ナノサイズのフェニレンジアミンフィルムを使用したアンペロメトリートランスデューサーの選択性の改善

背景

バイオセンサーは新しい分析装置です。その使用法は、クロマトグラフィー、分光法、および比色分析の代替手段です。バイオセンサーは、これらの従来の方法よりもはるかに安価で使いやすいですが、分析特性の点で劣っていることがよくあります。現在、バイオセンサーの分野での研究が活発に進んでいます[1]。

基礎化学および応用化学の国際研究者協会の古典的な定義によれば、バイオセンサーは受容体とトランスデューサーに基づく統合デバイスであり、生物学的認識要素を使用して定量的または半定量的分析を提供できます[2]。トランスデューサーのタイプによって、バイオセンサーはいくつかのグループ（電気化学、光学、圧電など）に分類され、その中で電気化学バイオセンサーは最大のグループの1つであり、次にアンペロメトリー、電位差測定、導電率測定、およびインピーダンス測定に分類されます[3]。 。

バイオセンサーの重要な分析特性の1つは、それらの選択性、つまり、ターゲット化合物のみを識別する能力です。バイオセンサーの選択性は、生物学的材料の選択性とトランスデューサーの選択性によって決定されます。基本的に、生体材料として電気化学バイオセンサーで使用される酵素と抗体は非常に選択的ですが、トランスデューサーとして機能する電極はかなり非選択的です。バイオセンサーの選択性は、実際の体液やその他の複雑なサンプルを扱う場合に特に重要です。したがって、その調査はバイオセンサーの開発に必要な段階です。

血清、尿、脳脊髄液などには、トランスデューサーの表面で化学反応を起こす可能性のある干渉物質が存在するため、標的物質のバイオセンサー測定で誤った結果を引き起こします。生物学的サンプルの主な干渉物質は、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、尿酸、ドーパミン、グルタチオンなどです。ヒトの血清中のそれらの濃度を表1に示します。

電極表面での干渉物質の酸化を防ぐための2つの主なアプローチがあります。生体選択膜への追加物質の導入による作業電位の低下、または電極表面への標的物質の選択的アクセスを可能にする追加の半透膜の堆積です。 4]。半透膜の沈着は方法論的に単純であり、バイオセンサーの機能にわずかに影響します。

バイオセンサーでは、過酸化水素が電極上で酸化または還元するため、バイオセンサー信号が生成されます。したがって、実際の問題は、過酸化水素を透過し、他の物質の浸透を防ぐナノポーラスフィルムの開発です。これらの膜の中で、フェニレンジアミン（PD）をベースにした高分子フィルムが注目されています[5]。ポリフェニレンジアミン（PPD）ベースの膜にはナノポアがあります。それらのサイズは、過酸化水素を含む低分子量化合物を膜を通して電極表面に浸透させるのに十分です。一方、膜は、アスコルビン酸やドーパミンなどのより大きな物質の通過または酸化を許可しません。したがって、膜は過酸化水素への選択性を改善し、それが次にバイオセンサーの精度を高める。いくつかの研究では、PD異性体とPD重合の方法が研究されました。特に、PPD膜は、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、およびグルタミン酸オキシダーゼに基づくバイオセンサーを作成する際に、定電位（+ 0.7 V）での電着によってルテニウム被覆炭素繊維微小電極上に形成されました[6]。 3つのPD異性体がテストされました。メタ異性体の結果が最高でした。アスコルビン酸に対する感受性がまだ残っているため、アスコルビン酸オキシダーゼを添加して完全に除去しました。 [7]で、著者らは、CVまたは定電位アンペロメトリーによってPt–Irシリンダー上に堆積されたPPD膜を研究しました。アスコルビン酸に対する感受性は、一定の電位で酸化されたメタ異性体およびオルト異性体に基づく膜で顕著に低下しましたが、過酸化水素に対する感受性は10％しか低下しませんでした。パラジウムディスク電極上に堆積されたPPD膜で得られた結果は、まったく異なっていました[8]。 m の電着 -CVによるPDは、 m と比較して3倍高い過酸化水素透過性を持つフィルムの形成を引き起こしました -定電位でのPD酸化。したがって、 m -PDはすべての異性体の中で好ましいことが示されました。最近報告されたCV蒸着 o を使用した過酸化水素センサー -Auナノ粒子を含むPDフィルム[9]は、干渉効果の良好な回避を示しました。一般的に、 m -PDは、すべての電極で他の電極よりも優れていますが、PD重合の手順は、それぞれの特定の場合に最適化する必要があります。さらに、PDベースのメンブレンは生物学的要素のないセンサーにも使用できます。最近示されたように、ウシ血清アルブミンは、PDと他の芳香族化合物の共役共重合体に基づくセンサーによって検出できました（共重合体との結合後のタンパク質蛍光の消光が観察されました）[10]。

したがって、本研究の目的は、 m のさまざまな方法を比較することでした。 -フェニレンジアミンの堆積と、プラチナディスク電極上でのPPD形成の最適な手順を選択します。

メソッド

資料

アスコルビン酸、システイン、尿酸、ドーパミン、過酸化水素、 m -フェニレンジアミンおよびHEPESは、Sigma-Aldrich Chemie（USA）から購入しました。他のすべての化学物質はp.a.グレード。

ヒト血清のサンプルは、キエフ市立腎臓・血液透析センター（ウクライナ）から入手しました。

アンペロメトリートランスデューサーの設計

この作業では、自作のプラチナディスク電極がアンペロメトリートランスデューサーとして機能しました。直径0.4mm、長さ3 mmの白金線を、外径3.5mmのガラスキャピラリーの一端でシールしました。ワイヤーの開放端はトランスデューサーの作業面でした。プラチナワイヤーの内側の端は、キャピラリー内の銀ワイヤーの一端にウッドの合金ではんだ付けされました。もう一方の端はポテンシオスタットに接続されていました。電極は繰り返し使用されました。使用前に、作業面をHClで30秒間処理し、エタノールで洗浄し、研磨紙P1500 PS8Aで研磨しました。

測定方法

サンプルのUV-vis吸収スペクトルは、積分球を使用して、拡散反射モードで200〜900nmの波長範囲のThermoEvolution600分光計で測定されました。 m のブランクサンプルとして、Spectralon拡散反射標準とプラチナディスクを使用しました。 -Pt電極の表面にそれぞれフェニレンジアミン粉末とPPD層。

電気化学的測定のために、作用電極は、PalmSensポテンシオスタット（Palm Instruments BV、オランダ）に接続された補助（白金線）および参照（飽和KCl中のAg / AgCl）電極を備えた古典的な電気化学セルに配置されました。ポテンシオスタットに接続された（同じプロデューサーからの）8チャネルマルチプレクサーの使用により、8つの電極からの信号の同時モニタリングが可能になりました。ただし、私たちの作業では、作業セルのサイズが小さいため、通常は3つの電極を使用しました。

クロノアンペロメトリー測定（「アンペロメトリー検出」技術）は、マグネチックスターラーで恒久的に攪拌し、Ag / AgCl参照電極に対して0.6Vの定電位で、開いた3mLガラスセル内で室温で実行されました。すべての実験で、10ミリモルのHEPES、pH7.4を作業バッファーとして使用しました。作業セル内の基質濃度は、ストック溶液のアリコート（50 mM過酸化水素、20 mMアスコルビン酸、3 mMシステイン、4.5 mM尿酸、2.1 mMドーパミン）を添加することによって得られました。実験の直前に新しい溶液を準備しました。尿酸を除くすべての電気活性物質は、作業バッファーに溶解しました。溶解度が小さいため、尿酸は5 mM NaBrO ₃ を含む蒸留水に溶解しました。 。フェニレンジアミンを40mMリン酸緩衝液、pH7.4に溶解しました。

サイクリックボルタンメトリーは、攪拌せずに同じ測定セルで実行されました。開始電位は0V、最終電位は+0.9 V、スキャンレート（電位変化率）は20 mV / s、電位変化のステップは5mVでした。

すべての実験は3回の繰り返しで実施されました。表と図のデータは、OriginLab OriginPro8.5プログラムによって計算された実験の平均値±標準偏差を表しています。

結果と考察

過酸化水素に対する選択性を改善するためにアンペロメトリートランスデューサーに追加の膜が堆積する理由を確認するには、干渉物質の可能性に関してこのトランスデューサーの感度と選択性を検証する必要がありました。

バイオセンサーは、希釈されていないサンプルと希釈されたサンプルの両方の測定に使用できます。希釈のオプションは、分析する物質の濃度とバイオセンサーの感度によって異なります。バイオセンサーが、サンプルの実際の濃度の数十分の1の濃度でターゲット物質を識別できる場合は、後者を希釈して希釈する必要があります。干渉物質の含有量により、アレイの精度が向上します。さらに、測定に必要な基質量を数十分の1に減らすことができます。

分析対象物質の濃度が低すぎる場合や、技術的な理由から希釈が望ましくない場合があります。アンペロメトリートランスデューサーの機能をよりよく理解するために、3つの濃度の電気活性物質を使用しました：（1）血清に関連する、（2）（1）より20倍低い、すなわち20倍希釈、および（3）100-倍希釈。 3つの濃度の電気活性物質に対するバイオセンサーの応答は、PPDフィルムの堆積前に裸のトランスデューサーを使用して受信され、トランスデューサーの感度が計算されました（表2）。見られるように、ドーパミンとアスコルビン酸に対する感受性は最も高く、システインに対する感受性は最も低かった。ただし、アスコルビン酸と尿酸は、生物学的サンプル中の濃度が本質的に高いため、主な干渉物質と見なすことができます。これらの物質に対するトランスデューサーの応答は、ターゲット物質である過酸化水素に対する応答よりも1桁大きくなります。したがって、干渉物質の影響が顕著であるため、裸のトランスデューサは生体サンプルの測定には適していません。一方、100倍希釈後は、システインとドーパミンに対する反応はごくわずかになり、すべての干渉物質に対する反応は、過酸化水素に対する反応の約20％にすぎませんでした。つまり、場合によっては、センサーが追加の変更なしでも使用されます。

現在、トランスデューサーへのPPD膜沈着の方法に関する情報は断片化されています。したがって、作業の次の段階で、最も一般的で有望な2つの方法のどちらがより実現可能であるかが評価されました。

最初の方法では、PPD膜は、電位を変化させてモノマーフェニレンジアミンの分子を電解重合することにより、白金ディスク電極の表面に堆積されました（サイクリックボルタンメトリー）。参照電極と補助電極を備えたトランスデューサーをフェニレンジアミン溶液の入った作業セルに配置し、多数のサイクリックボルタモグラムを取得しました[7]。実験の例を図1に示します。最初のサイクリックボルタモグラム（CVA）中に、フェニレンジアミンの酸化により、0.5〜0.9Vの範囲の電位で電流の大幅な増加が観察されました。 2回目以降のCVAの間、電流は大幅に減少し、電解重合の速度が遅いことを示しています。ただし、次の実験で示されているように、PPD膜の形成はすべてのCVにわたって持続しました。

トランスデューサー表面でのフェニレンジアミン電解重合で得られたサイクリックボルタモグラム

PPD膜沈着の2番目の方法は、一定時間（40分）にわたって+ 0.7Vの定電位でフェニレンジアミンを酸化することです[11]。両方の堆積方法を使用した場合のトランスデューサーの応答の比較を表3に示します。以降、PPD膜を使用しない電気活性物質に対する応答を100％と見なしました。両方の方法で堆積された膜は、干渉物質を非常に効果的に妨害しました。システインに対する弱い感度しか観察されませんでした。一方、ボルタンメトリー後の過酸化水素に対するトランスデューサーの感度は2.6倍に増加しました。これは、ボルタンメトリー中の白金の電気活性化によって説明できますが、PPD膜の効果によっては説明できません。フェニレンジアミンを含まないリン酸緩衝液でサイクリックボルタモグラムを取得した後も、過酸化水素に対するこのような感度の増加が観察されました。一定の電位で膜を堆積させた後、電気的活性化は明らかにならず、過酸化水素に対する応答は変化しなかった。したがって、サイクリックボルタンメトリーの使用は、1回の沈着にかかる時間が短い（20分対40分）、システインのより効率的な妨害、および過酸化水素への応答の増加という3つの理由で好ましいことが明らかになりました。

ただし、サイクリックボルタンメトリーには1つの欠点があります。ボルタンモグラムは、1つの電極でのみ同時に取得できます（マルチプレクサを使用する場合でも）。一方、定電位での膜堆積により、8〜16の作用電極を同時に接続できます（マルチプレクサのタイプによって異なります）。したがって、トランスデューサーの前処理時間を短縮するために、サイクリックボルタモグラムの条件の最適化にさらに取り組む必要があります。

CVおよび定電位アンペロメトリーによるPD電解重合は、非常に複雑なメカニズムを介してさまざまな経路で発生すると考えられています[12]。したがって、CVは高い印加電位を伴い、PDの共役の少ないオリゴマーの生成につながります。このため、CVによるPD重合では、定電位での重合に比べて細孔が大きく、PPD層の透磁率が高いと考えられます[8、13]。しかし、「背景」のセクションで述べたように、異なる著者はPD沈着の優先的な方法について矛盾した結論に達し、多くの場合、CVは良い結果をもたらしました。私たちの意見では、CVと定電位アンペロメトリーの両方が優れた選択透過性を備えたPPD膜の生成を提供でき、特定のケースごとに最適化が必要です。

PPD膜は、電極表面に均一な透明な金茶色のフィルムとしてはっきりと見えました。それが確かにPPDであることを確認するために、PD重合を分光法によってさらに確認した。フィルムのUV-vis拡散反射スペクトル（図2）は、222および315 nmで強い吸収帯を示しています。これは、モノマーの帯に類似しており、芳香環の電子遷移に関連しています[14]。 400〜800 nmでは、波長とともに絶えず減少し、πに関連します。 − π *導電性PPDポリマーの高度に共役した芳香族系における電子遷移。

m のUV-vis拡散反射スペクトル -Pt電極上に形成されたフェニレンジアミンとPPD膜

得られた結果をよりよく解釈するために、さまざまな方法で生成されたPPD膜の細孔のサイズを推定することが有用です。ただし、膜はPDの複数の層で構成されており、下層の細孔は異なるサイズになる可能性があるため、PPD膜の細孔サイズを直接決定することはほとんど不可能です。 KilloranとO’Neillは、有効な膜の厚さを m から決定しました。 -PDは15nmであり、1つのオリゴマーポリマーストランドの断面積はdel Valle etalによって推定されました。 1 nmでした[7、15]。したがって、PPDメンブレンには約15層のポリマーが含まれています。 PPDメンブレンには疎水性と絶縁性があるため、メンブレンには、電極表面まで伸びて過酸化水素分子のバイパスを可能にする穿孔ナノポアが必要です。それ以外の場合は、H ₂ O ₂ 酸化してアンペロメトリー信号を生成することはできません。細孔は完全に均一ではなく、電気活性分子を排除するために細孔の最小直径は1 nm未満である必要があります。したがって、電子顕微鏡や原子間力顕微鏡を使用しても細孔を分析することは非常に困難です。これらの技術的な理由から、さまざまな分子の膜透過性を評価することにより、PPD膜の有効性を推定する方がはるかに簡単です。このような間接的なアプローチは広く普及しており、さまざまな膜の実際の特性を比較することができます。

さまざまな数のサイクリックボルタモグラムを使用して堆積されたPPD膜の有効性がテストされました（図3）。

異なる数のCVAを使用して堆積されたPPD膜の効率

1つのCVAによって堆積されたPPD膜は、干渉物質の影響を排除するには明らかに不十分でした。ただし、ここでは、白金の電気活性化の効果が最も強かった。ボルタモグラム数をさらに増やすと、干渉物質に対する応答が低下しましたが、同時に、おそらく物質の拡散を妨げるPPD層が厚すぎるために、過酸化水素に対するトランスデューサの感度も低下しました。ドーパミンと尿酸への反応が完全に消失し、アスコルビン酸とシステインへの反応が大幅に減少するには、3つのCVAで十分でした。そのため、最適化のために3つのCVAを採用し、フェニレンジアミン濃度を上げて干渉の影響を完全に排除しました（図4）。

さまざまなフェニレンジアミン濃度で堆積したPPD膜の効率

特に、5 mMフェニレンジアミンの使用は、サンプル希釈後に残っている低濃度の干渉物質に対する応答を排除するのに十分でしたが、希釈されていないサンプルでの作業には不十分でした。フェニレンジアミン濃度を20mMに上げて3つのCVAを使用すると、システインの影響を完全に排除し、アスコルビン酸に対する反応を最低レベル（PPD膜なしのアスコルビン酸に対する反応の0.1％）に下げるのに十分であることがわかりました。より高い（最大100 mM）フェニレンジアミン濃度を使用すると、おそらくPPD層が厚すぎるために、過酸化水素に対するトランスデューサの感度が2分の1に低下しました。したがって、30 mMフェニレンジアミンで3つのCVAを使用してPPD膜を堆積することが、最適な手順です。 1つのボルタモグラムが約2分続いたため、1つのセンサーへの膜の沈着には6分かかりました。

次に、PPD膜の安定性を調べた。 PPD膜の堆積後、センサーを作業バッファーに2時間置き、過酸化水素、アスコルビン酸、およびシステインに対する応答を測定して、膜​​の選択透過性の変化を評価しました（図5）。過酸化水素に対する反応は作業中にわずかに増加したが、干渉物質に対する小さな反応はさらに小さくなったことがわかった。おそらく、アスコルビン酸とシステインがPPD層のいくつかの大きな細孔を徐々に詰まらせたために起こりました。この実験は、PPD膜が、過酸化水素に対する選択性を少なくとも2時間は大幅に損なうことなく使用できることを示しました。

2時間のPPD膜の安定性。 3つの物質に対する反応は、PPD沈着後の対応する物質に対する初期反応に正規化されました

PPD膜の貯蔵安定性を調べた。 PPDメンブレンが堆積したセンサーは、-18°Cで8日間乾燥状態で保管されました。定期的にセンサーを凍結解除し、過酸化水素、アスコルビン酸、システインに対する反応を測定しました（図6）。この期間中に、過酸化水素に対するセンサーの感度は2.5倍に増加しました。アスコルビン酸とシステインに対する感受性は変化しませんでした。この効果は、PPD膜のゆっくりとした膨潤によって説明でき、PPD層を通過する過酸化水素の拡散が改善されました。

PPDメンブレンの保存安定性。応答は、H ₂ への応答に対して正規化されました。 O ₂ 初日

最後に、PPD膜の有効性は、実際の生物学的サンプルの分析で検証されました。膜のないトランスデューサーは、電気活性化合物の存在により、作動細胞に血清を添加した後、弱い信号を示しました。しかしながら、膜の堆積後、応答は得られなかった。ニューロンの溶解物でも同様の結果が得られました。これらの実験は、プラチナディスク電極へのPPD堆積の開発された方法が効果的であり、変更されたトランスデューサーが複雑な生物学的サンプルでの作業に使用できることを示しています。

この研究で開発されたPPD沈着の方法を、以前に報告された方法と比較すると便利です（表4）。

ご覧のように、提示された方法は最も速い方法であり、得られた膜のブロッキング特性は、他のPPD膜の特性よりも優れているか、少なくとも悪くはありません。

結論

バイオセンサーの動作に対する干渉物質の影響を減らすことを目的とした半透性ポリフェニレンジアミンベースの膜の堆積条件を調査しました。サイクリックボルタンメトリーによるフェニレンジアミン電解重合は、定電位での電解重合と比較した場合、より簡単であり、膜のより良い特性を提供することが示された。サイクリックボルタモグラムの数とフェニレンジアミン濃度に対するPPD膜の有効性の依存性を調査しました。 30 mMフェニレンジアミンで3つのサイクリックボルタモグラムを使用することにより、センサーの動作に対する干渉物質の影響を完全に排除できることが示されました。一方、希釈されたサンプル、つまり電気活性物質の濃度が低い場合は、フェニレンジアミン濃度を5 mMに下げるのが妥当です。これにより、PPD層が薄くなるため、過酸化水素に対するトランスデューサの感度が高くなります。 PPDメンブレンは、少なくとも2時間の連続操作中に過酸化水素への選択性を大幅に損なうことなく使用でき、少なくとも8日間保管できます。 PPDメンブレンを備えたトランスデューサーは、生体サンプルに存在する電気活性物質に敏感ではなく、バイオセンサーの作成に使用できることが示されました。