ナノクレイ：COVID-19に対する有望なナノ免疫防御

概要

効果的なCOVID-19ワクチンの開発には、多くの努力にもかかわらず、さらに長い時間を要する可能性があります。人間がすでに経験している伝統・自然医療が、より早期の解決策となり得ます。研究チームはナノクレイをがん転移、メラノーマ治療、骨再生において高親和性材料として使用してきた経験から、これらのナノクレイをCOVID-19の予防・治療に応用することを提案します。高い親和性により、ナノクレイはウイルスがヒトhACE2と結合する前に捕捉します。本研究では、ナノクレイの有無におけるコロナウイルススパイク蛋白とhACE2蛋白の相互作用について、分子レベルのシミュレーションとモデリングを行いました。結果、SARS-CoV-2スパイクとナノクレイの間には、スパイクとhACE2の間よりも非常に高いレベルの親和性・凝集性が示されました。これらのナノクレイはすでに薬物キャリアとして使用されているため、「クレイ単独」医薬品として注射投与できる可能性があります。今後のin vitroおよびin vivo研究への提言も行っています。

背景

新型コロナウイルスSARS-CoV-2の突然の出現と急速な拡大は、人類の健康と生命に多大な影響を与え、世界経済を深刻に打撃しました。SARS-CoV-2スパイクSは、ヒトアンジオテンシン変換酵素2（hACE2）に高い親和性で結合し、標的細胞への侵入受容体として利用します（図1a, b）[1]。ウイルス表面のスパイク蛋白は、コロナウイルスの宿主細胞への侵入を媒介します。SARS-CoV-2スパイク蛋白は、受容体結合ドメイン（RBD）を含み、これが明示的にhACE2を受容体として認識します[2, 3]。hACE2表面には、SARS-CoV-2 S結合に不可欠な2つのウイルス結合ホットスポットが存在します。SARS-CoV-2 RBDにおける自然選択による複数の変異がこれらのホットスポットを取り囲み、感染性、病原性、種間およびヒト間伝播を制御しています[2, 4, 5]。

現在、SARS-CoV-2を特異的に標的とする臨床承認済みのワクチンや薬剤は存在しません。ワクチン開発の正規プロトコルに従えば、効果的なワクチンが完成するまでにはさらに長い時間を要します。SARS-CoV-2に対する治療用抗体の開発への関心は高まっていますが、多くの努力にもかかわらず、これらの抗体はまだ発見されていません[6]（わずかな試験を除く[7]）。ある試験では、S糖蛋白のRBDに結合することでSARS-CoV-2を強力に中和することが示されました[8]。この試験では、SARS-CoV-2に対する中和効果が増大するため、異なる抗体の混合物である抗体カクテルが推奨されています[8]。しかし、過去にSARS-CoV回復期患者由来の抗体を用いてSARS-CoV感染を治療した際、抗体依存性感染増強（ADE）によるウイルス感染性の増大や有害な免疫反応などの副作用が報告されています[7]。さらに、SARS-CoVおよびMERSのワクチン開発の経験から、SARS-CoV-2に向けた取り組みが実を結ぶ可能性はかなり低いと考えられます。したがって、人間が安全に摂取・服用してきた歴史を持つ自然・伝統医療が、SARS-CoV-2の治療選択肢の一つとなり得ます。天然素材であり、人間による使用・摂取の実績があることから、「高帯電ナノクレイ」をコロナウイルスブロッカーおよびスパイク媒介性ヒト細胞侵入阻害剤として使用することを提案します。

ナノクレイは、堆積岩の鉱物に由来するナノサイズの天然素材であり、細菌やウイルスに対して非常に高い親和性を持ちます[9]。分子構造における同質置換により、これらのナノクレイは表面に電荷欠損を示します。この表面電荷欠損は水分子と溶解陽イオンによって中和されます（図2）。帯電構造と大きな表面積を持つクレイナノ粒子は、細菌表面や細菌毒素に見られる帯電エンティティに対する親和性を持ちます。その特異な生物医学的特性には、高吸収性、微生物を包み込む能力、無毒性が含まれます。各電気活性クレイ鉱物は独自の形態、特性、相互作用行動を持ちます。ナノクレイの最も研究されている生物医学的応用には、5-フルオロウラシルやトラスツズマブなどの抗がん剤のキャリアや複合体としての役割があります[11-17]。したがって、これらは複数の疾患に対する潜在的な代替医療となっています[18-22]。クレイナノ粒子は粘着性があるため、持続放出医薬品のキャリアとしても使用されてきました[15, 23]。ナノクレイは牛ロタウイルスと牛コロナウイルスの吸着・治療にも成功しています[24]。研究者たちはメトトレキサート（MTX、抗がん剤）を陰イオン性クレイにインターカレートさせ、ナノハイブリッド薬剤を作製しました[25]。共沈殿法とその後の水熱法を用い、化学的・構造的・形態的に明確に定義された二次元薬剤-クレイナノハイブリッドを調製しました。別の研究では、ベントンイトナノクレイが生体適合性と高い担持能力により、薬物送達担体の調製に使用可能であることが発見されました[26]。ドキソルビシン-ベントンイトナノクレイ複合体（DOX-Bent複合体）を調製し、メラノーマの腫瘍内化学療法用持続放出薬物送達システムを形成しました。モンモリロナイトクレイが最近、添加剤と薬物キャリア材料として研究されているため、これらのナノクレイ複合体は様々な投与形態、主に薬物の制御放出への応用が期待されています[27]。研究者たちはまた、ナノクレイを最近の二機能薬物送達システム（DDS）に利用し、甲状腺がん治療に用いられるドキソルビシン（DOX）の毒性を低減しつつ薬物送達効率を高められることを見出しました[28]。12種類の単一-単一タイプ光切断性両親媒性ヤヌスデンドリマーのライブラリを用いて、研究者たちは自己組織化光応答性デンドリメロソーム小胞プラットフォームを開発しました[29]。ナノクレイと同様に、表面修飾されたバイオアクティブなウイルス模倣有機ナノ小胞（グリコ）デンドリメロソーム由来は、SARS-CoV-2と宿主の病原性分子相互作用を顕在化させ、ウイルスがヒト免疫系から逃れるのを助ける構造修飾を持っています[30]。

著者らはこれまでの相当な研究を通じて、帯電クレイ鉱物の基本的特性評価と挙動モデリング[31-33]、がん転移制御への応用[10]、メラノーマ治療に関するin vitroおよびin vivo研究[34]、カルシウム沈着・骨再生研究[35]を開発してきました。著者らの先行研究[35]では、クレイナノ粒子が帯電表面に高い親和性を持つことが実証されました。ナノクレイの高い吸着親和性とがん細胞の増加した非特異的接着吸引力により、ナノクレイはがん転移制御の好適な候補となります。その研究では、2種類の帯電クレイ鉱物、Na-モンモリロナイト（SWy-3）とパリゴルスカイト（PFl-l）を用いたがん細胞転移制御の可能性を示しました。さらに、著者らの先行研究[35]でのナノクレイによるがん転移制御の知見を発展させ、in vitroおよびin vivo研究を通じて、これらのナノクレイがメラノーマがん細胞に対して、主に細胞増殖と生存率において抑制効果を持つことを確立しました[34]。これらの先行研究では、実験室実験に加え、ナノクレイと細胞の相互作用に関する分子レベルシミュレーションも実施しました。これらのシミュレーションにより、クレイナノ粒子の有無における相互作用の相対的な凝集性・親和性レベルの評価が可能となりました。

以上の著者らのナノクレイの高親和性ポテンシャルに関する全経験に基づき、ナノクレイが抗体を模倣し、コロナウイルスをヒトhACE2と結合する前に引き寄せ、包み込むことができると提案します。本論文は、分子レベルシミュレーションとモデリングアプローチを通じてこの認識を確立するための第一歩です。分子レベルシミュレーションの結果に基づき、次のin vitroおよびin vivo研究フェーズへの提言の概要も提供します。これらのナノクレイは医薬品キャリアとしても成功裏に使用されているため、「クレイ単独」医薬品として注射・経口投与可能であると判断し、そのための試験的ナノクレイ投与方法論を提案します。

材料-分子

SARS-CoV-2およびhACE2の選択と定式化

SARS-CoV-2スパイクSおよびhACE2の分子は、蛋白質データバンクWebサイトRCSBから入手しました[36-38]。Materials Studioソフトウェア[39]で定式化されたSARS-CoV-2スパイクSおよびhACE2の分子モデルをそれぞれ図3a, bに示します。シミュレーションの前に、これらの分子はソフトウェアの電荷平衡法QEqを用いて帯電させました。

ナノクレイ結晶子の選択と定式化

スメクタイト群クレイ鉱物の中で最も活性の高いメンバーの一つであるNa-モンモリロナイトを研究対象として選択しました。Na-モンモリロナイトは層状フィロケイ酸塩クレイスメクタイトです（図2）。コロイド形態では、隣接層間の空間に遊離ナトリウム、カルシウム、マグネシウム陽イオンが含まれ、外部の負帯電表面に静電的に引き付けられています[40]。乾燥粉末状態では、Na-モンモリロナイトは約0.5 × 0.5 × 0.001ミクロンの等方的なフレーク/シートとして存在します（図2a）。これらの層間表面の負電荷は陽イオンによって平衡化されています。コロイドとしては、層間陽イオンがクレイ粒子から解離し、他の負帯電表面と結合します。これらの粒子は、末端の切断結合の存在により正帯電したエッジも持ちます。これらのナノクレイの形態と更なる特性を表1に、Materials Studioソフトウェアでの結晶子定式化を以下に説明します。

ソフトウェアでは、CEC、交換性陽イオン、層間電荷などの基本特性（表1）に基づきNa-モンモリロナイト結晶子を定式化しました。分子/結晶子のサイズは、動的光散乱（DLS）法による粒子径分析の結果[10]に基づいて選択しました。ソフトウェアで作成されたクレイ結晶子の最終形態を図3cに示します。固有特性を用いてソフトウェアの設計モードでこれらの結晶子を調製した後、ソフトウェアの電荷平衡法QEqを用いて帯電させました。

方法-分子レベルシミュレーション

本研究のこの部分は、SARS-CoV-2スパイクSとクレイ結晶子、およびhACE2との相互作用のシミュレーションと評価で構成されます。これらのモデルが実際のin vitro条件を完全に再現するものではないかもしれませんが、すべての本質的相互作用が組み込まれており、意図した相対的・比較的研究に非常に適しています。

ソフトウェアでは、定式化されたSARS-CoV-2 S、Na-モンモリロナイト結晶子、hACE2の配置の吸着とシミュレーションを、モンテカルロ（MC）法と分子力学（MM）法を用いて実施しました。全シミュレーション構成における親和性の増強は、計算された凝集エネルギー密度（CED）の観点から評価しました。CEDは分子系の凝集性の尺度と見なされます。シミュレーションには大規模計算が伴うため、KFUPM（サウジアラビア）の高性能計算施設（HPC）を使用しました。全体的方法論、特定手法とシミュレーションパラメータの選択は、著者らの先行研究[41-47]に基づいており、以降のセクションで詳細を説明します。

SARS-CoV-2スパイク（S）とhACE2およびクレイ結晶子の相互作用

SARS-CoV-2 Sとクレイ結晶子の相互作用をシミュレーションするため、Na-モンモリロナイトクレイの結晶子を様々な数、SARS-CoV-2スパイクSモデルに吸着させました。これらの吸着シミュレーションには、ソフトウェアの吸着モジュールでメトロポリスモンテカルロ法を選択しました。各吸着ステップで、クレイ結晶子がスパイクSモデル周辺の空間を占有し、複合体の全エネルギーを低下させます。必要数の結晶子を最大25,000ステップで吸着させた後、ソフトウェアのForciteモジュールを用いてMD原理に基づき系のエネルギーを最小化しました。同様の吸着プロセスを、SARS-CoV-2スパイク分子とhACE2の相互作用モデリングでも繰り返しました。このプロセスでは、hACE2分子をSARS-CoV-2のスパイクSのRBD周辺に吸着させました。吸着プロセス完了後、ソフトウェアのMDベースモジュールを用いて定式化のエネルギーを最小化しました。

ソフトウェアのForciteモジュール（NPTアンサンブル：粒子数、圧力、温度一定）を用い、修正万有力場[41]でMDシミュレーションを行いました。シミュレーションは5〜30 ps、間隔0.5 fs、または一定体積が得られるまで実行しました。温度制御には減衰定数0.1 psのBerendsenサーモスタットを使用しました。MDシミュレーション中、温度を310 K（37℃）に一定に保ち、大気圧（100 kPa）としました。圧力制御には減衰定数0.1 psのBerendsenバロスタットを使用しました。Berendsen法は、ソフトウェアで利用可能な他のサーモスタットとバロスタットを用いた複数の試行の後、単結晶子に最も適切と判断されました。モンテカルロ法では、交換、コンフォマー、回転、並進、再成長の比率パラメータをそれぞれ0.39、0.2、0.2、0.2、0.2とし、対応する確率も同様に設定しました。回転と並進の振幅はそれぞれ5°と1Åとしました。

凝集エネルギー密度（CED）測定

本研究では、SARS-CoV-2-クレイ結晶子複合体とSARS-CoV-2-hACE2複合体における親和性/結合レベルの評価を、CEDの変化を通じて測定しました。クレイ結晶子の吸着と各構成の分子動力学実施後、Forciteモジュールの凝集エネルギー密度オプションを用いてCEDを決定しました。著者らは、全CED、ファンデルワールスCED、静電CEDで構成されるCED概念が、様々な分子レベルプロセスと相互作用をかなり正確に説明し、シミュレートされた複合体間で生成される親和性/結合の程度をシミュレートできると経験しています[41-47]。定量的に、CEDは1モルの物質を液相から気相へ移行させるのに必要なエネルギー量と定義されます。また、分子間の相互親和性/引力の尺度でもあり、NPTアンサンブルで平均化された静電力とファンデルワールス力として表現されます。

Forciteモジュールでは、ファンデルワールスエネルギーを原子ベースのカットオフで評価しました。この方法では、非結合相互作用をカットオフ距離まで単純に計算し、この距離を超える相互作用を無視します。直接カットオフによる不連続性を避けるため、ほとんどのシミュレーションではスイッチング関数を用いて、一定の距離範囲で非結合相互作用を滑らかにオフにします。実際のポテンシャルに平滑化関数を乗じて有効ポテンシャルを作成します。中間範囲での関数の選択は重要で、この領域で連続的に微分可能である必要があります（力を計算するため）。本研究では、スプライン幅1Å、カットオフ距離12.5Åの三次スプライン平滑化関数を使用しました。

結果と考察

SARS-CoV-2 S-hACE2複合体の最終構成を図4aに、SARS-CoV-2スパイクと異なる数のクレイNa-モンモリロナイト結晶子の複合体を図4b, cにそれぞれ示します。比較のため、SARS-CoV-2スパイク上の様々な割合/数のクレイ結晶子と、後者のhACE2との相互作用の全CEDを図5にプロットしました。

著者らの経験に基づき、ナノクレイは高い接着特性によりSARS-CoV-2阻害剤としても機能し得ると仮説を立てました。SARS-CoV-2表面のスパイクSと強く結合することで阻害します。SARS-CoV-2とナノクレイ間のCEDが、前者とhACE2の間よりも非常に高いこと（図5）から、ナノクレイがSARS-CoV-2のhACE2との結合を阻害できることが示唆されます。さらに図5から、ナノクレイによる阻害程度が量（用量）依存的に増大することも結論付けられます。

ナノクレイとSARS-CoV-2スパイクSの相互作用

著者らは先行研究で、ナノクレイががん細胞とその微小環境間の接着を促進し、転移を制御する役割を示しました[10]。Na-モンモリロナイトとパリゴルスカイトの75/25混合物の接着力測定では、がん細胞と細胞外マトリックス蛋白質間の接着が100%増加しました（図6a）。ナノクレイがRaji細胞とフィブロネクチン蛋白質を結合するSEM像を図6bに示します。サンプル撮像は、フロリダ大学ミラー医学部のFEI ESEM-FEG XL-30でSEMモードで実施しました。著者らはまた、静電気、ファンデルワールス、ゼータ電位（ZP）吸引力が接着プロセスを支配していることを発見しました[10]。同じメカニズムが、ナノクレイの接着表面とSARS-CoV-2スパイクの結合を促進したと結論付けられます（図7）。ZPはコロイド形態での分散または凝集傾向の尺度であり、懸濁媒質中の他の成分との相互作用を含みます。一般に、ゼータ電位が30 mV以上（正または負）なら分散傾向、5 mV未満なら凝集を示します。本研究で使用したクレイナノ粒子の高い分散傾向ZP（-24〜-32 mV）は、より高い分散傾向をもたらし、結果としてSARS-CoV-2スパイクとの相互作用を増幅する表面積の増大につながります。ZPに基づけばNa-モンモリロナイトナノ粒子は親水性ですが、塩の存在下では疎水性と親水性表面間の第2接着メカニズムも促進します[10]。これらのクレイナノ粒子は親水性と比較的高い反発性酸-塩基（AB）相互作用（表1）により高い分散傾向を持ちます。高い分散は、高い表面積の生成を通じて引力相互作用を増大させます。大きな表面積は、ファンデルワールス引力と反対帯電表面間の静電気力による大きな引力を促進します。また、比較的程度は低いものの、Na-モンモリロナイト粒子の正帯電エッジもスパイクSに電気的に引き付けられます。

SARS-CoV-2スパイクSとクレイ結晶子の相互作用に関する分子レベルシミュレーション結果（図5）も、上記の相互作用挙動を裏付けています。クレイナノ粒子の吸着により、密接に相互作用する強いファンデルワールス引力場が形成されることが観察されました。これらのファンデルワールス引力場は、クレイ/SARS-CoV-2構成のCEDを高めます。クレイ結晶子添加後の全CEDの大幅な増加（図5）は、SARS-CoV-2がこれらの粒子に対して非常に高い親和性を持つことを示し、前者のhACE2に対する親和性と比較しても明らかです。

ナノクレイとしての疑似抗体

著者らのこれまでの全研究によって確立されたナノクレイの高親和性ポテンシャルに基づき、ナノクレイが抗体を模倣し、コロナウイルスをヒトhACE2と結合する前に引き寄せ、包み込むことができると判断します。抗体は、適応免疫応答の一環として形質細胞によって合成される糖蛋白質で、感染の排除を助けます。抗体は、病原体のオプソニゼーションによる食食作用促進、補体系の活性化、微生物の凝集、ウイルスと毒素の中和など、複数の方法で感染排除を助けます。ウイルス表面蛋白質に結合すると、抗体はウイルスが標的細胞上の標的受容体に付着するのを防ぎ、細胞への侵入を阻止します。抗体結合は表面蛋白質の異なる部位で起こり、同じ効果をもたらす様々なメカニズムを生じます。SARS-CoV-2の場合、抗体による2つのウイルス中和メカニズムが観察されています[1, 48]（図1c, d）。一つは、抗体がSARS-CoV-2-RBDの結合部位に直接結合し、標的受容体hACE2と競合するメカニズムです。もう一つは、標的受容体との競合なしにRBDの他の部位に抗体が結合するメカニズムです。後者は、研究で発見された最も強力な単クローン抗体（mAb）による中和に関与することが示されています[1, 48]。抗体がSARS-CoV-2 RBDと相互作用し、hACE2との結合を阻害するのと類似して、ナノクレイでも同様の分子レベルモデルを作成し、コロナウイルスの類似した阻害を示しました（図8）。非常に高い親和性により、ナノクレイはSARS-CoV-2のスパイクに引き付けられ、これらのスパイクのRBDがhACE2と結合するのを制限します。

提案されるナノクレイ投与方法論

クレイの薬物キャリアとしての利用は複数回テストされ、ヒト細胞に対する細胞毒性がほぼないという有望な結果が得られています。カオリナイトクレイ鉱物は潜在的薬物送達システムでの使用がテストされ、高い生体適合性と非常に低い細胞毒性が示されました[11]。ポリ（d,l-ラクチド-コ-グリコリド）/モンモリロナイトナノ粒子のin vitro細胞毒性も無視できるレベルであることが実証されました[14]。パリゴルスカイト-ポリエチレンイミン-フルオレセインイソチオシアネートナノコンポジットもin vitroでほぼ細胞毒性を示しませんでした[13]。著者らもin vivo研究でメラノーマ治療のためにナノクレイを皮下投与した経験があります[34]。クレイが抗がん剤キャリアや他の持続放出医薬品[25-28]として使用されていることに基づき、ナノクレイは「クレイ単独」医薬品として注射可能であると提案します（in vivoおよび臨床試験での検証を条件とします）。

ナノクレイは生分解性ではありませんが、類似の無機ナノ粒子の設計と体内での代謝性能に関する包括的理解[49]により、これらのナノクレイをヒト体内で排泄可能な無機エージェントとして分類することも可能です。

結論と提言

著者らのこれまでの全研究によって確立されたナノクレイの高親和性ポテンシャルに基づき、これらは抗体を模倣し、コロナウイルスをヒトhACE2と結合する前に引き寄せ、包み込むことができます。

SARS-CoV-2スパイクSとクレイ結晶子の相互作用に関する分子レベルシミュレーション結果は、密接に相互作用する強いファンデルワールス引力場の形成をもたらします。これらのファンデルワールス引力場は、クレイ/SARS-CoV-2構成のCEDを高めます。クレイ結晶子添加後の全CEDの大幅な増加は、SARS-CoV-2がこれらの粒子に対して非常に高い親和性を持つことを示し、前者のhACE2に対する親和性と比較しても明らかです。

今後、SARS-CoV-2と異なる濃度のナノクレイとのin vitro相互作用研究を実施することを提案します。in vitroフェーズで開発されたナノクレイの最適用量に基づき、動物を用いたin vivo研究を実施することを提案します。動物実験はナノクレイありとなしの両方で行い、ナノクレイ用量を最終決定し、臨床試験の基盤を築くべきです。