COVID-19の潜在的な疑似抗体としてのナノクレイ

背景

新規コロナウイルスSARS-CoV-2の突然の出現と急速な蔓延は、世界経済に重大な影響を与えるだけでなく、人間の健康と生活にも大きな影響を及ぼしました。 SARS-CoV-2スパイクSは、ヒトアンジオテンシン変換酵素2（hACE2）に高い親和性で結合し、標的細胞に侵入するためのエントリー受容体として使用します（図1a、b）[1]。ウイルス表面スパイクタンパク質は、宿主細胞へのコロナウイルスの侵入を仲介します。 SARS-CoV-2スパイクタンパク質には、受容体hACE2として明示的に認識する受容体結合ドメイン（RBD）が含まれています[2、3]。 hACE2の表面には、SARS-CoV-2Sの結合に重要な2つのウイルス結合ホットスポットが含まれています。 SARS-CoV-2 RBDで自然淘汰されたいくつかの変異は、これらのホットスポットを取り囲み、SARS-CoV-2の感染力、病因、異種間伝播、およびヒトからヒトへの伝播を調節します[2、4、5]。

ヒトhACE2に対するSARS-CoV-2攻撃とそれに続く免疫系応答の概略図。 a 、 b 干渉なしでhACE2を結合するRBD。 c RBDは受容体付着部位で抗体と複合体を形成しているため、hACE2と競合します。 d 受容体が結合する場所以外の部位でRBDがRBDと複合体を形成し、RBD構造が変化し、RBDのhACE2へのロックとキー結合が中断されます

現在、SARS-CoV-2を特異的に標的とする臨床的に承認されたワクチンや薬はありません。ワクチン開発の実際のプロトコルに従うと、効果的なワクチンを考案するのにはるかに長い時間がかかる場合があります。 SARS-CoV-2に対する治療用抗体の開発には多くの関心が寄せられています。しかし、多くの努力にもかかわらず、これらの抗体は、いくつかの試験[7]を除いて、まだ発見されていません[6]。ある試験では、S糖タンパク質のRBDに結合することによるSARS-CoV-2の強力な中和が示されました[8]。この試験[8]では、SARS-CoV-2に対する中和効果が高まるため、さまざまな抗体の混合物である抗体カクテルが推奨されます。しかし、過去にSARS-CoVの回復期の患者からの抗体を使用して、SARS-CoV感染症を治療すると、抗体依存性感染増強（ADE）などの患者に有害反応が示され、ウイルス感染力の増加やその他の有害な免疫応答が引き起こされます[7]。さらに、SARS-CoVおよびMERSのワクチン開発努​​力の経験に基づくと、SARS-CoV-2の努力が実現する可能性は非常に低いように思われます。したがって、ヒトによる安全な摂取/摂取の歴史を持つ自然/伝統的な薬は、SARS-CoV-2の治療選択肢の1つと見なすことができます。天然素材であり、人間の使用/消費の歴史があるため、コロナウイルスの遮断薬およびスパイクを介した人間の細胞への侵入の阻害剤として使用する「高電荷ナノクレイ」をお勧めします。

堆積岩の鉱物に由来するナノサイズの天然素材であるナノクレイは、バクテリアやウイルスに対して非常に高い親和性を持っています[9]。それらの分子構造における同形置換のために、これらのナノクレイはそれらの表面で電荷不足を示します。それらの表面のこの電荷不足は、水分子と溶解した陽イオンによって中和されます（図2）。粘土ナノ粒子の帯電した構造と大きな表面積は、細菌の表面や細菌の毒素に見られるように、帯電した実体に対する親和性をそれらに与えます。それらの明確な生物医学的特性には、高吸収、微生物を飲み込む能力、および毒性がないことが含まれます。電気的に活性な粘土鉱物のそれぞれは、その独特の形態、特徴、および相互作用の振る舞いを持っています。ナノクレイの最も研究されている生物医学的応用には、5-フルオロウラシルやトラスツズマブなどの抗がん剤の担体および複合体としての機能が含まれます[11、12、13、14、15、16、17]。したがって、それらはいくつかの病気の潜在的な代替医療でした[18、19、20、21、22]。粘土ナノ粒子は、その接着性により、徐放性医薬品の担体としても使用されています[15、23]。ナノクレイは、ウシロタウイルスとウシコロナウイルスの吸着と処理にも使用されています[24]。研究者[25]は、抗がん剤であるメトトレキサート（MTX）を陰イオン性粘土に挿入して、ナノハイブリッド薬を作成しました。彼らは、共沈法とそれに続く熱水法を使用して、この化学的、構造的、および形態学的に明確に定義された2次元薬物粘土ナノハイブリッドを調製しました。研究者[26]は、生体適合性と高い負荷容量により、ベントナイトナノクレイをドラッグデリバリービヒクルの調製に使用できることを発見しました。この研究では、メラノーマの腫瘍内化学療法のための徐放性ドラッグデリバリーシステムを形成するために、ドキソルビシン-ベントナイトナノクレイ複合体（DOX-ベント複合体）を調製しました。モンモリロナイト粘土は、添加剤および薬物担体材料として使用されることが最近研究されているため、これらのナノ粘土複合材料は、主に薬物の制御放出のために、さまざまな投与形態での使用をアピールします[27]。研究者[28]はまた、ナノクレイを最近の二重機能ドラッグデリバリーシステム（DDS）に使用して、ドラッグデリバリーの効率を高め、甲状腺がんの治療に使用されているドキソルビシン（DOX）の毒性を減らすことができることを発見しました。研究者[29]は、12個のシングルシングルタイプの光切断可能な両親媒性ヤヌスデンドリマーのライブラリを使用して、自己組織化光応答性デンドリマーソームベシクルプラットフォームを開発しました。ナノクレイと同様に、（グリコ）デンドリマーソームからの表面修飾生物活性ウイルス模倣有機ナノベシクルは、SARS-CoV-2の発現に寄与する構造修飾を持ち、ウイルスがヒト免疫系から逃れるのを助ける病原性分子相互作用をホストします[30]。

a SEM画像と b 配置、同形置換、電荷不足、および層間カチオンを示すNa-モンモリロナイトの対応する分子構造（[10]から）

かなりの先行研究を通じて、荷電粘土鉱物の基本的な特性評価と挙動モデリング[31,32,33]、および黒色腫治療に関するinvitroおよびinvivo研究[34]での癌転移の制御におけるそれらの応用を開発しました。 、およびカルシウム沈着/骨再生の研究[35]。著者による以前の研究[35]で、粘土ナノ粒子が帯電した表面に対して高い親和性を持っていることが実証されました。ナノクレイの高い引力親和性および癌細胞の増加した非特異的接着引力は、ナノクレイを癌転移を制御するための好ましい候補にする。その研究では、癌細胞の転移を制御するために2つの帯電した粘土鉱物の使用の可能性を示しました：Na-モンモリロナイト（SWy-3）とパリゴルスキー石（PF1-1）。癌転移の制御のためのこれらのナノクレイの使用に関する著者の以前の研究[35]の発見に加えて、我々はまた、invitroおよびinvivo研究を通じて、これらのナノクレイが黒色腫に対して抑制効果を有することを確立した。癌細胞、主に細胞増殖と生存率[34]。これらの以前の研究では、実験室での実験に加えて、分子レベルのシミュレーションもナノクレイと細胞の相互作用について実行されました。これらのシミュレーションは、粘土ナノ粒子がある場合とない場合の相互作用における凝集性/親和性の相対レベルの評価を提供しました。

ナノクレイの高親和性の可能性に関する著者の上記のすべての経験に基づいて、ナノクレイを抗体として模倣することができ、したがって、ヒトhACE2に関与する前にコロナウイルスを引き付けて飲み込むことができることを提案します。この論文は、分子レベルのシミュレーションとモデリングのアプローチを通じてこの認識を確立するための第一歩です。分子レベルのシミュレーションの結果に基づいて、invitroおよびinvivo研究の次の段階のための推奨事項の概要も提供されます。これらのナノクレイは医薬品担体としても活躍していることから、「クレイ単独」の薬剤としても注射・摂取できることを前提としており、そのための暫定的なナノクレイ投与方法を提案しました。

材料-分子

SARS-CoV-2とhACE2の選択と処方

SARS-CoV-2スパイクSおよびhACE2の分子は、タンパク質データバンクのWebサイトRCSBから取得されました[36、37、38]。 Materials Studioソフトウェア[39]で処方されたSARS-CoV-2スパイクSおよびhACE2の分子モデルをそれぞれ図3a、bに示します。シミュレーションの対象となる前に、これらの分子は、ソフトウェアの電荷平衡法QEqを使用して帯電しました。

a の分子レベルモデル SARS-CoV-2スパイク、 b hACE2、および c MaterialsStudioソフトウェアで配合されたNa-モンモリロナイト微結晶

ナノクレイ結晶子の選択と配合

粘土鉱物のスメクタイトグループの最も活発なメンバーの1つであるNa-モンモリロナイトが研究のために選ばれました。 Na-モンモリロナイトは、層状のフィロケイ酸塩粘土スメクタイトです（図2）。コロイド形態では、隣接する層間の空間には、外部の負に帯電した表面に静電的に引き付けられる遊離のナトリウム、カルシウム、またはマグネシウムの陽イオンが含まれる可能性があります[40]。乾燥粉末状態では、Na-モンモリロナイトは約0.5×0.5×0.001ミクロンの寸法の等寸法のフレーク/シートとして存在します（図2a）。それらの中間層表面のこれらの負電荷は、陽イオンによってバランスがとられています。コロイドとして、層間カチオンは粘土粒子から解離し、他の負に帯電した表面と結合します。これらの粒子はまた、それらの端に壊れた結合が存在するため、正に帯電したエッジを持っています。これらのナノクレイの形態とさらなる特性を表1に示し、MaterialsStudioソフトウェアでの結晶子の配合について以下に説明します。

ソフトウェアでは、Na-モンモリロナイト微結晶は、CEC、交換可能な陽イオン、層間電荷などの基本的な特性に基づいて配合されました（表1）。分子/結晶子サイズのサイズは、動的光散乱（DLS）技術を使用した粒子サイズ分析の結果に基づいて選択されました[10]。ソフトウェアで作成された粘土微結晶の最終形態を図3cに示します。固有の特性を使用してソフトウェアの設計モードでこれらの微結晶を調製した後、これらはソフトウェアの電荷平衡法QEqを使用して帯電しました。

メソッド-分子レベルのシミュレーション

研究のこの部分は、SARS-CoV-2スパイクSと粘土微結晶およびhACE2との相互作用のシミュレーションと評価で構成されていました。これらのモデルは実際のinvitro条件の完全な複製ではないかもしれませんが、これらはすべての重要な相互作用に組み込まれており、意図された相対的および比較研究に非常に適しています。

ソフトウェアでは、SARS-CoV-2 S、Na-モンモリロナイト微結晶、およびhACE2の定式化された構成の収着とシミュレーションが、モンテカルロ（MC）および分子力学（MM）技術を使用して実行されました。シミュレートされたすべての構成での親和性の向上は、計算された凝集エネルギー密度（CED）の観点から評価されました。CEDは、分子システムの凝集性の測定値と見なされます。シミュレーションには大規模な計算が含まれるため、これらの計算は、サウジアラビアのKFUPMにある高性能コンピューティング設備（HPC）を使用して実行されました。全体的な方法論、特定の方法の選択、およびシミュレーションパラメータは、著者の以前の調査[41,42,43,44,45,46,47]に基づいていますが、次のセクションで詳しく説明します。

SARS-CoV-2スパイク（S）とhACE2および粘土微結晶との相互作用

SARS-CoV-2 Sと粘土微結晶との相互作用をシミュレートするために、Na-モンモリロナイト粘土のさまざまな数の微結晶をSARS-CoV-2Sモデルに収着させました。これらの収着シミュレーションでは、ソフトウェアの収着モジュールでメトロポリスモンテカルロ法が選択されました。各収着ステップでは、粘土微結晶がスパイクSモデルの周囲のスペースを占め、複合体の全体的なエネルギーを低下させます。必要な数の微結晶が最大25,000ステップで収着され、MDの原理に基づいたソフトウェアのForciteモジュールを使用して、システムのエネルギーが最小限に抑えられました。 SARS-CoV-2スパイク分子とhACE2の相互作用モデリングについても、同様の収着プロセスを繰り返しました。この過程で、hACE2分子はSARS-CoV-2のスパイクSのRBDの周りに収着されました。収着プロセスの完了後、ソフトウェアのMDベースのモジュールを使用して製剤のエネルギーを最小限に抑えました。

NPT（一定数の粒子、圧力、および温度）アンサンブルを組み込んだソフトウェアのForciteモジュールは、修正されたユニバーサル力場を使用したMDシミュレーションに使用されました[41]。シミュレーションは、0.5 fsの間隔で5〜30 psの間、または一定のボリュームが得られるまで実行されました。シミュレーション中の温度を制御するために、減衰定数が0.1psのベレンゼンサーモスタットが使用されました。 MDシミュレーション中、想定温度は大気圧（100 kPa）で310 K（37°C）で一定に保たれました。システムの圧力を制御するために、減衰定数が0.1psのBerendsenバロスタットが使用されました。 Berendsenの方法論は、ソフトウェアで利用可能な他のサーモスタットとバロスタットを含むいくつかの試行の後、単結晶に最も適切であると見なされました。モンテカルロ法では、交換、適合、回転、平行移動、および再成長の比率のパラメーターは、それぞれ0.39、0.2、0.2、0.2、および0.2として選択され、対応する確率は0.39、0.2、0.2、0.2、および0.2でした。 0.2。回転と平行移動に適合した振幅は、それぞれ5°と1Åでした。

凝集エネルギー密度（CED）測定

この研究では、SARS-CoV-2-粘土微結晶およびSARS-CoV-2-hACE2複合体の親和性/結合レベルの評価をCEDの変化を通じて測定しました。粘土微結晶の収着とそれに続く各構成の分子動力学の実行後、ソフトウェアのForciteモジュールの凝集エネルギー密度オプションを使用してCEDを決定しました。著者は、合計、ファンデルワールスおよび静電CEDで構成されるCEDの概念が、さまざまな分子レベルのプロセスと相互作用を非常に厳密に説明し、シミュレートされた複合体間で作成される親和性/結合の程度をシミュレートできることを経験しました[41,42 、43、44、45、46、47]。定量的には、CEDは、1molの材料が液相から気相に移行するために必要なエネルギー量として定義されます。これは、分子の相互親和性/魅力の尺度でもあり、NPTアンサンブル全体で平均化された静電力とファンデルワールス力の両方として表されます。

Forciteモジュールでは、ファンデルワールスエネルギーは原子ベースのカットオフを使用して評価されました。この方法では、非結合相互作用はカットオフ距離まで単純に計算され、この距離を超える相互作用は無視されます。直接カットオフによって引き起こされる不連続性を回避するために、ほとんどのシミュレーションでは、スイッチング機能を使用して、ある範囲の距離で非結合相互作用をスムーズにオフにします。実効ポテンシャルは、実際のポテンシャルに平滑化関数を掛けることによって作成されます。中間範囲の関数の選択は重要であり、力を計算できるように、この領域で継続的に微分可能である必要があります。この研究では、スプライン幅が1Å、カットオフ距離が12.5Åの3次スプライン平滑化関数を使用しました。

結果と考察

SARS-CoV-2 S-hACE2複合体の最終的な構成を図4aに示し、SARS-CoV-2スパイクと異なる数の粘土Na-モンモリロナイト微結晶間の複合体をそれぞれ図4b、cに示します。比較のために、SARS-CoV-2スパイク上の粘土微結晶のさまざまな比率/数の合計CEDと、後者とhACE2との相互作用を図5にプロットします。

分子レベルのシミュレーション結果は、Materials StudioSoftwareにあります。 a SARS-CoV-2 SおよびhACE2（CED =1 J / cm ³ ）、 b Na-モンモリロナイトの12個の微結晶と相互作用するSARS-CoV-2Sモデル（CED =28 J / cm ³ ）、および c Na-モンモリロナイトの24個の結晶子と相互作用するSARS-CoV-2Sモデル（CED =154 J / cm ³ ）—ソフトウェアに実装された収着技術を使用して取得

SARS-CoV-2 S-hACE2および前者とNa-モンモリロナイト微結晶の数が異なる複合体の凝集エネルギー密度（CED）の変動

私たちの経験に基づいて、ナノクレイは接着性が高いため、SARS-CoV-2阻害剤としても機能する可能性があると仮定しました。彼らは、SARS-CoV-2に存在するスパイクSと強く関連することによってそれを行うことができます。相互作用の分子レベルのシミュレーションから得られた結果は、SARS-CoV-2とナノクレイの間のCEDが前者とhACE2と比較して非常に高いため（図5）、SARS-CoV-を阻害する可能性があることを示しています2hACE2に関与することから。さらに、図5から、ナノクレイによる抑制の程度は、量（投与量）に依存して増加すると結論付けることもできます。

SARS-CoV-2スパイクSとのナノクレイの相互作用

著者らは、以前の研究で、癌細胞とその微小環境の間の接着を促進し、したがって転移を制御する上でのナノクレイの役割を実証しました[10]。 Na-モンモリロナイトとパリゴルスキー石の75/25混合物の接着測定では、癌細胞と細胞外マトリックスタンパク質の間で接着が100％増加することが示されました（図6a）。 Raji細胞とフィブロネクチンタンパク質を結合するナノクレイの対応するSEMを図6bに示します。サンプルイメージングは​​、フロリダ州マイアミ大学のMiller School ofMedicineにあるFEIESEM-FEGXL-30でSEMモードで実行されました。著者らはまた、以前の研究で、静電、ファンデルワールス、およびZPアトラクションが接着プロセスで支配的であるように見えることを発見しました[10]。同じメカニズムが、ナノクレイの接着面のSARS-COV-2のスパイクへの結合も促進したと結論付けます（図7）。 ZPは、懸濁媒体に存在する他の成分との相互作用を含む、コロイド状の分散または凝集傾向の尺度です。原則として、30 mVを超えるゼータ電位（正または負のいずれか）は分散傾向を示しますが、5mV未満のゼータ電位は一般に凝集を引き起こします。研究で使用された粘土ナノ粒子のより高い分散傾向ZP（-24〜-32 mV）は、より高い分散傾向につながり、したがって、SARS-CoV-2スパイクとの相互作用を増幅するより高い表面積の生成につながります。それらのZPに基づいていますが、Na-モンモリロナイトナノ粒子は親水性を持っていますが、塩の存在下では、疎水性表面と親水性表面の間の二次接着メカニズムも促進します[10]。これらの粘土ナノ粒子は、親水性であり、反発する酸塩基（AB）相互作用が比較的高いため、分散傾向が高いことにも注意してください（表1）。次に、高分散は、魅力的な相互作用を増加させるための高表面積の生成をもたらす。ファンデルワールス力と反対に帯電した表面間の静電力により、表面積が大きくなると、より大きなアトラクションが促進されます。さらに、程度は比較的低いものの、Naモンモリロナイト粒子の正に帯電したエッジもスパイクSに電気的に引き付けられます。

a さまざまな比率のNa-モンモリロナイトおよびパリゴルスキー石粘土ナノ粒子で処理する前後の、AFMを使用したRaji-Raji-FNアセンブリ間の付着力測定の要約[10]。エラーバーは、試行のバリエーションを表します。 b ナノクレイによって生成されたRaji細胞とフィブロネクチンタンパク質の結合のSEM画像

モンモリロナイトナノクレイとSARS-CoV-2スパイクSとの相互作用の3つの可能なメカニズム：（1）正に帯電したナノ粒子エッジと負に帯電したウイルス表面を持つNa / Caイオン間の静電引力。 （2）ファンデルワールスのアトラクション。 （3）ZP静電相互作用

SARS-CoV-2スパイクSと粘土微結晶との相互作用の分子レベルのシミュレーションの結果（図5）も、上記の相互作用の挙動を確認しています。粘土ナノ粒子の収着により、密接に相互作用する強力なファンデルワールス引力場が形成されることが観察されています。これらのファンデルワールス引力フィールドは、粘土/ SARS-CoV-2構成のより高いCEDを作成します。粘土微結晶の添加後の総CEDの大幅な増加（図5）は、前者のhACE2との親和性と比較して、SARS-CoV-2とこれらの粒子との非常に高い親和性の証拠でもあります。

疑似抗体としてのナノ粘土

著者による現在および過去のすべての研究に基づいて、ナノクレイの高親和性の可能性を確立し、ナノクレイは抗体として模倣でき、したがって、ヒトhACE2に関与する前にコロナウイルスを引き付けて飲み込むことができると仮定します。抗体は、体からの感染の除去を助けるための適応免疫応答の一部として形質細胞によって合成される糖タンパク質です。抗体は、食作用を促進する病原体のオプソニン化、補体系の活性化、微生物の凝集、ウイルスや毒素の中和など、さまざまな方法で感染の除去を助けます。抗体は、ウイルス表面タンパク質に結合すると、細胞上の標的受容体へのウイルスの付着を防ぐことにより、細胞へのウイルスの侵入を防ぎます。抗体の結合は、表面タンパク質のさまざまな部位で発生する可能性があり、同じ効果を引き起こすさまざまなメカニズムにつながります。 SARS-CoV-2の場合、抗体による2つのウイルス中和メカニズムが観察され[1,48]、図1c、dに示されています。メカニズムの1つは、SARS-CoV-2-RBDの付着部位への抗体の直接結合を含み、その結果、抗体は標的受容体hACE2と競合します。別のメカニズムには、標的受容体と競合することなく、RBD上の他の部位への抗体の結合が含まれます。後者は、研究で発見された最も強力なモノクローナル抗体（mAb）による中和に関与していることが示されています[1,48]。抗体がSARS-CoV-2RBDと相互作用し、後者がhACE2と結合するのを阻害するのと同様に、同様の分子レベルのモデルがナノクレイ用に調製され、コロナウイルスの同様の阻害をもたらします。それらの非常に高い親和性のナノクレイは、SARS-CoV-2のスパイクに引き付けられ、したがって、これらのスパイクのRBDとhACE2の関与を制限します。

ナノクレイ粒子とSARS-CoV-2スパイクSとの相互作用メカニズムは、後者とhACE2との相互作用を阻害します

提案されたナノクレイ管理方法

薬物担体としての粘土の使用は複数回テストされており、人体の細胞に対する細胞毒性がほとんどまたはまったくないという有望な結果が得られています。カオリナイト粘土鉱物は、潜在的なドラッグデリバリーシステムでの使用についてテストされ、高い生体適合性と非常に低い細胞毒性を持っていることが示されました[11]。ポリ（d、l-ラクチド-co-グリコリド）/モンモリロナイトナノ粒子のinvitroでの細胞毒性も無視できることが実証されました[14]。パリゴルスキー石-ポリエチレンイミン-フルオレセインイソチオシアネートナノコンポジットも、invitroでほとんど細胞毒性を示さなかった[13]。著者らはまた、invivo研究中に黒色腫の治療のためにナノクレイを皮下注射した経験もあります[34]。抗がん剤担体としての粘土の使用および他の徐放性医薬品[25,26,27,28]に基づいて、invivoでの検証の対象となる「粘土のみ」の医薬品としてナノ粘土を注入できることを提案します。および臨床試験。

ナノクレイは非生分解性ですが、研究[49]で実施された体内での代謝性能を備えた同様の無機ナノ粒子の設計を包括的に理解することで、これらのナノクレイを人体の透明な無機剤として分類することもできます。 / P>

結論と推奨事項

著者による現在および過去のすべての研究に基づいて、ナノクレイの高親和性の可能性を確立すると、これらは抗体として模倣され、ヒトhACE2に関与する前にコロナウイルスを引き付けて飲み込むことができます。

SARS-CoV-2スパイクSと粘土微結晶との相互作用に関する分子レベルのシミュレーションの結果は、密接に相互作用する強力なファンデルワールス引力場の形成をもたらします。これらのファンデルワールス引力フィールドは、粘土/ SARS-CoV-2構成のより高いCEDを作成します。粘土微結晶の添加後の総CEDの大幅な増加は、前者のhACE2との親和性と比較して、SARS-CoV-2とこれらの粒子との非常に高い親和性の証拠でもあります。

SARS-CoV-2とさまざまな割合のナノクレイの間でinvitro相互作用研究を実施することにより、研究を継続することを提案します。 invitro段階で開発されたナノクレイの最適用量に基づいて、動物のinvivo研究を実施することをお勧めします。動物実験は、ナノクレイの投与量を確定するために、ナノクレイの有無にかかわらず実施する必要があり、臨床試験の基礎を築く必要があります。

データと資料の可用性

この調査中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された記事に含まれています。