AFMナノメカニカルマッピングによる大腸菌ゲノタイプ特異的マクロ分子の解明

概要

微生物株の分類は従来、分子生物学的手法に基づいており、細菌株の形態的特徴が研究されることは稀である。本研究では、AFMメカニカルマッピングにより細菌表面のマクロ分子構造を明らかにした。その分解能はナノスケールのチップサイズだけでなく、試料のメカニカル特性によっても決定される。この技術により、シンプルな試料調製と柔軟な作業環境で、微生物株の膜構造をナノスケールで研究でき、電子顕微鏡やラベル必須の生化学的分析法の複数の制約を克服した。細胞表面に存在する特徴的なマクロ分子は表層タンパク質と考えられ、大腸菌のゲノタイプに特異的であることが判明した。それらの平均分子サイズは直径38〜66nm、形状は腎臓型または球形であった。結論として、表面マクロ分子構造は大腸菌ゲノタイプにリンクする独自の特徴を持ち、ゲノム効果が細胞形態に及ぼす影響をAFMメカニカルマッピングで迅速に特定できることが示唆される。

背景

光学顕微鏡の劣った分解能と電子顕微鏡の制限された作業環境のため、微生物分野の研究者は細菌細胞の外観を用いることは稀で、代わりにゲノム断片の同定、タンパク質発現などの分子的・化学的分析手法を採用してきた。それらの手法には労力と時間がかかるという欠点があり、より直接的で効率的、柔軟なアプローチが必要とされている。1982年にビニッヒらによって発明された原子間力顕微鏡（AFM）は、レーザービームで監視されるナノスケールプローブを用いて、試料表面をナノスコピック甚至は原子分解能で観察するように設計されている。物理プローブチップで形態をイメージングするこの技術は、光学顕微鏡と電子顕微鏡の両方の分解能限界と環境制約を克服し、シンプルな試料調製、常温常圧や流体環境での柔軟な作業環境などの利点を持つ。しかし、微生物研究におけるAFMの現在の応用は、主に細菌細胞の静的・動的形態や鞭毛・菌毛の発現を定性的にイメージングすることにとどまり、微生物細胞の表面超微細構造や細胞特性の定量的分析に焦点を当てた研究は少ない。

本研究では、大腸菌（E. coli）細胞の表面研究にAFMを選択し、AFMトポグラフィーと位相画像で個々の細菌の形状と寸法を観察した。さらに、同時メカニカルマッピングにより、チップと試料の各物理的接触時にマクロ分子と周囲マトリックス間の接着特性の微小な差を検出することで、表面成分に関する追加の生体力学的情報が明らかになった。このような高度な技術を微生物分野に適用し、実験室株1株とヒト病原性株2株の3つの大腸菌ゲノタイプを調べ、表面マクロ分子を同定した。結果、この技術はAFMチップのスケールを超える画像分解能を、試料のメカニカル分布を感知することで提供できることが分かった。結論として、この表面科学の発展は微生物分野の研究者に細胞外観の詳細を提供するだけでなく、他の生体・ナノ材料システムの表面特性に関する知識にも貢献すると考えられる。

方法

微生物試料

本研究で試験した3つの大腸菌株は、国立成功大学分子医学研究所の鄧慶豪教授の研究室から提供された臨床分離株である。MG1655は大腸菌K-12の腸内野生型実験室株であり、他の2株はヒト病原体である：CFT073は尿路感染症の主原因、RS218は乳児の新生児髄膜炎に関連する。

機能化基板

固体表面と微生物細胞の共有結合のために、2段階の表面修飾を施した。まず、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES、シグマアルドリッチ）溶液で初期NH₂機能化層を形成し、APTES由来のSiと酸化表面由来のOによる安定したSi-O結合で安定なAPTESコーティングを得た。2つのCOOH基を持つグルタルアルデヒドは、一方のCOOHでAPTESのNH₂基と結合し、もう一方のCOOHで細菌表面のNH₂基と働く。

洗浄済み基板を5% APTESエタノール溶液に1時間浸漬し、エタノールと脱イオン水で洗浄。窒素ストリームで乾燥後、2%グルタルアルデヒドPBS溶液に一晩浸漬し、PBSで洗浄した。

試料調製

LB寒天平板から単一コロニーを選び、LB培地で培養。12時間後、細菌溶液を新鮮なプレエクイリブレート済みLB培地で1:100に希釈。さらに12時間培養後、1500×g（4000rpm）で3分遠心し、LB培地で再懸濁、この工程を2回繰り返した。200μLの細菌溶液を機能化基板に滴下し30分静置。試料を蒸留水で2回浸して非接着細胞を除去し、直ちに常温常圧下でAFM観察した。

AFM特性評価

AFM装置（ブルカーNano、カリフォルニア州サンタバーバラ）と、バネ定数0.7N/m、チップ半径10nmの窒化シリコンプローブを用いて微生物試料の表面を観察した。AFMスキャンレートとラインピクセルは、最初のトポグラフィー検出で10μmスキャンサイズで0.5Hz、256ライン、詳細観察で2μmスキャンサイズで0.3Hz、512ラインとした。PeakForce定量的ナノメカニカル（QNM）モードを用いてナノメカニカルマッピングを行い、引き離し力-距離曲線の最大引力から表面の接着特性を算出した。

以前のストレプトコッカス・ムタンス研究では、連続AFMメカニカルマッピングで2時間の細菌表面メカニカル進化を監視し、微生物試料がその間生存していたことを確認している。本研究で用いた大腸菌試料の生存性を確保するため、事前研究を行い、試料調製後4時間まで表面接着の連続的変化が観察され、少なくとも4時間生存していることが示された（追加ファイル1参照）。したがって、本研究の大腸菌ゲノタイプはすべて個別に、異なる時期に培養し、試料調製直後にAFM測定を行った。つまり、細菌試料は検査のために待機させず、保持時間の影響を最小限に抑えた。各大腸菌株の定量データは、本研究で2時間以内に実施した測定から収集した。

統計解析

統計解析にはPrism（GraphPad Software、米国）を使用した。細胞長とマクロ分子サイズは平均値±標準誤差（SEM）で表示。大腸菌ゲノタイプ間の多重比較には一元配置分散分析（ANOVA）を用いた。信頼水準95%（p<0.05）を選択し、アスタリスクで有意差の程度を示した。各株のサンプル数n>40。

結果と考察

複数マッピングによる表面超微細構造

10μm観察スケールでAFMスキャンすると、複数の単一大腸菌MG1655細胞が観察され、トポグラフィー画像から立体的な細胞形状が観察できる（図1a）。偏向誤差画像（図1b）で二次元的な明確な細胞輪郭が得られ、細菌細胞の傍らに複数のチューブル構造が見られる。波状フィラメント（図1c）は別の研究で報告された微生物鞭毛の外観と一致し、鞭毛であることを確認。より短い毛状の菌毛も観察される。観察領域を単一微生物細胞の詳細研究のために縮小すると、トポグラフィーは細胞表面で垂直方向にわずかな差を示す（図1d）、偏向誤差画像はより多くの形態情報を提供するが、収集された環境ノイズが多すぎて細胞表面の超微細構造を調査できない（図1e）。チップと試料の接触時に試料の同時生体力学的特性を測定すると、細菌表面が実際には特定の形状とサイズを持つ大量のマクロ分子で構成されていることが、接着力マッピング（図1f）で明らかになった。これにより、トポグラフィーと偏向誤差画像の形態分解能が生体力学的情報でさらに向上した。

図2aでは、大腸菌MG1655による鞭毛発現が明確に見られ、フィラメントサイズは図1bと類似し、基板より相対的に低い接着特性を示す。また、細菌表面が周囲マトリックスより接着性の低い円形成分で構成されていることが判明。この観察はマウス皮膚組織層に関する以前の知見と類似し、反復する比較可能な粒子はマクロ分子と考えられ、その構造は分子間領域より密で一貫性があるため、接着性能の差が容易に感知される。グラム陰性菌の細胞外皮の最外層は自己集合タンパク質の層であり（図2b）、表層（S-layer）タンパク質として知られる。S-layer構造は伝統的に電子顕微鏡で測定されてきたが、真空環境と導電性コーティングの要件により、タンパク質のネイティブでリアルタイムな情報が失われる。一部の研究ではS-layerタンパク質を抽出してマイカ基板に再組み立ててAFMスキャンを行ったが、結果はS-layer構造のインシチュおよびリアルタイム性能に欠けていた。細胞構造と電子顕微鏡による微生物表面の先行画像に基づき、観察されたマクロ分子をS-layerタンパク質と考えた。

AFMと透過型電子顕微鏡（TEM）測定を比較すると、前者はシンプルな試料調製、緩い実験要件、より生物学的に優しいイメージング応用など、後者に対するいくつかの利点を持つ。生物学分野でのTEM選択は一般的に、細胞内小器官が見え、超高分解能（典型的にナノメートルまたはサブナノメートル）イメージングが得られるためである。本研究のAFM接着マッピングは特徴分解能を向上させ、表面マクロ分子の配列をチップサイズに依存せず、試料自体の固有構造に基づいて提示した。さらに、このアプローチは数十μm²領域にわたる微生物表面のナノスケール分解能を可能にする。

ゲノム操作による形態的特性の差異

大腸菌MG1655細胞の表面超微細構造を観察した後、他の株ではマクロ分子がどのように配列されているかが問題となる。ヒト病原体である大腸菌CFT073とRS218を同じ実験パラメータでAFM観察し、10μmの特徴サイズではこれら3ゲノタイプ間で細胞形状と寸法に有意差はなかった（図3a-c）。接着力マッピングでS-layerタンパク質を同定し、異なる大腸菌株間で形状とサイズが異なる構造が検出された（図3d-f）。比較容易のため、大腸菌株の詳細接着マッピング画像を図3g-iに示す。表面マクロ分子はMG1655とRS218で球形であったが、分子直径が異なり、MG1655で38±1.1nm（n=80）、RS218で58±2.7nm（n=46）であった。一方、CFT073細胞は独特のS-layerタンパク質形状を持ち、両端間の長さ差が66±3.2nm（n=44）の腎臓型であった。これら3ゲノタイプのS-layerタンパク質サイズを多重比較分析した結果、これらの株間に有意差が示された（図4）。

微生物S-layerは、過酷な環境からの細胞保護、食作用攻撃からの防御、捕食性細菌からの保護など、多くの重要な役割を果たすと報告されている。また、S-layerは効果的な定着を可能にするアドヘシンとしても機能する。S-layer構造はTEMでよく研究され、中心間距離4-35nmの範囲で様々な格子タイプに分類されてきた。我々のAFM結果と文献のTEM報告の差異は、異なるイメージング手法によるものと考えられる：TEMはS-layer構造の2D形態を与えるが、AFMは細胞の曲率と粗さ、AFMプローブの幾何学などの複数の影響を含む3Dトポグラフィーを捉える。

異なるタイプのS-layer構造は、もともとそれらの様々な分類学的特徴を用いて細菌種を区別できると考えられていたが、単一種でも微生物株が異なるタンパク質格子を持つことが判明した。一部の研究がS-layerのフィラメント形成における役割、細胞膜上のタンパク質タイプ、大腸菌ゲノタイプ間のゲノム多様性におけるサイズを調査したが、S-layerタンパク質の差異はほとんど注目されてこなかった。本研究の結果は、大腸菌MG1655、CFT073、RS218間の形態的特性の差異を明らかにし、表面マクロ分子の外観が個々の大腸菌ゲノタイプに特異的である可能性を示唆する。

結論

本研究では、AFMメカニカルマッピングによりゲノム特異的な細菌表面ナノ構造情報が検出され、マクロ分子と周囲マトリックス間の接着差が区別された。微生物細胞の表面マクロ分子は、グラム陰性微生物の分子構造に基づき表層（S-layer）タンパク質と考えられた。それらのマクロ分子の配列とサイズは、試験した大腸菌ゲノタイプに特異的で、明確な形状とサイズを持ち、これらの差異が統計解析で有意であることが示された。結論として、細菌S-layer構造はゲノム依存的であり、微生物関連疾患や微生物株の迅速診断の潜在的手法となり得る。S-layer特性の実用化には、より多くの細菌ゲノタイプの検証によるカタログの充実が必要である。現在、細菌形態的特性と生理/病理学的性能を結びつけるデータベースを構築中であり、AFM検査の実用化に向けた有望な進展になると考えている。

略語

AFM:

原子間力顕微鏡

ANOVA:

一元配置分散分析

APTES:

3-アミノプロピルトリエトキシシラン

LB:

リソゲニーブロス

QNM:

定量的ナノメカニカル

S-layer:

表層

TEM:

透過型電子顕微鏡