10% FBS、100 IU/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンを補充したDulbecco改変Eagle培地（DMEM）で、5% CO₂雰囲気、37°Cで培養しました。共焦点レーザー走査顕微鏡（BX61WI；Olympus、Tokyo、Japan）を用いて、SGC7901/ADR細胞でのPTLPとPD-PTLPの細胞分布と細胞取り込みを評価しました。この目的で、1 × 10⁵細胞を12ウェルプレートの各ウェルに播種し、18時間インキュベートしました。細胞をPTLPとPD-PTLPで曝露し、3時間インキュベートしました。細胞を冷PBSで3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド（PFA）で10分間固定しました。再度PBSで洗浄し、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインダール（DAPI）で10分間染色しました。最後に慎重に洗浄し、CLSMで観察しました。PD-PTLP取り込みの競合実験は、フリーPD-L1 mAbで細胞を30分間前処理し洗浄することで実施しました。細胞をフリーPD-L1 mAb処理群と非処理群の2群に分けました。細胞をPD-PTLPでインキュベートし、3時間後に同じ方法で細胞取り込み解析を行いました。

ウェスタンブロット法によるタンパク質発現解析

SGC7901/ADR細胞を6ウェルプレートに3 × 10⁵細胞/ウェルの播種密度で播種し、18時間インキュベートしました。細胞を各製剤（PTX、TQD、PTLP、PD-PTLP）で処理し、24時間インキュベートしました。細胞を洗浄、ストリッピングバッファーで抽出し、標準溶解バッファー（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）で溶解しました。細胞を12,000 rpmで15分間遠心分離し、上清を回収し、BCAタンパク質アッセイ（Beyotime）でタンパク質定量を行いました。同量のタンパク質を8% SDS-PAGEゲルにロードし、ニトロセルロース膜（EMD Millipore、Billerica、MA、USA）に転写しました。膜を5%スキムミルクで1時間ブロッキングし、非特異的結合サイトを阻害しました。膜を一次抗体（P-gpとGAPDH、1:1000、Abcam、MA、USA）で4°Cオーバーナイトインキュベートしました。膜をTBSTで洗浄し、二次抗体（ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ標識抗ラビットまたは抗マウス抗体（ラビットまたはマウス、1:10,000、Abcam、MA、USA））で室温でインキュベートしました。膜を再度TBSTで洗浄しました。ブロットを強化化学発光法（EMD Millipore）で可視化しました。

in vitro細胞毒性解析

個別薬剤と製剤の細胞毒性効果をMTTアッセイで評価しました。簡単に説明すると、がん細胞を96ウェルプレートに1 × 10⁴細胞/ウェルの密度で播種し、18時間インキュベートしました。細胞をフリーPTX、TQD、PTLP、PD-PTLPでそれぞれ24時間処理しました。次に、細胞を慎重に洗浄し、5 mg/ml MTT溶液15 μlを添加して3時間さらにインキュベートし、100 μlのDMSOを添加してフォルマザン結晶を抽出しました。結果の吸光度を自動マイクロプレートリーダーで570 nmで測定しました。細胞生存率は、試験群OD/対照群OD × 100%で計算しました。コンビネーション インデックスはCalcusyn™ソフトウェアで評価しました。すべての実験を3回繰り返し実施しました。

in vitroアポトーシスと反応性酸素種解析

アポトーシスアッセイでは、がん細胞を12ウェルプレートに2 × 10⁵細胞/ウェルの密度で播種し、18時間インキュベートしました。細胞をフリーPTX、TQD、PTLP、PD-PTLPでそれぞれ24時間処理しました。細胞をストリッピングで回収し遠心分離、ペレットを100 μlの結合バッファーに再分散させました。細胞を5 μlのAnnexin-V/FITCと2.5 μlのPI作業液の組み合わせで共染色し、15分間インキュベートしました。染色細胞をフローサイトメーター（BD FACS Calibur、BD Biosciences、CA、USA）で解析しました。Annexin-VとPIは、生細胞と死細胞の構造成分に基づく初期アポトーシス指標と後期アポトーシス指標をそれぞれ表します。

2,7-ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）を反応性酸素種（ROS）解析のプローブとして使用しました。定量解析では、1 × 10⁴細胞/ウェルを96ウェル黒底プレートに播種し、18時間インキュベートしました。細胞をフリーPTX、TQD、PTLP、PD-PTLPでそれぞれ24時間処理しました。細胞をPBSバッファーで洗浄し、メーカーのガイドラインに従って1 mlのDCFH-DA溶液で30分間インキュベートしました。細胞を溶解し、10,000 rpmで15分間遠心分離しました。結果の上清を新しい96ウェルプレートに移し、自動マイクロプレートリーダーで485 nmで蛍光を測定しました。同時に、別の細胞セットを同様に処理し、蛍光顕微鏡（Nikon A1、Japan）で画像を観察しました。

異種移植モデルでのPD-PTLPの抗腫瘍効果

抗腫瘍効果試験はBALB/cヌードマウスで実施し、第4附属病院ハルビン医科大学実験動物センター（ハルビン）から入手しました。すべての動物実験は実験動物品質の国家基準に従って実施しました。実験は第4附属病院ハルビン医科大学実験動物委員会規定に厳密に従って実施しました。動物の右側腹部に1 × 10⁶ SGC7901/ADR細胞を150 μlの培養液で皮下注射しました。腫瘍を100 mm³まで成長させてから実験を開始しました。マウスを8匹ずつ5群に均等に分けました。PTXとTQDの個別用量を5 mg/kgに固定し、コンビネーションでは総用量5 mg/kgを使用しました。尾静脈注射を3日ごとに行い、合計3回投与しました。所定の日に腫瘍体積と体重を測定しました。腫瘍体積はデジタルノギスで腫瘍の最長径と最短径を測定して計算しました。腫瘍体積（V）= ½ × 長径 × 短径² (mm)²。試験終了時にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して重量を測定しました。腫瘍を免疫組織化学（IHC）解析にかけました。腫瘍を抽出し、薄切片にし、10%ホルマリン溶液で固定しました。腫瘍をパラフィンワックスに包埋し、メーカーのガイドラインに従ってTUNELアッセイを実施しました。

血清生化学解析

マウスに各製剤を投与し、24時間後に安楽死させ、対照群と試験処理群から血液サンプルを採取しました。血清を全血から分離し、-80°Cで保存して解析まで待機しました。血清生化学解析を実施し、肝機能を評価しました。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）とアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）を測定し、肝機能を評価しました。すべての測定は生化学キットアッセイの手順に従って実施しました。

結果と考察

PTX/TQD封入PD-L1共役ナノリポソームの調製と特性評価

PTXは臨床で広く使用され、主に胃がん治療に適応されています。しかし、大多数の患者は胃がんの多剤耐性（MDR）により治療反応が不良です。PTX用量の増加は全身毒性の増加を招き、MDRが成功するがん治療の主要な障害となっています。多数のMDRメカニズムの中で、P-gp媒介薬剤流出ががん細胞の薬剤耐性の主因と考えられています[27]。したがって、本研究では第2の薬剤（TQD）をP-gp阻害剤として使用し、がん細胞のMDR現象を克服し、PTXの抗がん効果を改善しました。2つの薬剤が相乗効果を示す重量比を慎重に研究しました。抗がん効果を最大化するため、複数の薬剤を単一ナノ粒子システムで共送達することが重要です。2つの薬剤（PTXとP-gp阻害剤）を同時に送達することで、薬剤流出機構の効率的な抑制とがん細胞内細胞内濃度増加の見込みが高まります[28]。この目的で、ナノリポソームの脂質二重層に2つの薬剤を封入しました。ナノリポソームは全身循環で極めて安定と考えられています（図1）。腫瘍特異的標的化を強化するため、ナノリポソームを表面でPD-L1 mAbと共役させました。ナノリポソームに存在するマレイミド基がPD-L1 mAbのチオール基と結合し、安定した共有結合を形成します。しかし、マレイミド共役の潜在的限界は反応が可逆的であることです：生成物は血漿中の生物学的チオールとレトロ-マイケル付加反応を起こし、マレイミドの放出につながる可能性があります。しかし、抗体をマレイミド-リポソーム表面に最大限共役させることでこの反応を克服しました。腫瘍標的リガンドが治療薬物を腫瘍組織に特異的に送達し、正常組織での不必要な副作用を回避することが報告されています。以前、PatelらはP-gp阻害剤とPTXの組み込みがin vitro条件で卵巣がん細胞のMDRを克服できることを報告しました[11]。同様に、ZouらとZhangらは、タリキダールの存在下でPTXのSKOV-3TRおよびA2780-Adr多剤耐性細胞に対する細胞毒性が有意に増加することを報告しました。しかし、これらの研究ではPTX + TQDの物理的組み合わせまたは非標的担体が使用されていました[29, 30]。重要なことに、これらすべての研究はin vitro条件でのみ実施されています。本研究は、比較的新しい標的剤クラスであるPD-L1抗体を用いた標的ナノキャリアの設計に焦点を当てました。さらに、本研究は異種移植腫瘍モデルでのPTX + TQDの効果を実証し、血液パラメータを評価して全身毒性との関連を調べました。

パクリタキセルとタリキダールのPD-L1モノクローナル抗体（mAb）表面共役ナノリポソームへの封入概略図。リポソームは薄膜水和法で調製し、超音波処理で薬剤封入ナノリポソームを形成

PTLPの平均粒子径は135.6 ± 1.26 nmで、PD-L1 mAbとの共役後168.59 ± 1.34 nmに増加しました（PD-PTLP）。粒子径の増加はPD-L1 mAbの大きな分子量によるものですが、全体サイズが200 nm未満で球形であることは注目に値します（図2a）。200 nm未満のナノ粒子サイズは、浸透保持効果（EPR効果）により腫瘍組織への高蓄積を可能にします。また、PEGの存在により全身循環での長時間血液循環が可能になります。PD-PTLPのゼータ電位は22.1 ± 1.21 mVで、血液成分への非特異的結合を防ぎます。PD-PTLPは両薬剤（PTXとTQD）で約95%の高い封入効率を示しました。PD-PTLPはPTXとTQDそれぞれで12〜14% w/wの高い薬物封入率も示しました（図2b）。

PTX/TQD封入PD-L1共役ナノリポソームの物理化学的特性評価。 a 透過型電子顕微鏡（TEM）によるPD-PTLPの形態解析。 b PD-PTLPの薬物封入容量。 c 37°CでのpH 7.4緩衝液とpH 5.0緩衝液条件でのPD-PTLPからのPTXとTQDのin vitro放出。 **p < 0.01はpH 7.4とpH 5.0緩衝液間の薬物放出の統計的差

in vitro薬物放出

PD-PTLPからのPTXとTQDの放出挙動を、37°CでpH 7.4とpH 5.0条件下で調査しました。図2cに示すように、研究期間（72時間）を通じてPD-PTLPから薬剤（PTXとTQD）の制御放出が観察されました。ナノリポソームの厚い二重層からの薬物放出が、PD-PTLPからの2薬剤の遅い持続的放出の原因である可能性があります。PTXとTQDのpH 7.4とpH 5.0での放出パターンに有意差は観察されませんでした。より長い時点で、異なるpH条件での放出に有意差が観察されました。ナノリポソームにpH応答性要素は添加されておらず、酸性条件での高薬物放出は低pHでの拡散増大に起因する可能性があります。例えば、pH 5.0条件下で約85%のPTXが放出されたのに対し、生理的pH環境では約55%の薬物放出でした。酸性条件での小分子の急速な放出と塩基性pH条件での遅い放出の類似パターンは他の研究者によっても実証されています。それにもかかわらず、pH 7.4条件での比較的低い薬物放出は不必要な全身副作用を減らし、全身循環を延長する可能性があり、pH 5.0でのより高い薬物放出は腫瘍組織でのより高い治療効果に寄与する可能性があります。

in vitro細胞取り込み解析

標的（PD-PTLP）と非標的（PTLP）ナノリポソームの送達効率をSGC7901/ADRでテストしました。細胞取り込みをローダミンBを蛍光トラッカーとして評価しました。ローダミンBは細胞生物学的相互作用のない一般的な蛍光体です。核を青色DAPIで染色し、赤色はナノ粒子由来です。CLSMデータは、PD-PTLPが非標的PTLPと比較してがん細胞で強い赤色蛍光を示すことを明確に示しました。PD-PTLP処理がん細胞でのより高い赤色蛍光は、より高いナノ粒子内在化に起因します（図3a）。CLSMデータの結果は、細胞膜上に発現するPD-L1受容体がナノリポソーム表面に共役されたPD-L1 mAbによって認識されたことを示しています。非特異的または受動的取り込みメカニズムがPTLP処理がん細胞で明らかでした。PD-L1標的特異性は、PD-L1 mAb前処理実験でさらに確認されました。SGC7901/ADR細胞をPD-L1 mAbで前処理し、30分間インキュベートしました。細胞をPD-PTLPとPTLPで曝露し、3時間インキュベートしました。図3bに示すように、PD-L1 mAbで前処理された細胞は非処理細胞と比較して有意に少ない赤色蛍光を示し、PD-L1 mAbが表面発現受容体によって消費され、結合と内在化のための追加受容体が利用できなくなり、ナノ粒子取り込みと内在化が減少したことを示しています。これらのCLSMは、SGC7901/ADRがん細胞でのPD-PTLPの標的特異性を明確に示しました。

a PTLPとPD-PTLPで3時間インキュベート後のSGC7901/ADR細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像；PD-L1 mAbで前処理あり/なし後のSGC7901/ADR細胞をPD-PTLPで3時間インキュベート後のCLSM画像。ローダミンBを蛍光トラッカーとして、DAPIでがん細胞核を染色

二重薬剤封入ナノリポソームが抗増殖効果を増強

コンビネーション療法では、2つの薬剤（PTXとTQD）の異なる比率を使用して、耐性胃がん細胞での相乗効果または加算効果の程度を確立しました。アイソボログラムとコンビネーション インデックス（CI）の計算にCalcuSynソフトウェア（Biosoft、Version 2.1）を使用しました。アイソボログラムプロットはChou-Talalay式に基づいて説明できます。CI値は相乗的（CI < 0.9）、加算的（CI = 1）、拮抗的（CI > 1）で特徴付けられます。図示のように、PTXとTQDのすべての組み合わせ比率でCI値 < 1が示され、相乗的な作用機序を意味します（図4a）。具体的には、重量比1/0.5（P/T）で最高の相乗効果が観察され、TQD重量比の増加に伴い相乗レベルが低下し、2つの薬剤が特定の重量比で存在することの重要性を示しています。TQD濃度が低すぎても高すぎても、コンビネーション レジメンで最良の相乗効果は得られません。すべてのin vitro実験でP/T = 1/0.5比率を使用しました。

a SGC7901/ADR細胞におけるPTXとTQDの異なる重量比のコンビネーション インデックス（CI）。コンビネーション インデックスはCalcusyn™ソフトウェアで評価。 b フリーPTX、TQD、PTLP、PD-PTLPの様々な濃度で24時間インキュベート後のSGC7901/ADR細胞のin vitro細胞生存率。 c 各製剤処理後のSGC7901/ADR細胞でのP-gp発現のウェスタンブロット解析。 **p < 0.01および***p < 0.001はフリーPTXとPD-PTLP処理群間の統計的差

個別およびコンビネーション薬剤のin vitro細胞毒性効果を、24時間インキュベーション後のMTTプロトコルで決定しました。図4bに示すように、ブランクNPは細胞生存率に影響を与えず、最終結果への干渉の可能性を排除しました。PTXとTQDの単剤療法は耐性胃がん細胞で濃度依存的な細胞毒性効果を示しましたが、治療における顕著な効果には届きませんでした。ナノリポソームにカプセル化された第2薬剤と組み合わせることで、単一薬剤の抗増殖効果が著しく改善されました。PTXとTQDの組み合わせは、単独薬剤と比較して明確な相乗効果をもたらしました。さらに、PD-L1 mAb共役ナノリポソーム（PD-PTLP）が最も強い抗増殖効果を示し、ナノ粒子表面の標的リガンドの影響を示しました。PD-L1標的治療群でのこの細胞殺傷増強は、細胞取り込み解析と一致するSGC7901/ADR細胞によるPD-L1標的ナノリポソームの高い細胞内在化に起因する可能性があります。PD-PTLPのIC50値は0.76 μg/mlで、PTXの6.58 μg/ml、TQDの7.64 μg/mlと比較されました。PD-PTLPのIC50値の10分の1減少は、P-gp過剰発現SGC7901/ADRでのPTX耐性がTQDによって逆転したことを明確に示しています。我々のin vitro結果は、TQDがSGC7901/ADR細胞の多剤耐性を逆転させる効果があることを示しました。結果はまた、ナノリポソームが封入薬剤の薬理学的作用を保持し、がん細胞で制御された方法で薬剤を放出することも示しました。PTXとTQDのコンビネーション療法は、相乗的活性の増加により抗がん効果を高め、単剤療法の最小限の利点と可能な副作用を上回りました。全体として、効果的なP-gp阻害剤とのPTXコンビネーション治療をナノリポソームで行うことは、MDRを克服し胃がんを治療する有望な戦略となり得ます。

分子メカニズムを評価するため、SGC7901/ADRでウェスタンブロット解析を実施しました。図4cに示すように、PTXはP-gpタンパク質発現に影響を与えませんでしたが、逆にTQDはP-gp発現を有意にダウンレギュレーションし、P-gp阻害剤としての薬理学的役割を確認しました。興味深いことに、コンビネーション薬剤ベースのPTLPとPD-PTLPは、TQD処理がん細胞と比較してタンパク質発現に有意差を示しませんでした。この結果は、PTXとTQD（P-gp阻害剤）を単一ナノキャリアシステムに共封入する利点を示しています。ウェスタンブロット結果は、PTX + TQDの組み合わせがMDRを逆転させ、胃がん細胞でより高い抗がん効果を示す細胞生存率結果と整合します。

フローサイトメーターによるアポトーシス解析

個別製剤のアポトーシス解析を、フローサイトメーターを用いたAnnexin V-FITC/PI染色法で評価しました。アポトーシス結果を図5aに示します。対照細胞はアポトーシスの兆候を示さず、フリーPTXとTQDは明確なアポトーシス細胞増加を示しました。コンビネーション薬剤ベースのPTLPは、個別薬剤と比較して2倍高いアポトーシスを示し、製剤の相乗的抗がん効果を示しました。より重要なことに、PD-PTLPは約60%のアポトーシス領域細胞で最高のがん細胞アポトーシスを示しました。PD-PTLPの増強されたアポトーシス効果は、二重薬剤封入ナノキャリアのより高い内在化と、PTXとTQDの比率制御された相乗ポテンシャルに起因します。コンビネーション レジメンでのTQDのP-gp沈黙効果が、がん細胞でのPTXの抗がん効果を増強しました。個別薬剤のアポトーシス率は20〜25%の範囲でしたが、PD-PTLP処理細胞では約60%のアポトーシス細胞が観察されました。PD-PTLPはフリー薬剤と非標的リポソームより多くのアポトーシスを誘導し、PD-L1がPTX/TQDをより効率的に送達し、SGC7901/ADR細胞のアポトーシスを誘導できることを示唆しています。

a Annexin V/PIコンボで染色後のSGC7901/ADR細胞のアポトーシスアッセイ（フローサイトメーター使用）。細胞を2 μg/mlの固定濃度で処理。 b 2,7-ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）をプローブとして使用したSGC7901/ADR細胞の反応性酸素種（ROS）解析。 ***p < 0.001はフリーPTXとPD-PTLP処理群間の統計的差

細胞内ROSレベル測定

個別薬剤と二重薬剤が、胃がん細胞の酸化還元状態に影響を与える能力を、反応性酸素種（ROS）レベル評価により調べました。がん細胞のROSレベルをDCFH-DA（緑色蛍光）で評価しました。定量ROSデータを図5bに示します。非処理細胞はROSの兆候を示しませんでしたが、PTXまたはTQDは顕著なROS生成を誘導しました。重要なことに、TPLPとPD-TPLPはフリーPTXやTQD、非処理対照細胞と比較して有意に高いROSレベルを誘発しました。著しく高いROSは、PD-TPLPがより高いアポトーシスを促進する可能性を示しています。顕微鏡画像は定量結果を裏付け、未処理やフリーPTX、TQD処理がん細胞と比較して最も明るく高強度の緑色蛍光を示しました。緑色蛍光の高強度は高ROS生成の指標です。ROSなどの酸化ストレスは細胞細胞毒性の重要な指標と考えられています。研究では、ROS誘導がDNA損傷、炎症、細胞アポトーシスなど多数の生理的イベントを誘発することが示されています。

PTXとTQDの組み合わせが薬剤耐性腫瘍の成長を抑制

最終的に、製剤の治療効果と毒性パラメータを薬剤耐性SGC7901/ADR異種移植腫瘍モデルで調査しました（図6a）。薬剤を5 mg/kgの固定用量で3日ごとに静脈内投与し、合計3回投与しました。PTX/TQDを1/0.5の固定重量比で投与しました。予想通り、フリーPTXとフリーTQDはMDR腫瘍の成長に抑制効果を示しませんでした。これはSGC7901/ADR細胞がMDR腫瘍の増殖に薬剤耐性を示すことを示唆しています。P-gp阻害剤（TQD）は薬剤流出ポンプの阻害に効率的ですが、治療成績の改善にはつながりません。比較すると、PTX + TQDの組み合わせ（PTLP）は薬剤耐性腫瘍の成長を有意に抑制しました。最高の抗腫瘍効果はPD-PTLPで観察され、対照と比較して3倍、フリー薬剤と比較して2.5倍、非標的製剤と比較して約2倍の腫瘍負担減少効果がありました（p < 0.05; p < 0.001）。対照、フリーPTX、TQD、PTLP、PD-PTLPの最終腫瘍体積はそれぞれ約2000 mm³、約1650 mm³、1625 mm³、約1000 mm³、約650 mm³でした。フリー薬剤は初期時点ではわずかに効果的でしたが、非処理対照群と同様に成長しました。結果はPTX + P-gp阻害剤の組み合わせが腫瘍負担を効果的に制御するユニークな戦略としての可能性を明確に示しています。PD-PTLPでの広範な腫瘍抑制は、標的製剤群のより高い抗腫瘍効果を強く示唆しています。腫瘍を摘出して重量測定し、腫瘍重量は腫瘍体積データと一致しました（図6b）。PD-PTLP処理マウス群は他の製剤処理群と比較して最小の腫瘍を示しました（p < 0.001）。個々の腫瘍の阻害効果をさらに検証するため、腫瘍をTUNELアッセイにかけました（図6c）。図示のように、PD-PTLPは非処理対照やフリー薬剤と比較して広範なアポトーシス染色を示しました。PD-PTLPは無秩序な細胞配列を伴う明確なアポトーシス特性を示しました。PD-PTLPの顕著な腫瘍殺傷効果は、薬剤耐性腫瘍細胞でのより高いがん細胞抑制を示しています。PD-PTLPの優れた効果は主に、標的リガンド（PD-L1 mAb）の存在により、それぞれの受容体と結合し細胞内濃度を増加させたことに起因します。コンビネーション レジメンの存在と長期間の制御放出も効果増強に寄与しました。また、密な親水性PEG表面コロナが粒子に優れた物理的安定性を提供し、不必要なタンパク質吸着と迅速なクリアランスを回避する可能性があります。長循環とナノスケールサイズが腫瘍組織への粒子蓄積を促進します[31,32,33]。

多剤耐性（MDR）SGC7901/ADR腫瘍に対する各製剤のin vivo抗腫瘍効果； a 腫瘍体積、 b 腫瘍重量解析、および c 腫瘍組織のTUNELアッセイ。マウスに5 mg/kgの固定用量で3回投与。アポトーシス細胞をTUNELアッセイで評価。*p < 0.05および**p < 0.05（PTLP vs. PD-PTLP）、***p < 0.001（PTX vs. PD-PTLP）処理群

全身毒性解析

体重変化は全身毒性の良い指標です。図7aに示すように、フリーPTX処理マウスは10日目に約20%の体重減少を示し、研究終了に向けて徐々に元の体重を回復しました。5%以上の体重減少は重度の内部毒性を引き起こすとされ、20%の体重減少はフリー薬剤の有意な有害作用と見なされます[31]。対照的に、PTLPやPD-PTLPはそのような体重減少を引き起こさず、マウスは研究期間中健康を維持し、ナノリポソームの安全性指標を示しました。全身毒性がなく抗腫瘍効果が増強された送達システムは、腫瘍治療で高効果と見なされます。ナノ粒子の安全性をさらに、酵素の血漿レベル測定で調べました。各製剤投与24時間後にアミノトランスフェラーゼ（ASTとALT）の血漿レベルを測定しました（図7b、c）。図示のように、フリーPTXはASTとALTのレベルを有意に増加させました（p < 0.01）が、PD-PTLPとPTLPは非処理対照と有意差がありませんでした。ASTは心臓、腎臓、肝臓などの臓器損傷時に血清中に放出され、ALTは肝障害時に特異的に放出されます[34]。ASTとALTレベルは臓器損傷の特異的指標であり、この点でPD-PTLPは安全な担体であることが示されました。

SGC7901/ADR腫瘍における各製剤の全身毒性解析； a マウス体重解析； b, c 血液生化学評価：全身毒性パラメータとしての血清ASTとALTレベル。*p < 0.05および**p < 0.01はフリーPTXとPD-PTLP処理群間の統計的差