銀ナノ粒子への曝露後の皮膚の物理的性質を半定量的に決定するためのシステムの開発と評価

要約

化粧品に銀ナノ粒子（nAgs）を安全に使用するには、皮膚内のnAgsの物理的特性を明らかにする必要があります。これらの特性は、経皮吸収の過程で変化する可能性があるためです。この研究では、皮膚のnAgsの物理的特性を決定するために、単一粒子誘導結合プラズマ質量分析（sp-ICP-MS）に基づく分析システムを確立することを目的としました。まず、皮膚サンプルを可溶化するための前処理方法を最適化し、次に、ほとんどのnAgsが粒子の形のままで水酸化ナトリウム処理によって回収されることを示しました。皮膚を表皮と真皮に分離するために、マイクロ波照射のいくつかの条件をスクリーニングしました。 sp-ICP-MS分析では、200 Wを30秒間適用することが最適であることが示されました。これは、この条件により、大部分のnAgsの物理的特性を変えることなくスキン層を完全に分離できるためです。最後に、皮膚をnAgsまたはAg ⁺ に曝露した後のマウスの表皮、真皮、および末梢血中のAgの量と物理的特性を分析することにより、invivoアプリケーションを評価しました。。その後のsp-ICP-MS分析では、nAgsが吸収され、イオン化された形でより深い層に分布する可能性があることが示されましたが、Ag ⁺ 物性を変えることなく吸収・分配されました。この研究は、nAgsへの曝露後の皮膚の反応を包括的に理解するためには、nAgsだけでなくAg ⁺ の分布と粒子サイズを考慮することが不可欠であることを示しています。 nAgsから皮膚に放出されます。

はじめに

ナノテクノロジーの最近の技術的進歩により、100 nm未満の粒子である人工ナノ粒子（ENP）の開発が加速しています。 ENPは、マイクロサイズまたはより大きなサイズの材料と比較して、組織への浸透や表面反応が強化されるなどの有益な特性により、化粧品、食品、医薬品などのさまざまな製品で広く使用されています[1,2,3]。たとえば、ENPの最も一般的なタイプの1つである銀ナノ粒子（nAgs）は、銀イオン（Ag ⁺ ）の安定した放出に起因する抗菌特性のため、化粧品に組み込まれています。）[4、5]。ただし、nAgsの小さな粒子サイズに関連する固有の物理化学的特性は危険な場合があります。これらの粒子は、血液脳関門などの侵入できない障壁を破壊し、炎症を誘発する可能性があることが知られています[6]。さらに、いくつかの研究では、ENPが皮膚バリアを貫通する可能性があることが報告されています[7、8、9]。したがって、これらの粒子の継続使用の安全性を判断するには、皮膚などの組織内のこれらの粒子のダイナミクスを調査することにより、nAgsを含むENPに関連する毒性効果を理解することが重要です。

安全を確保するためには、「ハザード」（潜在的毒性）と「暴露条件」の統合的概念を含む、ENPの使用に伴う可能性のあるリスクを理解することが不可欠です。 ENPの危険性は世界中で分析されていますが、ENPへの暴露に関連する条件を調査した研究はごくわずかです[10]。特に、nAgsとAg ⁺ が報告されています体内でそれらの物理的特性を変えることができます。たとえば、nAgsのイオン化により、粒子サイズが小さいnAgsが形成され、Ag ⁺ が放出されます。 [11]。逆に、小さな粒子サイズのnAgsは、酢酸銀の経口投与後のラットの腸上皮で検出できます[12]。さらに、最近、小さいnAgsやAg ⁺ と比較して報告しました。、より大きなnAgsは、それらのnAgsに曝露された授乳中のマウスの母乳でより容易に発見されます[13]。したがって、nAgsは体内でその物理的特性を変化させる可能性があり、それが次に動態の変化につながります。したがって、関連するリスクを理解するには、これらの粒子の粒子サイズなどの物理的特性を評価し、これらの粒子と体内のイオンを区別する必要があります。

この点で、単一粒子誘導結合プラズマ質量分析（sp-ICP-MS）を適用しました。これにより、滞留時間ごとに最大1つの粒子がアナライザーに導入されます。これは、ピーク速度を介してピーク強度と粒子濃度を分析することにより、粒子サイズを決定するために使用できる効果的な方法です。粒子とイオンは、ピーク信号とバックグラウンド信号の両方を分析することで区別できます[14]。以前、生体サンプル中のsp-ICP-MSの前処理方法を最適化して、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓などのさまざまな臓器のENPの物理的特性を半定量的に測定しました[15]。

皮膚は、角質層（SC）を含む表皮と、血管、リンパ管、神経を含む真皮で構成されています[16]。したがって、各皮膚層へのENPの侵入は、さまざまな程度で毒性を誘発する可能性があります。たとえば、表皮のヒト皮膚ケラチノサイト細胞における二酸化チタンナノ粒子の分布は、活性酸素種の生成を刺激する可能性があります[17]。さらに、無毛マウスでは、二酸化チタンナノ粒子に60日間皮膚暴露すると、局所毒性による真皮の薄層化などの病理学的変化だけでなく、全身毒性による液化壊死などの肝臓の病理学的変化も引き起こされた。真皮の血管を介して広がる[18]。さらに、各層の生物学的応答は、粒子サイズなどの物理的特性、および粒子とイオンの違いによっても異なる場合があります[19]。 nAgsを使用することの安全性を理解するには、皮膚にさらされた後のnAgsの物理的特性と生体内分布を理解する必要があります。

この特定の問題を解決するために、回復中の損失やENPの物理的特性の変化を引き起こすことなく、皮膚を前処理してその層を分離できるアプローチが必要です。しかし、そのような肌への最適なアプローチは考案されていません。

この研究では、sp-ICP-MSを介して皮膚の各層でモデルENPであるnAgsの物理的特性を半定量的に決定する前処理アプローチを最適化し、その後、invivoでの有効性を評価しました。

メソッド

マウス

Slc：ICRマウス（雌、8週齢）はJapan SLC（静岡、日本）から購入しました。マウスは、次の明暗サイクルの部屋に収容された：午前8時に点灯し、午後8時に消灯する。餌と水は、餌のペレットとケージの上部にある給水システムの形で利用できるようになりました。すべての実験プロトコルは、日本の大阪大学の動物研究委員会によって承認された条件下で実施されました。

nAgsとAg ⁺

直径100nmのクエン酸リガンドでキャップされたnAgs（nAg100）の懸濁液は、ストック分散液（1 mg / mL）の形でnanoComposix（San Diego、CA、USA）から購入しました。硝酸銀（AgNO ₃ ）も和光純薬工業（大阪、日本）からストック分散液（1 mg / mL）の形で購入しました。輸送効率を計算するための標準として使用されるRM8013は、米国国立標準技術研究所（Gaithersburg、MD、USA）から購入しました。各タイプのナノ粒子は、使用前に10分間超音波処理されました。ナノ粒子とイオンも、使用前に10秒間ボルテックスしました。

試薬

水酸化ナトリウム（NaOH、0.1 mol / L）は、ナカライテスクカンパニー（大阪、日本）および硝酸（HNO ₃）から購入しました。、70％）は関東化学工業（東京、日本）から購入しました。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7を調製しました。

前処理方法の最適化

各マウスの表皮と真皮を分離し、PBS（ w / v ）と混合しました。 1:10の比率）、および均質化。ホモジネートを100ng / mLnAg100溶液と混合しました。次に、混合物を次の試薬の1つで v / v で処理しました。 1：1の比率; 0.1 mol / L NaOH、70％HNO ₃ 、またはPBS。サンプルを37°Cで3時間インキュベートし、sp-ICP-MSにかけました。

マイクロ波照射による皮膚の分離

各マウスをイソフルラン（和光）で安楽死させた後、2cm ² （2cm×1cm）背部皮膚サンプルは、外科用ハサミとピンセットを使用して切除されました。切除処置中の組織の損傷を防ぐために特別な注意が払われました。電子レンジ（RE-SW-20-H、シャープ、日本）を使用して、2450MHzの周波数で皮膚を照射しました。皮膚サンプルをプレートに置き、電子レンジの中央に置いた。テスト要件に従って、皮膚サンプルをそれぞれ200、600、および900 Wで10、30、および60秒間照射しました。照射後、サンプルを迅速に除去し、外科用ピンセットで穏やかにこすることにより、各表皮と真皮を迅速に分離した。 100 ng / mLのnAg100溶液を使用して、照射（200 W、30秒）後のnAgの回収率と平均直径を分析しました。

nAg100およびAgの経皮投与⁺

９週齢の雌のＳｌｃ：ＩＣＲマウスを、体重に応じて、グループあたり３匹のマウスからなる６つのグループに分けた。マウスはイソフルランを使用して麻酔された。背中の髪の毛は、バリカン（パナソニック®、大阪、日本）とハンドカミソリ（ジレット®、ドイツ）で剃りました。次に、nAg100とAg ⁺ （20μg/ cm ² ）2.25 cm ² の表面積に直接適用されました（1.5cm×1.5cm）背びれと非吸収性プラスチックフィルムでしっかりと覆われています。同じサイズのガーゼをプラスチックフィルムの上に置いた。自己接着性の弾性包帯を使用して、皮膚を包むことによってガーゼを覆い、皮膚を5日間覆ったままにした。

皮膚サンプルと血液の前処理

治療の5日後、分析のために眼窩後静脈叢および背部皮膚から末梢血を採取した。次に、2.25 cm ² （1.5cm×1.5cm）背部皮膚サンプルは、外科用ハサミとピンセットを使用して切除されました。切除中の組織の損傷を防ぐために特別な注意が払われました。表皮を真皮から分離する前に、2cmの粘着テープ（Scotch®、3M）を使用してSC層を順次除去した。テープ片を背部皮膚の治療領域に押し付けた後、一定の圧力を10秒間加えた。各マウスのSC全体を取り除くには、20枚のテープが必要でした。次に、真皮と表皮をマイクロ波照射で分離し、PBS（ w / v ）でホモジナイズしました。 1:10の比率）。採取した血液、および真皮と表皮のホモジネートを、 v / v の0.1mol / LのNaOHで処理しました。 1：1の比率で、37°Cで3時間別々にインキュベートしました。インキュベーション後、血液、表皮、および真皮の混合物中の総銀質量を、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）で分析しました。 nAgsとAg ⁺ の物理的特性の定量化と評価 sp-ICP-MSを使用して実施しました。

銀の総質量の測定

血液、SC、表皮、および真皮サンプル中の総銀濃度を測定するために、Agilent 7700x ICP-MSシステム（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用しました。分析が実行された条件は次のとおりです。RF電力1550W。キャリアガス1.05L / min Ar;滞留時間は100ミリ秒です。 MSモードで測定を3回繰り返した。 Agの内部標準としてロジウムを使用しました。 ICP-MS分析のターゲット要素は¹⁰³ でした Rhと¹⁰⁷ Ag。銀とロジウムの標準液は和光から入手しました。

sp-ICP-MS分析と計算

sp-ICP-MS分析には、Agilent 7700x ICP-MS（Agilent Technologies）を使用しました。分析条件は次のとおりです。RF電力1550W。キャリアガス1.05L / min Ar;滞留時間10ミリ秒;分析時間は30秒です。粒子サイズの計算には、単一粒子計算ツール（Wagenen Food Safety Research（Wageningen University、Wageningen、Netherlands）が発行したRIKILT）を使用しました[20]。

統計分析

すべての統計分析は、Macintosh用のGraphPad Prismソフトウェアバージョン5.0（GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して実施されました。統計的有意性は P に設定されました <0.05。

結果と考察

各スキンレイヤーのnAgsの量と物理的特性を決定するメソッドを構築するための戦略

各皮膚層のnAgの量と物理的特性を決定するには、皮膚サンプルを完全に可溶化し、sp-ICP-MS分析に適したサンプルを準備する必要があります。非経皮吸収nAgは、テープストリッピングによるSCの除去中に除去されることがあるため、回復中の損失やnAgの物理的特性の変化なしに、表皮と真皮を分離することも不可欠です[21]。

皮膚サンプルの可溶化に関しては、NaOH前処理が肝臓、心臓、肺などの動物組織におけるnAgの物理的特性の定量化および分析に最適な手法であることを以前に報告しました。腎臓、および脾臓[16]。したがって、この研究で使用した皮膚サンプルには、NaOH前処理を適用しました。

コラーゲン繊維の軟化と表皮-真皮接合部（EDJ）での分離を促進する酵素消化の強化につながる熱水処理は、皮膚を表皮層と真皮層に分離するために広く使用されています[22]。これらの処理は皮膚層を効率的に分離しますが、層内のnAgは水溶液中でイオン化され、その物理的特性に変化をもたらす可能性があります。マイクロ波照射の短いパルスにより、EDJを破壊する発熱によって皮膚が表皮層と真皮層に分離されることが報告されています[23、24]。そのため、溶液に短時間インキュベーションせずにマイクロ波照射を適用しました。

まとめて、各スキン層でのnAgの回復率と物理的特性の変化を分析することによって検証された戦略（図1に示す）を提案しました。

表皮と真皮のnAg100を検出するための前処理方法の最適化

皮膚サンプルを可溶化するための前処理方法を最適化するために、以前の研究を参照しました。石坂ほか[15]は、NaOHやHNO ₃などのさまざまな種類の可溶化試薬の中で、 NaOH前処理が最適でした。したがって、HNO ₃をテストしましたそれぞれ酸性およびアルカリ性可溶化試薬としてのNaOH。マウス皮膚サンプルから分離された表皮および真皮ホモジネートをnAg100と混合して、100 ng / mLの最終Ag濃度を得た後、37°Cで各可溶化試薬で処理しました。まず、これらの試薬で処理した後のAgの回収率を評価しました。 ICP-MS分析では、NaOHとHNO ₃によってほぼ100％の回収率が達成されたことが示されました。治療のみ（図2a）。次に、各処理による物性の変化を評価するために、各粒子とイオンの回収濃度を分析しました。 sp-ICP-MS分析では、nAg100がHNO ₃によってほぼ完全にイオン化されていることが示されました。。これは、HNO _3、以前の研究[15]でも報告されているように、酸性試薬として、粒子を溶解してイオンに変換しました。対照的に、NaOHで処理されたnAg100の大部分は、イオンとしてではなく、粒子として残っていました（図2b）。したがって、NaOHにより、nAg100の大部分が粒子の形のままになりました。最後に、物性を詳細に分析するために、粒子径の分布を評価しました。 HNO ₃ 処理により、平均粒子径が100nmから40nmに変化しました。これは、nAg100のイオン化に対応します。逆に、NaOH処理後の平均粒子径は約100 nmであり、初期の粒子サイズに対応します（図2c）。これは、NaOH前処理がマウスの皮膚でnAg100を検出するのに最適であることを示唆しています。

マイクロ波照射による皮膚サンプルの表皮と真皮への分離、およびnAgsの回復率と物理的特性の変化の評価

皮膚サンプルを表皮層と真皮層に分離するために、我々の研究に関連し、以前に成功したと報告されたマイクロ波照射のさまざまな条件を適用し[24]、皮膚の分離性と変化に関してそれらの性能を比較しました。物理的特性。 200 Wで10秒間、600 Wで30秒間、600 Wで60秒間、950 Wで30秒間、950 Wで60秒間の条件下では、皮膚が表皮層と真皮層に分離できなかったことが観察されました（図3a）。さらに、皮膚は、200 Wで60秒間、600 Wで10秒間、および950 Wで10秒間の条件下で、表皮層と真皮層に部分的にしか分離されませんでした。対照的に、皮膚は、200 Wで30秒間照射した後、表皮層と真皮層に完全に分離されただけでした。これらの結果は、200Wで30秒間の照射が皮膚層の分離に最適であることを示しています。

この200Wで30秒間のマイクロ波照射がnAg100の物理的特性に影響を与えるかどうかを検証するために、表皮層と真皮層のAgの物理的特性を測定しました。表皮および真皮ホモジネートは、それぞれ100 ng / mLのnAg100と混合され、NaOHを使用して溶解され、200Wで30秒間照射されました。 Sp-ICP-MS分析により、マイクロ波照射で処理されたnAg100の大部分が粒子として残っていることが明らかになり、未処理グループのnAg100も同様でした（図3b）。物性を詳細に分析するために、粒子径分布も評価しました。平均粒子は直径がほぼ100nmであり、これは初期の粒子サイズに対応していました（図3c）。これらの発見は、200 Wで30秒間の皮膚サンプルのマイクロ波照射が、nAg100の物理的特性を変えることなく、皮膚を表皮層と真皮層に効率的に分離するための有望なアプローチであることを示唆しています。

まとめると、これらの結果は、各皮膚層のnAg100の物理的特性を半定量的に決定するシステムの開発に成功したことを示しています。具体的には、この方法は以下を伴う。（i）テープストリッピング法[21]でSCを除去することによる非経皮吸収nAg100の除去。（ii）マイクロ波照射による皮膚の表皮層と真皮層への分離。（iii）NaOH処理による表皮および真皮の可溶化。（iv）sp-ICP-MSを使用した各スキン層のAgの物理的特性の半定量的測定。

nAg100とAgの量と物理的特性を決定することによる実用的な評価⁺ InVivoでのマウススキンレイヤー

このアプローチの実際の適用を評価するために、マウスの皮膚をnAg100とAg ⁺ に曝露した後、表皮と真皮、および末梢血におけるAgの量と物理的特性を分析しました。インビボ。曝露から5日後、前のセクションで説明したように、マイクロ波照射に最適化された条件下で皮膚を表皮と真皮に分離し、NaOHを使用してこれらを可溶化しました。 ICP-MS分析は、Agがすべてのグループのすべての組織（表皮、真皮、血液など）に存在することを示しました。真皮と血液では、Ag ⁺ のAg nAg100に曝露したグループと比較して、曝露したグループは増加する傾向がありました（図4a）。データは、以前に報告されたようにイオンと粒子の両方の形態が経皮的に吸収され分布したが[8、9]、粒子の形態よりもイオンの形態が深部組織層に浸透しやすいことを示唆しました。

次に、nAgとAg ⁺ の比率を評価しました。各サンプルで。 Ag ⁺ で -曝露群では、ほとんどすべてのAgが表皮、真皮、および血液でイオン形態で検出され、Ag ⁺ であることを示しています。物理的性質を変えることなく、経皮的に吸収され、分布された。逆に、nAg100に曝露されたグループでは、表皮と真皮のAgの約70％が粒子の形で存在し、残りのAgはイオン化されていました。さらに、末梢血で検出されたAgはほぼ完全にイオン化されており、粒子形態はほとんど検出されませんでした（図4b）。最後に、主に粒子形態が検出された表皮層と真皮層の粒子サイズを評価しました。 sp-ICP-MS分析により、両方の層で検出された粒子サイズは約70〜80 nmであり、nAg100がイオン化される速度に対応することが明らかになりました（図4c）。これらのデータは、皮膚がnAg100にさらされると、イオン化されている間に吸収されて分布する可能性があることを示唆しています。

以前に報告されたように、ナノ粒子の表面リガンドは皮膚への吸収に影響を及ぼしました[25、26]。たとえば、アミノ基で修飾された金ナノ粒子は、カルボキシル基で修飾された金ナノ粒子がエクスビボ実験であったよりも多く、マウスおよびヒトの皮膚に吸収された[25]。さらに、分子動力学分析は、皮膚浸透能力が中性疎水性から陽イオン性、陰イオン性の金ナノ粒子の順に減少することを示した[26]。この点で、この研究では、nAg100がクエン酸塩で修飾され、負に帯電しているため、nAg100が最初の皮膚バリアである表皮のSCに浸透する可能性が低いと推測されました。したがって、真皮と血液で粒子が観察される理由は、粒子が表皮だけでなく毛穴にも浸透したためである可能性があります。

金ナノ粒子の透過性は、TatやR7などの細胞透過性ペプチドで修飾することによって改善されたことが報告されています[25]。したがって、将来的には、nAgsを皮膚のより深くまで送達するために、同様の変更を検討することができます。さらに、比表面積が大きいほど表面修飾の効果が大きくなるため、nAgsのサイズを小さくする必要がある場合があります。

結論

この研究では、sp-ICP-MSを使用して各皮膚層のnAg100の物理的特性を半定量的に測定する前処理アプローチを開発しました。このアプローチを使用して、皮膚をnAg100に曝露すると、nAg100がイオン化され、吸収され、より深い層に分布する可能性があることを示しました。したがって、nAg100への皮膚の曝露に関連する生物学的反応または毒性を理解するために、nAg100の分布とその粒子サイズだけでなく、Ag ⁺ の粒子サイズも考慮する必要があるかもしれません。皮膚組織に溶けるnAg100から。したがって、このアプローチは、リスク分析に使用できる基本的な手法として有望です。