組織工学における生体適合性を高めるための様々な無機酸ドーピングによるポリアニリン/ポリ乳酸複合ナノファイバーの制御された表面形態

はじめに

細胞外マトリックス（ECM）は、細胞から細胞外間質に分泌される高分子ネットワークの一種です。それは、臓器を伴う細胞、組織、および臓器の基礎を示し、複雑なグリッド構造によって特徴付けられます[1、2]。さらに、それは細胞の生存と活動に適した場所を提供し、それらの形状を決定し、それらの分化を制御し、それらの移動と代謝に参加し、そして最終的にそれらの生存、成長、そして死に影響を及ぼします[3、4]。エレクトロスピニングナノファイバーは、細胞外マトリックスの作用をシミュレートして、比表面積が大きく、適切な機械的特性、および生分解性があるため、細胞の挙動を調節できます。さらに、エレクトロスピニングナノファイバーは、その多孔質構造を維持することに基づいて、表面改質によって多機能にすることができます。したがって、エレクトロスピニングナノファイバーは、薬物送達、整形外科再生、神経再生、および修復に広く適用されている組織工学の有望な候補材料になっています[5,6,7,8,9,10]。

導電性ポリマー（例、ポリピロール[PPy]、ポリチオフェン[PTH]、およびポリアニリン[PANI]）は、invitroおよびinvivoでの生体適合性が良好であり、細胞接着、増殖、分化、および組織再生に大きな影響を与える可能性があります[11,12 、13]。これらの導電性ポリマーの中で、PANIは、その優れた加工性、優れた導電性、優れたレドックス安定性、および生体適合性により、組織工学および再生医療の潜在的な材料であると考えられています[14、15]。電気刺激の下で、PANIは細胞接着、増殖、移動、および分化を調節することができます[16、17]。実際、PANIベースの導電性分解性複合ナノファイバーは電界下での細胞の挙動を促進すると多くの報告が結論付けています[18、19、20、21]。ただし、これには、生理学的環境（pH =7.4）でのPANIの導電率が、PANIが脱ドープされるために弱くなるという重大な問題が伴います。これにより、以前の研究で示されているように、細胞の増殖と分化を促進するという電気的活性の利点が低下します[22]。 。これは、外部電気刺激下の骨組織工学におけるPANIベースの導電性分解性ナノファイバーの限界を明確に示していますが、それでも細胞の増殖と成長を大幅に促進することができます[23、24]。ここでは、PANIの表面形態が複合ナノファイバーの粗さを増加させ、細胞の接着、成長、増殖を促進すると推測しました。

無機酸をドープしたポリアニリンは、一般的に優れた導電性を持っています。ただし、さまざまな無機酸ドーパントによって導入された陰イオンは、ポリアニリンの導電率と構造に影響を与えます[25、26、27]。この論文では、3つの一般的な無機酸、すなわち塩酸（HCl、HA）、硫酸（H ₂ SO ₄ 、SA）、および過塩素酸（HClO ₄ 、ＰＡ）は、ＰＡＮＩのその場酸化重合におけるドーパントとして選択された。次に、PANI /ポリ乳酸（PLA）ナノファイバーの機械的特性、湿潤性、表面形態、生体適合性、および細胞接着を、さまざまな酸ドーパント下で調査しました。結果は、PANIの表面粗さが高いほど、細胞増殖が良好であり、したがって生体適合性が良好であることを示しています。

メソッド/実験

化学薬品

アニリン（AN）は、シグマ、PLA（ M ）から購入しました。 w =60,000）はSolarbioから購入し、ジクロロメタン（DCM）はTianjin Fuyu Fine Chemical Co.、Ltd。から購入し、N、N-ジメチルホルムアミド（DMF）はMacklinから購入しました。一方、過硫酸アンモニウム（APS）は、アラジン、HCl、およびH ₂ から購入しました。 SO ₄ 広州化工進株式会社から購入し、HClO ₄ マックリンから購入しました。

ポリアニリン/ポリ乳酸ナノファイバーの調製

エレクトロスピニングポリ乳酸ナノファイバーの製造

ＤＣＭとＤＭＦの混合溶液（体積比７：３）に特定の質量のＰＬＡ粒子を加えて溶解するまで攪拌し、１０％ＰＬＡの混合溶液を得た。次に、PLA溶液をシリンジに分注し、高電圧電源に接続しました。エレクトロスピニングマシン（DP-30、Tianjin Yunfan Technology Co.、Ltd。）は、15kVの電圧と15cmの距離に設定されました。得られたPLAナノファイバーを40°Cで一晩真空乾燥しました。

さまざまな無機酸をドープしたポリアニリン/ポリ乳酸ナノファイバーの調製

PLAナノファイバーをプラズマ洗浄機チャンバー（PCE-6、MTI Corporation、USA）に配置し、30 WRF電力で2分間放電しました。この論文では、3つの一般的な無機酸、すなわちHCl、H ₂ SO ₄ 、およびHClO ₄ は、PANI / PLAナノファイバーの調製におけるinsitu酸化重合のドーパントとして使用され[24]、対応するPANIナノファイバーはそれぞれPANI-HA、PANI-SA、PANI-PAとマークされ、PANI / PLAナノコンポジットナノファイバーは、それぞれPANI / PLA-HA、PANI / PLA-SA、PANI / PLA-PAとラベル付けされました。 PLAおよびPANI / PLA複合ナノファイバーの調製プロセスを図1に示します。

PLAおよびPANI / PLA複合ナノファイバーの調製プロセスを示す概略図

PANI / PLAナノコンポジットナノファイバーは、氷浴条件下で調製されました[16、28]。 ＡＰＳおよびＡＮは、１：１のモル比に従って１Ｍ酸溶液に加えられた。ここでは、PANI / PLAナノファイバーの調製プロセスを説明するために例としてHClを取り上げます。氷浴条件下で、AN（930 mg、0.01 mol）をAPS（2,280 mg、0.01 mol）に滴下し、50mLの1MHClに溶解しました。すぐに、プラズマで処理されたPLAナノファイバー膜を溶液に浸し、0°Cで2時間撹拌しました。反応後、PLAナノファイバーメンブレンをHClとエタノールで数回洗浄して未付着のPANIを除去した後、40°Cで一晩乾燥させてPANI / PLA-HAナノファイバーを得て、後で使用するために取っておきました。 PANI / PLA-SAおよびPANI / PLA-PA複合ナノファイバーは、同様のアプローチに従って得られました。

特性評価

PLAナノファイバーおよびPANI / PLA複合ナノファイバーの一軸引張試験は、ひずみ-応力試験（島津AGX-PLUS、日本）を介して実施されました。ここでは、引張速度を一定の3mm /分に維持しながら、試験片をダンベルのような形状に切断しました。ヤング率は、応力-ひずみ曲線の0〜15％のひずみ線形領域から計算され、曲線の引張強度と破壊引張速度は、ナノファイバー膜の破壊から決定されました。

ナノファイバー足場の形態は、電界放出走査型電子顕微鏡（FE-SEM）（Hitachi-SU8220、日本）を介して特徴付けられ、さまざまな無機酸がドープされたPANIのさまざまな形態を観察しました。 SEM観察の前に、形態のより明確な観察を可能にするために、ナノファイバーサンプルに金を60秒間スプレーしました。一方、PANI / PLA複合ナノファイバーの表面粗さは、原子間力顕微鏡（AFM、Bruker Dimension Edge）を使用して測定されました。 PANIがPLAナノファイバーに完全にロードされていることを確認するために、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）（Thermo Nicolet iS50）を使用して、2000〜500 cm ^-1 の波長変化を測定しました。 。 X線光電子分光法（XPS; Thermo ESCALAB 250）とAl-KαをX線放射源として使用して、PANI / PLAナノファイバーの表面組成をさらに決定し、それらの湿潤性を接触角分析による周囲温度での水滴（OCA 15 plus、ドイツ）。ナノファイバーの劣化は、質量損失法を使用して評価されました[29、30]。ナノファイバーメンブレンを16mmディスクにカットし、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）20 mLに入れてから、足場を37°Cで7、14、21日間インキュベートし、恒量になるまで乾燥させました。 。

PANI / PLA複合ナノファイバー足場の生体適合性

生体適合性

この論文では、PANI / PLA複合ナノファイバー足場の生体適合性は、ヒト骨肉腫（HOS）細胞活性実験によって特徴づけられました。 HOSセルは、上海の中国科学院のセルバンクから購入しました。 HOS細胞は、10％ウシ胎児血清、100 U / mLペニシリン、および100 U / mLストレプトマイシンを含む低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養した後、37°C​​および5％CO2で培養しました。 。細胞増殖が90％の融合度に達したとき、細胞は1：3の比率で継代されました。

HOS細胞は、細胞増殖試験の前に、PANI / PLAナノファイバーに播種する必要がありました。ここでは、ナノファイバーを96ウェルプレートに配置し、プレートの底を完全に覆った後、UVで30分間、75％エタノール溶液で30分間滅菌しました。次にそれらをPBSで洗浄した。次に、ナノファイバーに1×10 ⁴ を接種しました。 ブランクグループとコントロールグループが同時に設定されている間、ウェル密度。次に、細胞をセルインキュベーター内で37°Cで1、3、および5日間インキュベートし、培地を2日ごとに更新しました。

PANI / PLAナノファイバーの細胞生存率は、3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイを使用して評価されました。 1、3、および5日間のインキュベーション後、培地を96ウェルプレートから取り出し、PBSで3回洗浄した後、10％5 mg / mLMTTを含む1mLDMEMを添加しました。次に、培地を37℃で4時間インキュベートし、次にDMSOを添加してメチルプレドニゾロンを溶解する前に除去した。培地を10分間振動させた後、吸光度を測定しました（BioTek Synergy HTX、USA）。

蛍光免疫染色

HOS細胞をPANI / PLAナノファイバーインキュベーターで24時間インキュベートし、PBSで3回洗浄しました。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した。固定した細胞をPBSで3回（各回10分）洗浄し、10μLの100 nM FITC標識ペプチドを添加してから、細胞を室温で30分間インキュベートした後、PBSで3回（各回5分）洗浄しました。 ）。 HOS細胞の細胞外アクチンを共焦点顕微鏡（タイプA1、ニコン、日本）で染色し、20倍の倍率で細胞染色を観察しました。

細胞接着

ＰＡＮＩ ／ ＰＬＡ複合ナノファイバー足場へのＨＯＳ細胞の接着は、ＳＥＭを介して観察された。ここでは、24時間のPANI / PLAナノファイバーHOS細胞培養後に培地を除去し、4％PFAを添加する前にPBSで3回洗浄しました。培地を4°Cで一晩固定し、PBSで3回洗浄し、勾配エタノール溶液で脱水し（それぞれ、30％、50％、70％、85％、90％、100％、毎回20分）、その後、24時間凍結乾燥しました。 SEM観察の前に、より良い観察を可能にするために、ナノファイバーにプラチナを120秒間スプレーしました。

アルカリホスファターゼ活性（ALP）

ALPは、アルカリホスファターゼ酵素の発現に依存する、一般的に使用される初期骨芽細胞分化マーカーの1つです。ここで、ALP活性は、ALPアッセイキット（Beyotime Biotechnology、P0321S）を使用して実行されました。 HOS細胞は、指定された7日間、さまざまなPANI / PLA複合足場で培養されました。細胞は、0.1％（v / v）トリトンX-100を含む50μLのTris–HCl（0.1 M、pH 8）を使用して溶解しました。 ALP活性は、 p の濃度を定量化することによって分析されます。 - p からのニトロフェノール -ニトロフェニルホスフェート（PNPP）。405nmでの吸光度を記録することで推定されます。 PANI / PLAナノファイバーに沿って培養された細胞のALP活性のパーセンテージは、元のPLAナノファイバーで培養された細胞のALP活性を比較することによって計算されます。

統計分析

結果の統計的有意性は、GraphPad Prism（バージョン8.02）を使用した一元配置分散分析（ANOVA）によって評価されました。ここでは、異なるPANI / PLA複合ナノファイバー足場間の機械的特性、in vitro生分解性、および細胞生存率の違いを分析しました。 p の場合、結果は重要であると見なされました。 <0.05（*）および p の場合に非常に重要 <0.005（∗∗）。

結果と考察

組織工学による足場の機械的特性は、足場が流体力学に耐えられるかどうかを評価する上で重要な指標です。無機酸の存在は、PANIのinsitu化学酸化重合プロセスにおけるPANI / PLA複合ナノファイバーのPLAマトリックスの物理的および化学的特性に影響を与える可能性があります。したがって、無機酸をドープしたPANI / PLA複合ナノファイバーの機械的特性を調査する必要があります。ここでは、PANI / PLA複合ナノファイバーの機械的特性を、応力-ひずみ、ヤング率、引張強度、破断点伸びなど、図2に示す引張試験によって評価しました。図2aに示すように、PLAナノファイバーは線形弾性挙動を示し、PANI / PLA-HAおよびPANI / PLA-SA複合ナノファイバーは明確な降伏挙動を示しましたが、PANI / PLA-PA複合ナノファイバーは弾性変形直後に破損しました。 。 PANI / PLA複合ナノファイバーのヤング率（図2b）は、PLAナノファイバーのヤング率よりも高かった。 PLAと比較して、PANI / PLA-HA、PANI / PLA-SA、およびPANI / PLA-PAの弾性率の増加は、それぞれ53.5±9.09、60.00±9.47、および28.43±8.34MPaでした。引張強さ（図2c）と破壊引張比（図2d）に関しては、PANI / PLA-HAとPANI / PLA-PAは減少しましたが、PANI / PLA-SAはわずかに増加しました。 PANI / PLA-PAの引張強度と破断点伸びは最低でした。 PLAナノファイバーと比較して、PANI / PLA-HAおよびPANI / PLA-PAの引張強度はそれぞれ0.15±0.01および0.64±0.03MPa減少しましたが、PANI / PLA-SAの引張強度は0.13±0.05MPaわずかに増加しました。 PANI / PLA-HAとPANI / PLA-PAの破断点伸びはそれぞれ16.93±1.38％と35.42±3.94％減少しましたが、PANI / PLA-SAの伸びは3.32±0.13％増加しました。

PLAナノファイバーおよびPANI / PLA複合ナノファイバーの機械的特性。 a 代表的な引張応力-ひずみ曲線、 b ヤング率、 c 破断時の引張強度、 d 破断点伸び

図2に示すように、選択した無機酸は、PANIコーティングの接続を通じてPLAナノファイバーの弾性率を高めることができます。 PLAナノファイバーと比較して、引張強度と破断点伸びに関して、PANI / PLA-HAとPANI / PLA-SAの機械的特性はさまざまな程度で変化しましたが、PANI / PLA-PAの機械的特性は最も明確に減少しました。試験中に応力が加えられたため、5秒以内に破壊が発生しました。これらの結果は、HClO ₄ の酸化が原因である可能性があります。 これにより、PLA分子鎖のエステル結合が切断され、カルボキシル基が酸化分解され、機械的特性が低下します[31]。一方、PANI / PLA-HAとPANI / PLA-SAの異なる機械的特性は、HClとH ₂ によってドープされたPANIの異なる密度に関連している可能性があります。 SO ₄ 、反応プロセスへのAPSの導入も、PLAナノファイバーにわずかな影響を与える可能性がありますが、これらの要因の包括的な効果は、さまざまな機械的特性を示します[32]。

細胞接着、増殖、および分化は形態によって影響を受け、粗い表面は一般に細胞接着を助長すると考えられています[33]。 PLAナノファイバーの疎水性は、PANIの均一な重合が障壁となることを意味しますが、プラズマによるPLAナノファイバーの表面処理は湿潤性を大幅に向上させることができます[34]。さまざまな無機酸ドーパントを使用したPANIベースのinsitu重合に続いて、均一な表面堆積を備えたPANI / PLA複合ナノファイバーが得られました。

異なるPANI / PLA繊維の表面のPANI形態は、FE-SEMを介して観察されました（図3）。この図は、PLAナノファイバーの表面が多くの不規則なナノ粒子で覆われており、無機酸をドープしたPANI / PLA複合ナノファイバーが良好な繊維形態と多孔質ナノファイバー構造を維持できたことを明確に示しています。形態観察により、PANI / PLA複合ナノファイバーにPANIが正常にロードされ、細胞接着と増殖の基礎が提供されることが明らかになりました。一方、図4に示すように、AFMを使用してPANI / PLA複合ナノファイバーの表面粗さを測定しました。各サンプルの3つの異なる位置での表面粗さの平均値であるRaは、通常、サンプルの表面粗さを評価するために使用されます。さらに、PANI / PLA複合ナノファイバーのRaはPLAナノファイバーのそれよりも大きく、PANI / PLA-PAのRaが最も高かった。この表面粗さの増加は、表面積と極性を加速し、細胞の成長部位を増やし、細胞接着を促進する可能性があります。

a の形態 PLAナノファイバー、 b PANI / PLA-HA、 c PANI / PLA-SA、および d PANI / PLA-PA複合ナノファイバー

a のAFM画像と表面粗さ（Ra） PLAナノファイバー、 b PANI / PLA-HA、 c PANI / PLA-SA、および d PANI / PLA-PA複合ナノファイバー

細胞接着、遊走、および増殖は、足場の湿潤性によって大きく影響されます[35、36]。一般的に、湿潤性は、足場と水の間の接触角の観点から評価されます。 PLAが疎水性であることを考えると、図5に示すように、1秒以内にナノファイバー膜上の水滴の接触角を測定しました。処理後のPANI / PLAナノファイバーの接触角は大幅に減少することがわかりました。 PLA、PANI / PLA-HA、PANI / PLA-SA、PANI / PLA-PAの対応する接触角は、それぞれ112°、61.6°、36.7°、37.2°でした。 PANI / PLAのPANI形態は、システムの表面エネルギーを増加させ、水との最初の接触で接触面積が増加し、その結果、接触角が減少し、湿潤性が向上しました。複合ナノファイバーの接触角は、水との5秒間の接触後に0°に変化し、良好な親水性を示しています。 PLA表面の酸素含有官能基（例えば、-OHおよび-COOH）は、プラズマ処理後のナノファイバー表面により多く結合したため、この親水性足場は細胞接着および拡散に好ましい条件も提供しました[37]。形態と酸素含有官能基が連携して、PANI / PLA複合ナノファイバーが最終的に完全に濡れることを保証しました[38、39]。

a の接触角 PLAナノファイバー、 b PANI / PLA-HA、 c PANI / PLA-SA、および d PANI / PLA-PA複合ナノファイバー

異なる無機酸でドープされた純粋なPANIおよびPANI / PLA複合ナノファイバーのFTIRスペクトルを図6に示します。純粋にドープされたPANIスペクトル（図6a）では、1,565、1,485、1,298、および1,125cmに強い特性ピークがあります。 ^-1 キノイド環のC =C伸縮と、ベンゼノイド環のC =C伸縮、C–N伸縮、および=C–H伸縮にそれぞれ対応します。純粋にドープされたPANIスペクトル（図6b）では、特徴的なPANIピークに加えて、PLAピークも見られます（1092および1184 cm ^-1 のC–O伸縮振動ピーク 、C =O伸縮振動ピーク1757cm ^-1 ）。これらの結果は、PANIが無機酸でドープされたPANI / PLAナノファイバーの表面にうまくロードされたことを示しています。 PANI / PLAナノファイバーの化学組成をさらに調査するために、XPSを使用してそれらの表面組成を分析しました。さらに、XPSスペクトル（図7a）では、PANI / PLA複合ナノファイバーの〜400eVに明確なN1sピークが見られました。さらに、Cl2pのピークはPANI / PLA-HAおよびPANI / PLA-PAで〜200 eVに見られましたが、PANI / PLA-PAを使用したCl2pのピーク強度はPANI / PLA-HAを使用した場合よりも高かった。 S2pのピークは、PANI / PLA-SAのXPSスペクトルで〜210eVに現れました。 XPSスペクトルは、Cl ^- 、SO ₄ ^2- 、およびClO ₄ ⁻ 対応するPANI / PLAナノファイバーにドープされました。さらに、PANIのイミン窒素原子は完全にまたは部分的に酸化されて、さまざまな程度のプロトン化を伴う一連の酸化状態を生成しました。 PANIの酸化状態とプロトン化レベルの変化は、N1s核レベルスペクトルの観点から測定されました（図7b–d）。各N1sスペクトルは、結合エネルギーが約398.7、399.6、400.4、および401.8 eVの4つの主要成分にデコンボリューションできます。これは、キノノイドイミン（–N =）、ベンゼノイドアミン（–NH–）、プロトン化アミン（– N ⁺ ）、およびプロトン化イミン（=N ⁺ ）、それぞれ[40、41]。 Kumarの研究[42]を参照すると、N1sスペクトルのフィッティングピークは、プロトン化されたN原子によって結合された陰イオンの電荷の影響を受けていると見なされ、非局在化とわずかなシフトが発生しました。

a のFTIRスペクトル パニ、 b PLAおよびPANI / PLA複合ナノファイバー

XPSスペクトル（ a ）準備されたPANI / PLA複合ナノファイバー足場とPANI / PLA-HA（ b ）、PANI / PLA-SA（ c ）、およびPANI / PLA-PA（ d ）N1sのコアレベル信号の

組織の修復と再生のテンプレートとして、生物活性のある足場は、細胞と組織の修復が誘導された後、分解されて体外に排出されます[43]。この論文では、図8に示すように、ナノファイバー足場の分解特性を質量損失法を使用して評価しました。すべてのサンプルの質量損失は7、14、および21日で増加し、PLAの質量損失率は増加しました。ナノファイバーはそれぞれ4.34±0.41％、7.84±1.57％、12.65±0.83％でした。一方、PANI / PLA-PA複合ナノファイバーの質量損失は、その場での酸化重合後に徐々に増加し、質量損失率は7、14、および40で31±2.15％、34±1.86％、および40±2.54％でした。それぞれ21日であり、PANI / PLA-HAおよびPANI / PLA-SAナノファイバーの両方よりも有意に長かった。 PANI in situ酸化重合プロセスでは、酸化剤APSの存在により、PLAのエステル結合が破壊され、加水分解反応が引き起こされ、PLAナノファイバーにマイクロクラックが発生した可能性があります。 PBS浸漬時間の延長に伴い、マイクロクラックは徐々に蓄積し、PLAマトリックスは徐々に劣化し始めました。表面に負荷がかかったPANIも脱落し、ナノファイバー品質の損失率が発生しました。時間の経過とともに、質量損失率がより明確になりました。ここでは、HClO ₄ の強い酸化 PLAの劣化を悪化させ、PANI / PLA-PAナノファイバーの質量損失を加速させました。これは、図2に示す機械的特性と一致しています。

PLAおよびPANI / PLAナノファイバーの分解特性

生物活性足場の生体適合性は、細胞の接着、成長、および増殖を促進するための基礎です[44]。ここでは、付随する接着と生体適合性を説明するために、PLAおよびPANI / PLA複合ナノファイバー上でのHOSの細胞増殖を研究しました。化学的処理および機能化[45]の間に、多くの潜在的な影響因子が生物活性足場の調製に関与する可能性があります。したがって、それらの生体適合性を調査することは、それらの実際のアプリケーションを評価するための鍵となります。

PANI / PLA複合ナノファイバーの生体適合性を調査するために、MTT法を使用してそれらの細胞生存率を評価しました。図9は、1、3、および5日後にPLAおよびPANI / PLA複合ナノファイバー上でインキュベートされた細胞活性を示しています。この図は、インキュベーション時間が長くなると、ナノファイバーの細胞活性が徐々に増加したことを明確に示しています。 PANI / PLA-PA細胞が最高の活性を示し、5日間の培養後の細胞活性が最高でした。

PLAナノファイバーおよびPANI / PLA複合ナノファイバー（* p ）上で1、3、および5日間培養された細胞生存率HOS <0.05; ** p <0.005）

PLAは生分解性ですが、疎水性であるため、細胞の接着、成長、増殖を促進しません。プラズマ処理後、PANI / PLA複合ナノファイバーの表面に酸素含有基がロードされ、機能面は良好な親水性を示しました。上記の形態とAFMの結果は、さまざまな無機酸をドープしたPANIが、PLAナノファイバーの表面でさまざまな形態と粗さレベルを示したことを示しています。一方、PANI / PLA複合ナノファイバーは優れた湿潤性を示しました。したがって、無機酸をドープしたPANIの形態が異なると、PANI / PLA複合ナノファイバーの表面エネルギーと極性が向上し、その結果、細胞の成長、移動、増殖に影響を及ぼし、パフォーマンスが向上すると考えました。細胞活性の[46]。

PANI / PLA複合ナノファイバーの細胞挙動をさらに研究するために、ナノファイバーの成長と接着を蛍光免疫染色（図10）とSEM（図11）で観察しました。ここでは、さまざまなナノファイバーの表面のアクチンと細胞の形態を比較しました。細胞がPLAファイバーとPANI / PLAナノファイバー上で成長したとき、アクチン束は良好な伸長状態を示しました。一方、PANI / PLA複合ナノファイバーの細胞密度は対照群のPLAナノファイバーよりも高く、細胞増殖密度はPANI / PLA-PA> PANI / PLA-SA> PANI / PLA-HAの順でした。 HOS細胞は、PANI / PLAナノファイバー上で成長し、平らな多極形状に接着しました。明らかに、多くの細胞がPANI / PLA繊維の細孔に埋め込まれていましたが、PLAナノファイバー上での伸長が不十分であり、完全に拡張することはできませんでした。これらの結果は、PANI / PLA複合ナノファイバーがHOS細胞の接着と増殖を促進する可能性があることを示しています。

a の蛍光顕微鏡画像 PLAナノファイバー、 b PANI / PLA-HA、 c PANI / PLA-SA、および d 24時間のインキュベーション後のPANI / PLA-PA複合ナノファイバー

a に播種されたHOSのSEM顕微鏡写真 PLAナノファイバー、 b PANI / PLA-HA、 c PANI / PLA-SA、および d 24時間後のPANI / PLA-PA複合ナノファイバー

一方、細胞免疫蛍光染色と細胞接着の結果は、PANI / PLA複合ナノファイバーの表面の異なるPANI形態が、HOS細胞の成長、接着、増殖に影響を及ぼしたことを示しており、上記の結果と一致していました。

初期の骨形成マーカーとして、ALPテストはPLAおよびPANI / PLA複合ナノファイバー足場で7日間実施されました。純粋なPLAナノファイバーと比較して、結果（図12）は、PANI / PLA複合ナノファイバーのALP活性が大幅に改善されたことを示しています。明らかに、PANI / PLA-PA複合ナノファイバーのALP活性は最高です。これらの結果は、PANI / PLA複合ナノファイバーがより優れた生体適合性を示したことを証明しました。これは、細胞接着、成長、および増殖の上記の結果と一致しています。

PANI / PLA複合ナノファイバー足場に対するアルカリホスファターゼ活性（ns =有意性なし）

結論

この論文では、異なる表面形態のPANI / PLA複合ナノファイバーを、その場での重合におけるドーパントとしての3種類の無機酸によって調製しました。ナノファイバーの多孔質構造を変えることなく、PANIをPLAの表面にうまくロードできることを確認しました。機械的特性とinvitro分解実験は、酸化性酸が機械的特性を大幅に弱め、ポリエステルナノファイバーの分解を加速できることを示しました。一方、表面が粗いほど湿潤性が向上し、細胞の接着、成長、増殖が促進され、生体適合性が向上したことが示されました。結論として、さまざまな酸のドーピングによって制御されたPANIの形態は、組織工学における生体適合性にプラスの効果をもたらします。

データと資料の可用性

著者は、物質移動合意書の過度の資格なしに、資料とデータが読者にすぐに利用可能であることを宣言します。この調査中に生成または分析されたすべてのデータは、この記事に含まれています。

略語

PANI：

ポリアニリン

PLA：

ポリ乳酸

ECM：

細胞外マトリックス

PPy：

ポリピロール

PTH：

ポリチオフェン

AN：

アニリン

DCM：

ジクロロメタン

DMF：

N 、 N -ジメチルホルムアミド

APS：

過硫酸アンモニウム

HOS：

ヒト骨肉腫細胞

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

MTT：

3–2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド

FITC：

フルオレセインイソチオシアネート

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

FE-SEM：

電界放出型走査電子顕微鏡

XPS：

X線光電子分光法

ALP：

アルカリホスファターゼ