無機酸ドーピングによる表面形態制御でポリアニリン/ポリ乳酸ナノファイバー足場の生体適合性を向上

概要

導電性と生分解性を兼ね備えたナノファイバー足場は、外部電場下で細胞増殖・分化を促進する大きな可能性を秘めています。しかし、体液中での電気伝導度低下という課題が残る一方で、ポリアニリン（PANI）ベースの生分解性ナノファイバーは細胞接着・増殖・成長を促進します。この効果がPANI形態によるものかを検証するため、PANIのインシチュ酸化重合工程で3種の無機酸（塩酸、硫酸、過塩素酸）をドーパントとして選択しました。得られたPANI/ポリ乳酸（PLA）複合ナノファイバーをSEM、FTIR、XPSで解析し、PLAナノファイバーの多孔質構造を変えることなくPANIがコーティングされることを確認。in vitro力学特性と分解性試験から、酸ドーパントの酸化力がPLAナノファイバーの酸化分解を促進する可能性が示唆されました。接触角試験では、異なる表面形態を持つPANI/PLA複合ナノファイバーが良好な濡れ性を示し、骨組織工学足場の要件を満たすことがわかりました。表面粗さと細胞生存率の結果から、PANIの表面粗さが高いほど生体適合性が向上することが判明。その結果、無機酸ドーピングによるPANI/PLA複合ナノファイバーの制御された表面形態が、組織工学における生体適合性に正の影響を与えることが結論付けられました。

はじめに

細胞外マトリックス（ECM）は、細胞が細胞外基質に分泌するマクロ分子ネットワークの一種です。細胞、組織、器官の基盤を呈し、複雑な網目構造を特徴とします。また、細胞の生存と活動に適した場を提供し、細胞の形状決定、分化制御、移動と代謝への参加を通じて、最終的に生存、成長、死に影響を与えます。電気紡糸ナノファイバーは、高い比表面積、適切な力学特性、生分解性により、ECMの作用を模倣して細胞振る舞いを制御できます。さらに、多孔質構造を維持したまま表面修飾により多機能化可能です。したがって、電気紡糸ナノファイバーは組織工学における有望な候補材料となり、薬物送達、骨再生、神経再生と修復などに広く応用されています。

導電性高分子（ポリピロール[PPy]、ポリチオフェン[PTH]、ポリアニリン[PANI]など）は優れたin vitroおよびin vivo生体適合性を持ち、細胞接着、増殖、分化、組織再生に顕著な影響を与えます。これらの中でPANIは、優れたプロセス性、優れた導電性、良好な酸化還元安定性、生体適合性により、組織工学と再生医療の潜在的材料と見なされています。電気刺激下では、PANIは細胞接着、増殖、移動、分化を制御できます。実際、多数の報告がPANIベースの導電性生分解性複合ナノファイバーが電場下で細胞振る舞いを促進することを結論付けています。しかし、生理環境（pH 7.4）ではPANIが脱ドープされ導電性が弱まるという重大な問題があり、電気刺激による細胞増殖・分化促進という利点が減じられることが先行研究で示されています。この制約は骨組織工学における外部電気刺激下でのPANIベース導電性生分解性ナノファイバーの限界を明確に示していますが、それでも細胞増殖と成長をかなりの程度促進できます。ここで我々は、PANIの表面形態が複合ナノファイバーの粗さを増し、細胞接着・成長・増殖に有利に働くと推測しました。

無機酸でドープされたPANIは一般的に良好な電気伝導性を示します。しかし、様々な無機酸ドーパントによって導入されるアニオンがPANIの伝導性と構造に影響を与えます。本論文では、塩酸（HCl、HA）、硫酸（H₂SO₄、SA）、過塩素酸（HClO₄、PA）の3種の一般的な無機酸を、PANIインシチュ酸化重合のドーパントとして選択しました。その後、異なる酸ドーパント下でのPANI/ポリ乳酸（PLA）ナノファイバーの力学特性、濡れ性、表面形態、生体適合性、細胞接着を調査しました。結果、PANIの表面粗さが高いほど細胞増殖が良好であり、より優れた生体適合性を示すことが明らかになりました。

材料と方法

試薬

アニリン（AN）はシグマから、PLA（Mw = 60,000）はソルバイオから、ジクロロメタン（DCM）は天津富宇精細化学から、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）はマックリンから購入。一方、過硫酸アンモニウム（APS）はアラジンから、HClとH₂SO₄は広州化学から、HClO₄はマックリンから購入しました。

ポリアニリン/ポリ乳酸ナノファイバーの調製

電気紡糸ポリ乳酸ナノファイバーの作製

特定質量のPLA粒子をDCMとDMFの混合溶液（体積比7:3）に添加し、溶解するまで攪拌して10% PLA溶液を調製。この溶液をシリンジに充填し、高電圧電源に接続。電気紡糸装置（DP-30、天津雲帆科技有限公司）を電圧15 kV、チップ-コレクタ距離15 cmに設定。得られたPLAナノファイバーを40°Cで一晩真空乾燥しました。

異なる無機酸ドープPANI/PLAナノファイバーの調製

PLAナノファイバーをプラズマ洗浄装置（PCE-6、MTI Corporation、USA）のチャンバーに入れ、30 W RFパワーで2分放電処理。本研究では、HCl、H₂SO₄、HClO₄の3種の無機酸をPANIインシチュ酸化重合のドーパントとして用い、対応するPANIナノファイバーをPANI-HA、PANI-SA、PANI-PA、PANI/PLA複合ナノファイバーをPANI/PLA-HA、PANI/PLA-SA、PANI/PLA-PAと標識しました。PLAとPANI/PLA複合ナノファイバーの調製プロセスを図1に示します。

PANI/PLA複合ナノファイバーはアイスバス条件下で調製しました。APSとANを1:1のモル比で1 M酸溶液に添加。ここではHClを例に調製プロセスを説明します。アイスバス条件下で、AN（930 mg、0.01 mol）をAPS（2,280 mg、0.01 mol）と50 mLの1 M HClに溶解した溶液に滴下。直ちにプラズマ処理済みPLAナノファイバー膜を溶液に浸漬し、0°Cで2時間攪拌。反応後、PLAナノファイバー膜をHClとエタノールで数回洗浄し、未接着PANIを除去。40°Cで一晩乾燥してPANI/PLA-HAナノファイバーを得て保存。PANI/PLA-SAとPANI/PLA-PA複合ナノファイバーも同様の手順で調製しました。

キャラクタリゼーション

PLAナノファイバーとPANI/PLA複合ナノファイバーの単軸引張試験を歪み-応力試験機（島津AGX-PLUS、日本）で実施。試料をダンベル形状に切り出し、引張速度を一定の3 mm/minに維持。ヤング率は応力-歪み曲線の0-15%歪み線形領域から算出。引張強度と破断歪みは曲線の破断点から決定。

ナノファイバー足場の形態を電界放出型走査電子顕微鏡（FE-SEM、日立SU8220、日本）で観察し、異なる無機酸ドープPANIの形態を確認。SEM観察前にナノファイバー試料を60秒金スパッタリングして形態観察を明確化。一方、PANI/PLA複合ナノファイバーの表面粗さを原子間力顕微鏡（AFM、Bruker Dimension Edge）で測定。PANIがPLAナノファイバーに完全に担持されているかを確認するため、フーリエ変換赤外分光法（FTIR、Thermo Nicolet iS50）で2000～500 cm⁻¹の波長変化を測定。X線光電子分光法（XPS、Thermo ESCALAB 250）とAl-Kα X線源を用いてPANI/PLAナノファイバーの表面組成をさらに決定。濡れ性は常温で接触角分析装置（OCA 15 plus、ドイツ）により水滴の接触角で測定。ナノファイバーの分解性は質量減少法で評価。ナノファイバー膜を16 mmディスクに切り出し、pH 7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）20 mLに入れ、37°Cで7、14、21日間インキュベートし、恒量まで乾燥させました。

PANI/PLA複合ナノファイバー足場の生体適合性

生体適合性

本研究では、ヒト骨肉腫（HOS）細胞活性実験でPANI/PLA複合ナノファイバー足場の生体適合性を評価しました。HOS細胞は中国科学院上海細胞バンクから購入。HOS細胞を10%胎仔牛血清、100 U/mLペニシリン、100 U/mLストレプトマイシン含有低糖Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）で培養し、37°C、5% CO₂でインキュベート。細胞融合度が90%に達したら1:3の比率で継代しました。

HOS細胞をPANI/PLAナノファイバーに播種する前に、ナノファイバーを96ウェルプレートに配置して底面を完全に覆い、UVで30分、75%エタノール溶液で30分滅菌。その後PBSで洗浄。ナノファイバーに1×10⁴ cells/wellの密度で細胞を接種し、ブランク群とコントロール群を同時設定。細胞を37°Cのインキュベーターで1、3、5日間培養し、培地を2日ごとに交換しました。

PANI/PLAナノファイバーの細胞生存率をMTTアッセイで評価。1、3、5日後のインキュベーション後、96ウェルプレートから培地を除去しPBSで3回洗浄。10%の5 mg/mL MTT含有DMEM 1 mLを添加。37°Cで4時間インキュベート後、培地を除去しDMSOを添加してメチルプレドニゾロンを溶解。10分間振盪し、吸光度を測定（BioTek Synergy HTX、USA）。

蛍光免疫染色

HOS細胞をPANI/PLAナノファイバーインキュベーターで24時間培養し、PBSで3回洗浄。その後、室温で4%パラホルムアルデヒドで10分固定。固定細胞をPBSで3回洗浄（各10分）、100 nM FITC標識ペプチド10 μLを添加し、室温で30分インキュベート後、PBSで3回洗浄（各5分）。HOS細胞の細胞外アクチンを染色し、共焦点顕微鏡（Type A1、ニコン、日本）で20倍倍率で観察。

細胞接着

PANI/PLA複合ナノファイバー足場上のHOS細胞接着をSEMで観察。24時間培養後、培地を除去しPBSで3回洗浄、4% PFAを添加。4°Cで一晩固定、PBSで3回洗浄、勾配エタノール溶液（30%、50%、70%、85%、90%、100%、各20分）で脱水、24時間凍結乾燥。SEM観察前にナノファイバーを120秒白金スパッタリングして観察を良好にしました。

アルカリホスファターゼ活性（ALP）

ALPはアルカリホスファターゼ酵素発現に依存する一般的な初期骨芽細胞分化マーカーの一つです。ALP活性はALP Assay Kit（Beyotime Biotechnology、P0321S）を用いて実施。HOS細胞を異なるPANI/PLA複合足場で指定の7日間培養。細胞を0.1 M Tris-HCl（pH 8）50 μLに0.1%（v/v）トリトンX-100で溶解。p-ニトロフェニルリン酸（PNPP）からp-ニトロフェノール濃度を定量し、405 nm吸光度を記録してALP活性を分析。PANI/PLAナノファイバー上で培養した細胞のALP活性割合を、純粋なPLAナノファイバー上の細胞ALP活性と比較して算出しました。

統計解析

結果の統計的有意性はGraphPad Prism（バージョン8.02）を用いた一元配置分散分析（ANOVA）で評価。異なるPANI/PLA複合ナノファイバー足場間の力学特性、in vitro生分解性、細胞生存率の差を分析。p < 0.05（＊）で有意、p < 0.005（＊＊）で非常に有意と判定。

結果と考察

組織工学足場の力学特性は、流体力学に耐えられるかを評価する重要な指標です。無機酸の存在が、PANIのインシチュ化学酸化重合プロセスにおいてPANI/PLA複合ナノファイバーのPLAマトリックスの物理化学的特性に影響を与える可能性があります。したがって、無機酸ドープPANI/PLA複合ナノファイバーの力学特性を調べることは必要です。ここでは、引張試験でPANI/PLA複合ナノファイバーの力学特性を評価しました（図2）。応力-歪み、ヤング率、引張強度、破断伸びを含みます。図2aに示す通り、PLAナノファイバーは線形弾性挙動を示し、PANI/PLA-HAとPANI/PLA-SA複合ナノファイバーは明確な降伏挙動を示しましたが、PANI/PLA-PA複合ナノファイバーは弾性変形直後に破断しました。PANI/PLA複合ナノファイバーのヤング率（図2b）はPLAナノファイバーより高く、PLAと比較してPANI/PLA-HA、PANI/PLA-SA、PANI/PLA-PAの弾性率増加はそれぞれ53.5±9.09、60.00±9.47、28.43±8.34 MPaでした。引張強度（図2c）と破断伸び（図2d）では、PANI/PLA-HAとPANI/PLA-PAが減少、PANI/PLA-SAはわずかに増加。PANI/PLA-PAの引張強度と破断伸びが最低でした。PLAナノファイバーと比較して、PANI/PLA-HAとPANI/PLA-PAの引張強度はそれぞれ0.15±0.01と0.64±0.03 MPa減少し、PANI/PLA-SAは0.13±0.05 MPaわずかに増加。破断伸びはPANI/PLA-HAとPANI/PLA-PAでそれぞれ16.93±1.38%と35.42±3.94%減少し、PANI/PLA-SAで3.32±0.13%増加しました。

図2に示す通り、選択した無機酸はPANIコーティングとの結合を通じてPLAナノファイバーの弾性率を増加させます。引張強度と破断伸びでは、PLAナノファイバーと比較してPANI/PLA-HAとPANI/PLA-SAの力学特性は程度の差こそあれ変化しましたが、PANI/PLA-PAは最も明確に低下し、試験中に応力が加わると5秒以内に破断が生じました。これはHClO₄の酸化作用によりPLA分子鎖のエステル結合が切断され、カルボキシル基の酸化分解が生じ、力学特性が劣化したためと考えられます。一方、PANI/PLA-HAとPANI/PLA-SAの異なる力学特性は、HClとH₂SO₄でドープされたPANIの密度差に関連している可能性があり、反応工程でのAPS導入もPLAナノファイバーにわずかな影響を与えた可能性があり、これらの要因の総合的効果で異なる力学特性が現れたと考えられます。

細胞接着、増殖、分化は形態の影響を受け、一般に粗い表面が細胞接着に有利とされています。PLAナノファイバーの疎水性はPANIの均一重合を妨げる障壁となりますが、プラズマ表面処理により濡れ性が大幅に改善されます。異なる無機酸ドーパントによるPANIベースインシチュ重合後、均一な表面堆積を持つPANI/PLA複合ナノファイバーが得られました。

異なるPANI/PLAファイバー表面のPANI形態をFE-SEMで観察しました（図3）。PLAナノファイバー表面が多数の不規則ナノ粒子で覆われ、無機酸ドープPANI/PLA複合ナノファイバーが良好なファイバー形態と多孔質ナノファイバー構造を維持していることが明確にわかります。形態観察から、PANI/PLA複合ナノファイバーにPANIが成功裏に担持され、細胞接着と増殖の基盤を提供することが確認されました。一方、AFMでPANI/PLA複合ナノファイバーの表面粗さを測定しました（図4）。各試料の3箇所の表面粗さ平均値Raを一般的な評価指標として用いました。さらに、PANI/PLA複合ナノファイバーのRaはPLAナノファイバーより大きく、PANI/PLA-PAのRaが最高でした。この表面粗さ増加は表面積と極性を高め、細胞成長サイトを増やし細胞接着を促進する可能性があります。

細胞接着、移動、増殖は足場の濡れ性に大きく影響されます。一般に濡れ性は足場と水の接触角で評価されます。PLAは疎水性であるため、ナノファイバー膜上の水滴接触角を1秒以内に測定しました（図5）。処理後のPANI/PLAナノファイバー接触角は有意に減少しました。PLA、PANI/PLA-HA、PANI/PLA-SA、PANI/PLA-PAの接触角はそれぞれ112°、61.6°、36.7°、37.2°でした。PANI/PLAのPANI形態が系の表面エネルギーを増加させ、水との初期接触で接触面積が増えるため接触角が減少し、濡れ性が改善されました。複合ナノファイバーの接触角は水と接触5秒後に0°になり、良好な親水性を示しました。この親水性足場も細胞接着と拡散に有利な条件を提供します。プラズマ処理後、PLA表面の酸素含有官能基（-OH、-COOHなど）がナノファイバー表面により強く結合し、PANI形態と酸素含有官能基が協働してPANI/PLA複合ナノファイバーを完全に濡らすことができました。

異なる無機酸でドープされた純粋PANIとPANI/PLA複合ナノファイバーのFTIRスペクトルを図6に示します。純粋ドープPANIスペクトル（図6a）では、1565、1485、1298、1125 cm⁻¹の強い特性ピークがそれぞれキノイド環のC=C伸縮、ベンゾイド環のC=C伸縮、C-N伸縮、=C-H伸縮に対応。純粋ドープPANIスペクトル（図6b）では、PANI特性ピークに加え、PLAピーク（C-O伸縮振動ピーク1092と1184 cm⁻¹、C=O伸縮振動ピーク1757 cm⁻¹）も観測されました。これらの結果は、無機酸ドープPANI/PLAナノファイバー表面にPANIが成功裏に担持されたことを示しています。PANI/PLAナノファイバーの化学組成をさらに調べるため、XPSで表面組成を分析しました。XPSスペクトル（図7a）では、PANI/PLA複合ナノファイバーで約400 eVに明確なN1sピークが観測されました。また、PANI/PLA-HAとPANI/PLA-PAで約200 eVにCl2pピークが見られ、PANI/PLA-PAのCl2pピーク強度がPANI/PLA-HAより高かったです。PANI/PLA-SAのXPSスペクトルに約210 eVでS2pピークが出現。XPSスペクトルから、Cl⁻、SO₄²⁻、ClO₄⁻が対応するPANI/PLAナノファイバーにドープされたことが示されました。さらに、PANIのイミン窒素原子が完全または部分的に酸化され、様々な酸化状態とプロトン化度を伴う一連の酸化状態が生成されました。酸化状態とプロトン化レベルの変化をN1s核レベルスペクトル（図7b-d）で測定。各N1sスペクトルは約398.7、399.6、400.4、401.8 eVの結合エネルギーを持つ4つの主要成分に脱畳みでき、それぞれキノイドイミン（-N=）、ベンゾイドアミン（-NH-）、プロトン化アミン（-N⁺）、プロトン化イミン（=N⁺）に帰属されます。Kumarの研究を参照すると、N1sスペクトルのフィッティングピークはプロトン化N原子に結合したアニオンの電荷の影響を受け、非局在化とわずかなシフトが生じるとされています。

組織修復・再生のテンプレートとして、生体活性足場は誘導された細胞・組織修復後に分解・体外排出されます。本研究では、ナノファイバー足場の分解特性を質量減少法で評価しました（図8）。全試料の質量減少は7、14、21日で増加し、PLAナノファイバーの質量減少率はそれぞれ4.34±0.41%、7.84±1.57%、12.65±0.83%でした。一方、PANI/PLA-PA複合ナノファイバーの質量減少はインシチュ酸化重合後に徐々に増加し、7、14、21日での質量減少率はそれぞれ31±2.15%、34±1.86%、40±2.54%で、PANI/PLA-HAとPANI/PLA-SAナノファイバーより有意に高かったです。PANIインシチュ酸化重合プロセスでは、酸化剤APSの存在がPLAのエステル結合を破壊し加水分解反応を誘発し、PLAナノファイバーに微細亀裂を生じさせた可能性があります。PBS浸漬時間の延長とともに微細亀裂が徐々に蓄積し、PLAマトリックスが徐々に分解。表面担持PANIも剥離し、ナノファイバー質量減少率となりました。時間経過とともに質量減少率が明確になりました。ここでは、HClO₄の強い酸化性がPLA分解を悪化させ、PANI/PLA-PAナノファイバーの質量減少を加速させたことが、図2の力学特性と一致します。

生体活性足場の生体適合性は、細胞接着、成長、増殖を促進する基盤です。本研究では、PLAおよびPANI/PLA複合ナノファイバー上のHOS細胞増殖を調べ、接着性と生体適合性を検証しました。化学処理と機能化の過程で、生体活性足場の調製には多くの潜在的影響因子が関与する可能性があります。したがって、それらの生体適合性を調査することは実用応用評価の鍵となります。

PANI/PLA複合ナノファイバーの生体適合性を調べるため、MTT法で細胞生存率を評価しました。図9は、PLAおよびPANI/PLA複合ナノファイバー上で1、3、5日間培養したHOS細胞の細胞活性を示しています。図から明らかなように、培養時間の延長とともにナノファイバーの細胞活性は徐々に増加し、PANI/PLA-PA細胞が最も良好な活性を示し、5日間培養後の細胞活性が最高でした。

PLAは生分解性ですが疎水性であり、細胞接着、成長、増殖に不利です。プラズマ処理後、PANI/PLA複合ナノファイバー表面に酸素含有基が担持され、機能化表面が良好な親水性を示しました。前述の形態とAFM結果から、無機酸でドープされたPANIがPLAナノファイバー表面で異なる形態と粗さレベルを示すことがわかります。一方、PANI/PLA複合ナノファイバーは優れた濡れ性を示しました。したがって、無機酸でドープされたPANIの異なる形態がPANI/PLA複合ナノファイバーの表面エネルギーと極性を高め、結果として細胞成長、移動、増殖に影響を与え、細胞活性の性能向上をもたらしたと考えられます。

PANI/PLA複合ナノファイバーの細胞振る舞いをさらに調べるため、蛍光免疫染色（図10）とSEM（図11）でナノファイバー上の細胞成長と接着を観察しました。ここでは、異なるナノファイバー表面でのアクチンと細胞形態を比較しました。細胞がPLAファイバーとPANI/PLAナノファイバー上で成長する際、アクチン束は良好な伸展状態を示しました。一方、PANI/PLA複合ナノファイバーの細胞密度はコントロール群のPLAナノファイバーより高く、細胞成長密度の順序はPANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HAでした。HOS細胞はPANI/PLAナノファイバー上で扁平多極形状で接着し成長。明らかに多くの細胞がPANI/PLAファイバーの孔に埋め込まれていましたが、PLAナノファイバー上では十分に伸展できず拡大不良でした。これらの結果は、PANI/PLA複合ナノファイバーがHOS細胞の接着と増殖を促進できることを示しています。

一方、細胞免疫蛍光染色と細胞接着結果から、PANI/PLA複合ナノファイバー表面の異なるPANI形態がHOS細胞の成長、接着、増殖に影響を与えることが示され、前述の結果と一致しました。

初期骨形成マーカーとして、PLAおよびPANI/PLA複合ナノファイバー足場で7日間ALP試験を実施。純粋PLAナノファイバーと比較して、結果（図12）はPANI/PLA複合ナノファイバーでALP活性が有意に改善されたことを示しました。明らかに、PANI/PLA-PA複合ナノファイバーのALP活性が最良でした。これらの結果は、PANI/PLA複合ナノファイバーがより優れた生体適合性を示すことを証明しており、前述の細胞接着、成長、増殖の結果と整合します。

結論

本研究では、インシチュ重合において3種類の無機酸をドーパントとして用い、異なる表面形態を持つPANI/PLA複合ナノファイバーを調製しました。PANIがナノファイバーの多孔質構造を変えることなくPLA表面に成功裏に担持されることを確認。力学特性とin vitro分解実験から、酸化性酸がポリエステルナノファイバーの力学特性を著しく弱め、分解を加速することを示しました。一方、より粗い表面がより良い濡れ性をもたらし、細胞接着、成長、増殖を促進し、より良い生体適合性を示すことが判明。結論として、異なる酸ドーピングによる制御されたPANI形態は、組織工学における生体適合性に正の影響を与えます。

データと材料の入手可能性

著者らは、材料譲渡契約に関する不当な条件なしで、読者が材料とデータを迅速に入手可能であることを宣言します。本研究で生成・解析されたすべてのデータは本論文に含まれています。

略語

PANI:

ポリアニリン

PLA:

ポリ乳酸

ECM:

細胞外マトリックス

PPy:

ポリピロール

PTH:

ポリチオフェン

AN:

アニリン

DCM:

ジクロロメタン

DMF:

N,N-ジメチルホルムアミド

APS:

過硫酸アンモニウム

HOS:

ヒト骨肉腫細胞

DMEM:

Dulbecco改変Eagle培地

PBS:

リン酸緩衝食塩水

MTT:

3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド

FITC:

フルオレセインイソチオシアネート

FTIR:

フーリエ変換赤外分光法

FE-SEM:

電界放出型走査電子顕微鏡

XPS:

X線光電子分光法

ALP:

アルカリホスファターゼ