血管組織工学のための潜在的な足場としての抗血栓形成性および増強された内皮細胞親和性を有するコンドロイチン硫酸/ポリカプロラクトン/ゼラチンエレクトロスピニングナノファイバー

はじめに

ナノファイバー材料の開発は、細胞外マトリックス（ECM）のような超微細繊維構造、優れた機械的特性、大きな比表面積、および相互接続性を備えた高い多孔性[1、2]。ナノファイバー構造は、細胞接着、形態（例えば、拡散、整列、伸長など）、配置、移動、増殖、表現型、および接触ガイダンスを介した分化などの細胞応答を媒介する上で重要な役割を果たすことが実証されています[3 、4,5]。多数のナノ製造戦略（ナノスカイビング、​​テンプレート合成、相分離など）がナノファイバー材料を製造するための利用可能な技術を提供してきましたが、エレクトロスピニングはさまざまな材料（金属、セラミック、ポリマー）からナノファイバーを製造するための最も効果的な方法の1つです。 、複合材料など）工業規模で[6,7,8]。

（生体）物理信号に加えて、適切な生体材料の選択は、細胞の活動だけでなく、組織の修復と再生にも大きな影響を与える可能性があります[9]。生体適合性、生体吸収性、機械的特性、生体機能などのいくつかの重要な機能を考慮する必要があります[9、10]。天然/天然および合成/合成複合材料と比較して、天然および合成ポリマーからなる複合ナノファイバー材料は、天然ポリマーの優れた生物学的特徴と合成ポリマーの機械的強度の組み合わせにより、より注目を集めています[9]。その中で、ゼラチン（Gt）/ポリカプロラクトン（PCL）の組み合わせは、最も代表的に研究されている天然合成ハイブリッドシステムの1つであり、血管組織工学で広く使用されています[11、12、13、14]。ただし、Gt / PCL複合ナノファイバーには、遅い内皮化や血栓症など、まだいくつかの制限があります。最近、コンドロイチン硫酸（CS）は、グリコサミノグリカンとガラクトサミンを含む硫酸化多糖類であり、内皮細胞（EC）への高い接着性、タンパク質や血小板への弱い相互作用、および負に帯電した血液成分の静電反発力を有することが実証されています[15 、16、17]。さらに、CSは細胞アポトーシスを阻害し、血管創傷の治癒を促進する可能性があります[18、19]。したがって、CSを組み込んだGt / PCL（PG）エレクトロスピニングナノファイバーは、血管の修復と再生のための生体エネルギーを与える組織工学の足場として優れた候補となります。

本研究では、異なるCS比を含む生体模倣PG複合ナノファイバーがワンステップエレクトロスピニングを介して開発されました。 CS / PG複合ナノファイバーの形態、化学的特徴の多孔性、劣化、および劣化は、さまざまな特性評価手法によって検出されました。 PG / CS複合ナノファイバーの抗凝固剤を評価しました。さらに、CS比が異なるこれらの複合ナノファイバーにヒト大動脈内皮細胞（HAEC）を播種して、細胞応答への影響を調査しました。

材料と方法

資料

CS（ウシ気管、タイプA、純度：95％）は、Shanghai Macklin Biochemical Technology Co.、Ltd。（中国）から供給されました。 PCLは、Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc.（中国）から入手しました。 Gt（ウシの皮膚、タイプB）は、Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co.、Ltd。（中国）から入手しました。活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）キットは、Leigen Biotechnology Co.、Ltd（中国）から購入しました。酢酸（純度：99.5％）はSinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd。（中国）から購入しました。ヒト大動脈内皮細胞（HAEC）は、青島大学（中国）の付属病院から入手しました。培地ダルベッコ改変イーグル培地/栄養素混合物F-12（DMEM / F-12）、ウシ胎児血清（FBS）、0.25％トリプシン-EDTAはBiological Industries（Israel）から購入しました。特に記載がない限り、すべての試薬はSigma Aldrich（中国）から購入しました。すべての実験で使用された水は脱イオン化されました。

ナノファイバーのエレクトロスピニング

PCL（10％w / v）を、室温で4時間機械的に攪拌しながら酢酸に溶解しました。 Gt（10％w / v）を90％酢酸に溶解し、2時間絶えず攪拌しました。さまざまな濃度のCSをGt溶液に添加し、室温で1時間穏やかに攪拌して、総ポリマー濃度に対して5、10、および15 wt。％のCSを含む均質な溶液を得ました。次に、PG溶液は、上記の2つの溶液を50/50（w / w）の重量比で、5％CS @ PG、10％CS @ PG、および15％CS @PGと名付けて2時間撹拌しながら混合することによって調製しました。 。

調製した均質な溶液を、21Gの針を備えた1mLの注射器と、アルミホイルで覆われたコレクターを備えたエレクトロスピニングプロセスにかけました。この研究では、コレクタープレートと針先の間の距離を約18 cmに固定し、電圧を23 kVに設定し、ポリマー溶液を1 mL / hの速度でポンプで排出しました。すべての溶液は、エレクトロスピニング装置（Technology、Tk602TH、中国）で、室温および注意深く制御された湿度（<40％）でエレクトロスピニングされました。さらに実験を行う前に、サンプルを少なくとも72時間真空乾燥オーブンに入れて、残っている溶媒をすべて除去しました。

走査型電子顕微鏡（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）

CS @ PGナノファイバー足場の形態は、室温で20 kVの加速電圧でSEM（VEGAS、TESCAN、チェコ）によって調査されました。ナノファイバーの直径（ n =100）は、画像解析ソフトウェア（Image J）を使用してSEM画像からさらに測定されました。

TEM観察とエネルギー分散型X線分光法（EDS）分析は、JEOL JEM-2100 plus（日本）を使用して実施されました。

フーリエ変換赤外分光法（FTIR）

FTIRは、Nicolet iN10 FTIR分光計（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）によって実行され、CS、PGナノファイバー、およびCS @PGナノファイバーの特徴的な官能基を評価しました。サンプルのスペクトルは、4000〜500 cm ^-1 の波長範囲で透過モードで記録されました。 解像度は2cm ^-1 。

リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液の多孔性と吸収

ナノファイバーの多孔性は、液体置換法を使用して実行されました。まず、ナノファイバーの乾燥重量をW ₁ として計量しました。 。次に、ナノファイバーの4つのグループをエタノールに25°Cで2時間浸漬し、W ₂ として重み付けしました。 。サンプル表面のエタノールを濾紙で除去し、サンプルの重量をW ₃ として記録しました。 。ナノファイバーの気孔率は、次の式で計算されました。

PBS溶液吸収試験では、得られたナノファイバーを乾燥状態で秤量し、Wdとして記録しました。次に、ナノファイバーを25°Cで24時間PBSに浸し、サンプル表面の余分な液体を除去した後、湿潤状態での重量をWwとして記録しました。膨潤率は次の式で測定できます：

上記の実験のすべての値は、平均±SD（ n ）として表されます。 =3）。

インビトロ分解挙動

得られたナノファイバーのリゾチームに対する耐性を判断するために、サンプルの分解性をスケジュールされた時間（1、4、7、10、および14日）に測定しました。ナノファイバーの初期重量はW _i として記録されました 。次に、サンプルをリゾチーム（500μg/ mL）を含むPBS溶液（pH 7.4）に浸し、37°C​​でinvitroでインキュベートしました。所定の分解間隔で、サンプルの各グループを取り出し、脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥して最終重量（ W _f ）。リゾチーム溶液は週に3回交換されました。ナノファイバー足場の残りの質量（％）は、次の式で定義されているように推定されました。

7日後のサンプルの劣化挙動を評価するために、ナノファイバーの形態をSEMで観察しました。

血液適合性分析

凝固時間

活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）を使用して、カバースリップ上でエレクトロスピニングされたナノファイバーとのインキュベーション後の血小板の少ない血漿（PPP）の凝固時間をテストすることにより、凝固の内因性および一般的な経路の活動を評価しました。このために、抗凝固処理された血液（約10 mL）を収集し、3000 rpmで20分間遠心分離して、血小板の少ない血漿（PPP）を得ました。各サンプルを200μLのPPPとともに37°Cで10分間インキュベートし、製造元の指示に従ってAPTTキットを使用して分析しました（ n =3）。

溶血検査

溶血速度は、エレクトロスピニングされたナノファイバーに曝露された希釈全血中の赤血球から溶液相に放出されたヘモグロビンの濃度を測定することによって評価されました。カバースリップ上のサンプルを個別に24ウェルプレートに入れ、37°C​​で30分間2 mLPBSに浸しました。ネガティブコントロールグループには2mLのPBSしか含まれていませんでしたが、ポジティブコントロールグループには赤血球の最大溶解を誘導する目的で2mLの脱イオン水が含まれていました（ n =各テストグループで3）。次に、前述の抗凝固処理した新鮮な全血40μLを各ウェルに加え、37°C​​で60分間インキュベートした後、懸濁液を遠心分離管に移し、100× g で遠心分離しました。 5分間。マイクロプレートリーダー（SynergyH1 / H1M、BioTek、中国）を使用して、上澄みを570nmでの吸光度を測定しました。

血栓形成性

エレクトロスピニングされたサンプルを多血小板血漿（PRP）とインキュベートした後、血栓形成の可能性をinvitroで評価しました。 PRPは遠心分離（1500 rpm、20分）によって調製され、血漿の上半分は廃棄されました。次に、カバースリップ上のナノファイバーを100μLのPRPで37°Cで2時間インキュベートし、その後の実験のためにPBSで3回穏やかにすすいだ。 PRPとインキュベートした後の血小板活性を評価するために、エレクトロスピニングされたナノファイバーを10％FBSを添加したDMEMに2時間と24時間保持し、CCK-8アッセイキットを使用してナノファイバーの血小板生存率を測定しました。 CCK-8（20μL）を24ウェルプレートの無血清DMEM培地200μLに添加し、1時間インキュベートしました。最後に、懸濁液をマイクロプレートリーダーで450nmの波長で測定しました。

細胞培養と細胞生存率

ヒト大動脈内皮細胞（HAEC）は、FBS（10％、v / v）およびストレプトマイシン/ペニシリン（1％、v / v）を添加したDMEMで、37°C​​および5％CO _{2の雰囲気で培養しました。} 。培地は週に3回交換されました。細胞は通常、0.05％トリプシン/ EDTAで3分間分離し、1000 rpmで遠心分離し、新鮮な培地に懸濁して細胞継代または細胞播種を行いました。

細胞を播種する前に、24ウェルプレート内のすべてのナノファイバー材料をUV照射下で1時間滅菌し、75％エタノール（v / v、％）に1時間浸漬しました。次に、ナノファイバーをPBS溶液で4回リンスし、DMEMにCO ₂ で12時間浸しました。 インキュベータ。細胞を1×10 ⁴ の密度で播種しました ナノファイバー上のウェルあたりの細胞数と培地は毎日交換されました。 24時間共培養した後、細胞をPBS溶液で3回洗浄し、カルセイン-AM / PI二重染色キット（YEASEN Biochemical Technology Co.、Ltd.、Shanghai、China）で染色しました。 PIは死細胞の染色に使用され、カルセイン-AMは生細胞の染色に使用されました。

ナノファイバーの細胞形態

ナノファイバーへの細胞接着を観察するために、蛍光顕微鏡（Nikon A1 MP、日本）で24時間共培養した後、細胞の形態を観察しました。まず、細胞を4％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定しました。次に、0.5％Triton X-100溶液を5分間使用して、細胞膜を透過性にしました。最後に、4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を使用して細胞核を染色し、ローダミン-ファロイジンを使用してF-アクチンを染色しました。定量分析（細胞密度、単一細胞面積、細胞伸長）は、ImageJを使用してさらに実行されました。

細胞増殖

複合ナノファイバーでの細胞増殖活性は、CCK-8アッセイキットを使用して実施しました。 HAECは、8×10 ³ の密度でナノファイバーに播種されました。 細胞/ウェル。培地は2日ごとに交換しました。 1、4、7日間の共培養後、細胞をPBS溶液で洗浄して、付着していない細胞を除去しました。次に、20μLのCCK-8と1:10の体積比の完全培地を24ウェルプレートにインキュベーターで1時間添加しました。吸光度は、450nmでElisaReaderによってテストされました。

DAPIとローダミン-ファロイジンによる細胞染色を蛍光顕微鏡で行い、異なるナノファイバーと2日と6日間共培養した後の細胞数の変化を直接観察しました。

統計分析

実験のすべてのサンプルは3回処理されました。すべてのデータは、平均値±標準偏差（SD）として表されます。サンプルの統計分析は、一元配置分散分析（ANOVA）によって決定され、 p で割り当てられた有意性との差異を比較しました。 <0.05。

結果と考察

CS @PGナノファイバーの調製と特性評価

図1は、CS @PGナノファイバー足場のエレクトロスピニングプロセスと抗凝固および細胞適合性のinvitro評価の概略図を示しています。内皮細胞の増殖を促進するための人工血管組織足場を開発するために、エレクトロスピニングプロセスを介して製造された複合ナノファイバーに対するPG（10％、v / v）溶液にさまざまな比率のCS（5、10、および15 wt％）を組み込みました。

ナノファイバーの製造とinvitro評価の概略図

CS @PGエレクトロスピニングナノファイバーの構造を観察するためにSEMを実施しました。図2に示すように、PG、5％CS @ PG、10％CS @ PG、15％CS @ PGナノファイバーのSEM画像は、エレクトロスピニング技術による連続的で滑らかなナノスケールの繊維を含む高密度の繊維構造を示しました。 。 PGナノファイバー（図2a）は、エレクトロスピニングのプロセスを通じてナノファイバー上に多くの不規則なビーズを示し、平均直径は406.01±146.28nmでした。エレクトロスピニングされた溶液の10％w / vは低粘度を示し、ビーズを含む不均一なナノファイバーが形成されたと説明されるかもしれません[20]。ポリマー溶液中のCSの量を5％wt。から10％wt。に増やすと、溶液の粘度が上がるため、ビーズのない均質なナノファイバーを実現できます（図2b、c）。これに対応して、5％CS @ PGと10％CS @ PGは、それぞれ382.35±152.99nmと300.29±100.85nmの小さい平均直径を示しました。この結果は主に、CS含有量の増加がそれに応じてエレクトロスピニング溶液の導電率を高めたためです[20]。しかし、ポリマー濃度が最大15％の場合、ポリマー溶液の粘度が高すぎて電界で伸ばすことができません。前のグループと同じ1mL / hの流量で、23 kVの印加電圧の下で、針先閉塞現象が現れ、テイラーコーンを観察できなかったことが観察されました。そのため、エレクトロスピニングされた溶液の流量と印加電圧は、それぞれ0.9 mL / hと20kVに調整されました。 15％CS @ PGナノファイバーは、平均直径266.92±105.43nmで正常に製造されました。

CSのさまざまな比率でのCS @ PGエレクトロスピニング足場のSEM画像と直径分布。 a PG、 b 5％CS @ PG、 c 10％CS @ PG、 d 15％CS @ PG

図3aに示すように、CSは5％CS @ PGおよび10％CS @PGナノファイバーに均一に分布していることがわかりました。ただし、CSアグリゲーションは15％CS @PGファイバーで検出されました。図3bに示すように、EDX元素分析を実行して、準備された繊維の硫黄含有量を検出しました。予想通り、硫黄含有量は、得られた繊維中のCS濃度の増加とともに増加しました。

TEM画像（ a ）およびCSのさまざまな比率（PG、5％CS @ PG、10％CS @ PG、および15％CS @ PG

）でのCS @PGエレクトロスピニング足場のEDX元素分析

FTIRスペクトル分析

FTIRスペクトル分析を実施して、調製したナノファイバー足場の化学基の特徴的な吸収ピークを決定しました。 PGおよびCSのFTIRスペクトルは、CS @PGナノファイバーグループと比較するためのコントロールグループと見なされました。 PGスペクトルでは、3300 cm ^-1 に現れる強い吸収帯 および2935cm ^-1 –NH ₂ に起因する可能性があります および–OH伸縮振動、およびCH ₂ それぞれ非対称ストレッチ。 1652 cm ^-1 にいくつかの特徴的な吸収ピークが現れました。 （アミドI）C =O伸縮振動の場合、1542 cm ^-1 （アミドII）N–H曲げ振動の場合、1441 cm ^-1 CH ₂ の場合 ストレッチ、1267 cm ^-1 （アミドIII）C–N伸縮振動用[21、22]。 CSスペクトルは、1245 cm ^-1 で特徴的な吸収帯を示しました。 、負に帯電したSO ₄ のS =O伸縮振動を表します ^2- [23、24]。

図4に示すように、5％CS @ PG、10％CS @ PG、および15％CS @ PGナノファイバーのFTIRスペクトルは、PCL、Gt、およびCSの特徴的なピークを一緒に示しました。 PGグループのスペクトルと比較して、CS @PGグループは1245cm ^-1 でCSの特徴的なバンドを示しました。 、およびCSバンドの強度は、ナノファイバーにCSが存在することによって増加しました。この発見により、CS @PGエレクトロスピニングナノファイバーにさまざまなCSの含有量が存在することが確認されました。

CS @PGエレクトロスピニングスキャフォールドのFT-IRスペクトル

ナノファイバーの多孔性、膨潤率、および分解性

繊維の高い多孔性は、材料が優れた相互接続性を持っていることを示しており、これは酸素と栄養素の細孔への拡散を助長し、細胞浸潤を促進します[25、26]。図5aは、ナノファイバーフィルムの多孔性を示しています。異なるCS比を含む得られたナノファイバーの気孔率は約80％まででした。エレクトロスピニングされたナノファイバーによって得られる高多孔性の構造は、自然のECMを模倣できるため、細胞に好ましい3D微小環境を提供します[27]。最大80％の気孔率を持つ組織工学の足場は、栄養素と代謝物の輸送に有益であると報告されています。

a 調製されたナノファイバーの多孔性。 b 調製されたナノファイバーのPBS吸収。 c PBS溶液で最大14日間分解した後の、CS @PGナノファイバーの残りの質量。 d 37°Cで7日間のPBS溶液中のナノファイバーフィルムのSEM顕微鏡写真

CS @ PGナノファイバー足場のPBS吸収率を比較して、フィルムのPBS取り込みに対するCSの影響を評価しました。図5bに示すように、PGスキャフォールドのPBS吸収率は586.34±49.44％であり、5％CS @ PGおよび10％CS @ PGナノファイバーはそれぞれ492.86±21.99％および510.04±69.55％でした。 15％CS @ PGグループのPBS吸収率（665.07±59.81％）は、5％CS @ PGおよび10％CS @PGのそれよりも有意に高かった。この結果は、複合ナノファイバー中のCSの含有量の増加が、フィルムのPBS取り込み特性を改善する可能性があることを示しています。これは、親水性基（カルボキシルおよびヒドロキシル）を含むCS分子の高い親水性が原因である可能性があります[28]。

インビトロ分解性実験のデータを図5cに示し、CS比の増加に伴い、CS @PGナノファイバー足場の分解速度も増加することがわかりました。これは、SO ₄ の存在に起因する可能性があります ^2- グループ[29]。図5cに示すように、ほとんどのスキャフォールドの分解率は7日後に増加し始め、14日目の分解結果はPGで8.45％、11.39％、13.97％、15.10％、5％CS @ PG、10でした。それぞれ％CS @ PG、および15％CS @PGナノファイバー足場。ナノファイバー足場のSEM画像（図5d）は、PBS溶液に7日間浸漬した後、わずかな腫れを示しました。 SEM画像は、開発されたナノファイバーが最大7日間の深刻な劣化と膨張を回避するのに十分安定しており、invivoまたはinvitroでの細胞応答に影響を与えることを示しています。

血液適合性評価

APTTは、内因性凝固メカニズムを介して血液または血漿を検出するためのシンプルで信頼性の高い方法です。 APTTは、エレクトロスピニングされたナノファイバーが血液凝固の遅延の可能性に及ぼす影響を測定するためにテストされました。 APTTによって検出された凝固時間は、コントロールPGと5％CS @ PGおよび10％CS @PGナノファイバー間の凝固時間の統計的に有意な減少を示しました。対照的に、15％CS @ PGナノファイバーをPPPとインキュベートした後、APTTの延長が見られ、抗凝固機能が改善されたことを示しています。図6aに示すように、血液凝固の影響はナノファイバーサンプルの直径に依存していました。溶血の程度と同様に、5％CS @ PGナノファイバーとの相互作用後に最短のAPTT凝固時間、エレクトロスピニングされた10％CS @PGとの最長のAPTTが見つかりました。 CS比の増加に伴い凝固時間が長くなりました。

a CS @PGナノファイバーのAPTT。 b サンプルの溶血率。 c ナノファイバーの血小板代謝活性。 n =3、* p <0.05

ASTM F756-00（2000）によると、生体材料の溶血率は<5％である必要があります[30]。この研究での溶血の程度は、赤血球から放出されたヘモグロビンの比色分析を使用して実行され、次の式で計算できます。溶血（％）=（OD _sam − OD _neg ）/（OD _pos − OD _neg ）×100％。図6bに示すように、すべてのサンプルは非溶血性であり、顕著な溶血は発生しませんでした（溶血率は5％未満です）。

血小板生存率実験のデータを図6cに示します。 2時間後、付着した血小板の代謝活性が最も高く、PRPとナノファイバー、特にPGナノファイバーとの相互作用後に最大値に達しました。興味深いことに、24時間後、すべてのサンプルで血小板活性が低下しました。この結果は、ナノファイバーの構造による急速な血小板の活性化に起因する可能性があり、滑らかな表面との接触時の安定した長期の血小板活性化と比較して、成長因子の迅速な消費と放出をもたらします[31]。血小板の通常の寿命は約8〜10日で、血小板が活性化し始めると短くなります。

生/死細胞染色

ナノファイバーの細胞適合性に対するCSの影響は、細胞の生存率、接着形態、およびナノファイバーへのHAEC評価の6日間の増殖によって調査されました。付着した細胞は、カルセイン-AM / PI二重染色キット、DAPI染色、およびCCK-8アッセイキットを使用して評価しました。

図7a–eは、さまざまなナノファイバーに付着した生きているHAECと死んでいるHAECの蛍光画像を示しています。カルセイン-AM（緑）とPI（赤）を使用して、それぞれ生細胞と死細胞を染色しました。生細胞がCS @ PG複合ナノファイバーに付着していることが観察でき、異なる比率のCSを含むナノファイバーはHAECに対して毒性がないことが示されました。ナノファイバー上の生/死細胞数のさらなる定量分析は、Image Jによって調べられました（図7f）。 PGナノファイバー上の生細胞と死細胞の割合と比較して、異なるCS比を含むPGの他の3つのグループ、特に10％CS @ PGグループと15％CS @ PGグループは、生細胞の割合が高く、割合が増加しました。 CS濃度の増加に伴い。この結果は、ナノファイバーにCSが存在することが、細胞の生存率を維持するのに有利であることを示しています[32]。

CS @PGスキャフォールド上のHAECの細胞生存率。 a 組織培養プレート（TCP）、 b PG、 c 5％CS @ PG、 d 10％CS @ PG、 e 15％CS @ PG、 f さまざまなナノファイバー足場の生/死細胞数の割合、 n =3

ナノファイバーでの細胞接着挙動

良好な生体適合性を備えたナノファイバー足場は、血管の生成のための主要な要件であると考えられています。優れた生分解性と優れた生体適合性を備えた天然Gtを備えたPCLは、ヒドロゲル、エレクトロスピニングされたナノファイバー、3次元足場などのさまざまな構造を持つ組織工学で広く使用されていました[21、33、34]。複合ナノファイバー上のHAECの形態と、24時間での細胞と材料の相互作用を蛍光顕微鏡で観察しました。細胞密度10％CS @ PGおよび15％CS @ PGは、PGおよび5％CS @ PGよりも統計的に有意であり、より高いレベルでのCSの添加が細胞接着を促進することを示しています。図8cに示すように、5％CS @ PGと15％CS @ PGの単一セル領域は、他のナノファイバーグループよりも大きかった。ただし、10％CS @ PGのセル伸長は、PG、5％CS @ PG、および15％CS @ PGよりも大幅に高かった（図8d）。この結果は、10％の濃度でCSを添加すると、HAECの拡散を促進できると説明されるかもしれません。 HAECは、複合ナノファイバー、特に10％CS @ PGおよび15％CS @ PGに付着、拡散、および成長する可能性があることがわかりました。したがって、これら2つのナノファイバー材料は、臨床応用における安全で有望な血管材料の候補と見なすことができます。

a CS @ PG足場上のHAECの細胞接着形態（DAPI：細胞核;ローダミン-ファロイジン：細胞骨格）。 b 細胞密度。 c 単一セル領域、 d ナノファイバーのさまざまなグループでの細胞の伸長

細胞増殖

CS @ PGナノファイバーでの細胞増殖と生存率は、蛍光顕微鏡とCCK-8テストによってin vitroで調査されました（図9a–c）。 The electrospun PG scaffold was selected as the positive control. The results of the CCK-8 assay for different nanofibrous films are displayed in Fig. 9c. In 2, 4, 6 days of cells culturing, the cell number increased with the culture time for all groups. On day 6, the OD value of 10%CS@PG nanofibers was significantly higher than that of the PG scaffold. The cell proliferation comparison of 5%CS@PG, 10%CS@PG, and 15%CS@PG indicated that the cell proliferation rate was increased as the CS presence in composite nanofibers in a certain range. However, the cell proliferation capability was also influenced by the surface morphology of nanofibrous materials. Since the 15%CS@PG nanofiber exhibited strong viscosity due to the higher CS ratio in electrospinning polymeric solution, cell proliferation might be affected.

a HAECs proliferated on the nanofibers detected by cell staining for 2, 6 days, b Cell density on the nanofibrous scaffolds at 2, 6 days, n  = 3, *p  < 0.05, c CCK-8 assay after HAECs cultured on the PG, and CS@PG nanofibers at 2, 4, 6 days

Conclusions

In summary, biomimetic CS@PG composite nanofibers were successfully fabricated using electrospinning technology. Changed fiber morphology and diameter were obtained by varying CS concentrations in PG nanofibers. The CS@PG nanofibers possessed appropriate porosity (~ 80%) and PBS solution absorption (up to 650%). The incorporation of CS in PG nanofibers significantly improved their anticoagulant properties, prolonged their coagulation time, and enhanced cellular responses. Particularly, 10%CS@PG nanofibers exhibited favorable cell adhesion, elongation, and proliferation. Therefore, the PG composite nanofibers incorporated with a certain amount of CS inhibited antithrombogenicity and enhanced endothelial cell responses, which could be developed as a promising tissue-engineering scaffold in blood vessel repair and regeneration.

データと資料の可用性

All data generated or analyzed during this study are included within this article.