HDAC1がmiR-124-5pとNPYを制御し、抑うつモデルラットの学習と記憶を調節

要旨

ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）と抑うつの関係については多くの研究が行われてきたが、HDAC1に焦点を当てたものは少ない。本研究は、HDAC1/マイクロRNA（miR）-124-5p/神経ペプチドY（NPY）軸の抑うつにおけるメカニズムを解明することを目的とした。スプラグ・ドーリー系ラットに慢性予測不能軽度ストレス（CUMS）を負荷して抑うつモデルを確立した。抑うつモデルラットにHDAC1阻害またはmiR-124-5p抑制を行い、体重、学習・記憶能力、血清中の酸化ストレスと炎症、海馬組織の神経伝達物質発現への影響を調べた。海馬におけるmiR-124-5p、HDAC1、NPYの発現を測定し、それらの相互作用も確認した。抑うつモデルラットの海馬では、miR-124-5pとHDAC1の発現が上昇し、NPY発現が低下していた。miR-124-5p阻害またはHDAC1抑制は、抑うつモデルラットの学習・記憶能力を改善し、体重を増加させた。miR-124-5pノックダウンまたはHDAC1阻害は、酸化ストレスと炎症を抑制し、神経伝達物質発現を促進した。HDAC1はmiR-124-5pを介在させてNPYを制御していた。NPYノックダウンは、miR-124-5p阻害の抑うつモデルラットに対する保護効果を消失させた。本研究は、miR-124-5pまたはHDAC1の抑制がNPYを上方制御し、抑うつモデルマウスの記憶と学習能力を改善することを示しており、抑うつの既存知識を更新し、治療への新たな指針を提供する可能性がある。

はじめに

抑うつは、世界的に深刻な経済的負担と社会的影響をもたらす重度の精神疾患です。抑うつは生理的、認知的、行動的変化を特徴とし、患者の全体的な健康を脅かします。ケタミンの速効性抗うつ薬としての応用や、特定の神経細胞サブタイプの活性を選択的に標的とする装置の改良により、抑うつ治療は発展してきました。さらに、カーボンドットなどの多機能ナノアーキテクチャが神経疾患に応用可能です。しかし、不十分な抑うつ治療は、パフォーマンス低下、行動機能障害、身体疾患、物質乱用、さらには自殺につながる可能性があります。したがって、抑うつ治療のための革新的な薬剤の発見が切実に求められています。

以前の研究では、miR-124レベルが抑うつ患者と抗うつ薬投与で血漿中に上昇することが報告されています。CUMS誘導抑うつでは、海馬におけるmiR-124発現が動的な変動を示し、抑うつの異なる段階での様々な病的変化を示唆しています。また、miR-124は大うつ病性障害における抑うつ様行動の改善候補とされています。さらに、miR-124抑制は前頭前野で抗うつ作用を示し、マウスの抑うつ様行動を減弱させます。ヒストン脱アセチル化酵素1（HDAC1）はmiR-124の仲介因子であり、転写制御とエピジェネティック修飾のための多タンパク質複合体を形成します。HDAC1活性の障害が大うつ病性障害におけるレジリエンスを促進することが知られています。また、脳内でのHDAC1抑制は気分障害やその他の神経可塑性に関連する脳疾患を改善できます。HDAC阻害剤は不安様行動とアルコール摂取行動を減弱させ、NPY発現を上昇させます。また、HDAC活性障害は、扁桃体中心核と内側核でのNPY発現増加をもたらします。NPYは視床下部の摂食促進性神経ペプチドであり、不安、社会障害、抑うつ症状を予防するのに十分です。さらに、NPYとその受容体は、リポ多糖誘導抑うつラットモデルで抗炎症作用と抗うつ作用を持つことが証明されています。これらを総合すると、HDAC1/miR-124-5p/NPY軸の抑うつにおける複合的な相互作用は不明確です。したがって、本研究はこの軸のメカニズムを解明し、抑うつ治療の治療候補を探索することを目的としています。

材料と方法

倫理声明

本研究の動物実験は、北海道大学医学部附属病院の実験動物倫理の要件に準拠しました。実験は、実験動物の飼育条件の改善、使用動物数の削減、動物の苦痛の軽減を図るよう最適化されました。

実験動物

特定病原体フリー（SPF）グレードのスプラグ・ドーリー（SD）系雄ラット（体重200～220 g）を、北海道大学医学部附属病院動物実験センター（北海道、日本）から入手しました。ラットはSPFグレード環境（22～24°C、湿度60～64%、12時間明暗サイクル）で飼育されました。モデリング期間とその他の特定時点を除き、ラットは自由に水と餌を摂取できました。

ラットの群分けとモデル確立

モデル化したラットを無作為に8群（n=10）に分けました：正常群（無処理ラット）、CUMS群（CUMS誘導抑うつラット）、sh-NC群（CUMS誘導抑うつラットにsh-HDAC1レンチウイルスNCを注射）、sh-HDAC1群（CUMS誘導抑うつラットにsh-HDAC1レンチウイルスを注射）、anti-miR-NC群（CUMS誘導抑うつラットにanti-miR-124-5pレンチウイルスNCを注射）、anti-miR-124-5p群（CUMS誘導抑うつラットにanti-miR-124-5pレンチウイルスを注射）、anti-miR-124-5p + sh-NC群（CUMS誘導抑うつラットにanti-miR-124-5pレンチウイルスとsh-NPYレンチウイルスNCを注射）、anti-miR-124-5p + sh-NPY群（CUMS誘導抑うつラットにanti-miR-124-5pレンチウイルスとsh-NPYレンチウイルスを注射）。

CUMS誘導抑うつラットモデルはWillner法により確立しました。正常群のラットは刺激なしで餌と水を与え、他の7群のラットは独立したケージで35日間CUMSを受けました。これらのラットには、4°Cの氷水での5分間遊泳（水深30 cm）、昼夜逆転（昼間12時間暗闇、夜間12時間白熱灯照明）、30秒間の尾部クランプ、1分間の振動、24時間の絶食と給水制限、30分間の超音波刺激（50 Hz）、湿った敷材、17°Cの冷房などの刺激を毎日ランダムに1つずつ与え、同じ刺激は合計5回を超えないようにしました。

ラットを2%ペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg）で麻酔し、両側海馬（前後径=4.8 mm、内外側距離=±2.5 mm、後頭窩と前頭蓋骨の間の距離=-3.5 mm）にハミルトンマイクロシリンジ（26G針）で1 μL/分の速度でレンチウイルスを注射しました。針を注射部位に5分間留置して逆流を防ぎました。頭蓋骨を骨ワックスで封鎖し、切開部を縫合し、ラットを7日間回復させました。sh-HDAC1レンチウイルスとそのNC、anti-miR-124-5pレンチウイルスとそのNC、sh-NPYとそのNC（タイター：10⁸ TU/mL）をGenePharma Co. Ltd.（上海、中国）から購入しました。

行動機能検査

CUMSモデリング前日（0日目）、モデリング終了後（36日目）、レンチウイルス介入後（52日目）にラットの体重を測定しました。

開放野試験（OFT）は、新しい環境でのラットの自律的・探索的行動を検出し、抑うつ様行動の評価に広く用いられます。この試験は、ビデオ追跡システムを設置した黒色木製開放野ボックス（100 cm × 100 cm × 50 cm）で行いました。ボックス底面を白線で25グリッド（20 cm × 20 cm）に区切りました。ラットを中央グリッドにランダムな順序で配置し、グリッド通過回数（四肢または両前肢と一後肢でグリッドに入った場合）と立位回数（前肢を持ち上げて一後肢で直立した場合）をビデオ追跡システムで記録しました。静かで薄暗い室内環境で実施し、各試験後に75%アルコールでボックスを清掃して臭気を除去しました。

快感喪失は抑うつの主要症状の一つです。ショ糖選好試験（SPT）でラットの抑うつ様行動を評価しました。SPT前に、各ラットに2本の糖水（1%ショ糖、w/w）を24時間、次に無菌水1本と糖水1本を24時間与えました。その後、23時間絶食・給水制限後、無菌水1本と糖水1本を30分間自由摂取させ、1時間後にボトル位置を入れ替えてさらに30分間自由摂取させました。この1時間での無菌水と糖水の消費量（mL）を測定し、ショ糖選好率（SPP）を算出しました。SPP = 糖水消費量 / (糖水消費量 + 無菌水消費量) × 100%。

モリス水迷路試験（MWM）は、ラットの空間学習・記憶能力評価に広く用いられます。直径150 cm、高さ60 cmの円形水槽（水深40 cm）を用いました。水温を22±1°Cに維持し、無毒で洗浄しやすい染料で水を黒く染めました。水槽と水面を4象限（SE、SW、NW、NE）に分け、各象限の内壁に対応する明るい色と特殊な形状のアイコンを配置しました。目標台は直径11 cmの円形透明台で、NE象限の中央に水面下1.5 cmに沈めました。水槽中央上部にビデオ追跡システムを設置し、遊泳速度、経路、目標台到達時間と象限内遊泳時間を記録しました。ラットを4象限からランダムな順序で水中に入れ、60秒以内に目標台へ到達・乗台することを許しました。目標台到達時間を逃避潜時として記録し、60秒以内に到達できない場合は誘導して逃避潜時を60秒としました。各試験後、ラットを目標台上で15秒間滞在させ、1日4回、5日間訓練しました。最終逃避潜時は3～5日目の平均値としました。MWM試験6日目に空間探索試験を行いました。目標台を撤去し、ラットをSW象限から水中に入れ、60秒間のNE象限内遊泳時間を空間探索時間として記録しました。

本実験のタイムラインを図1に示します。

Chronology of the present study

検体採取

最終MWM試験の翌日、ラットを安楽死させ、腹腔内に2%ペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg）を注射しました。胸腔を開き、シリンジで心血を採取し、3500 rpmで15分間、3回遠心分離し、上清を-20°Cで保存しました。採血後、左心室から大動脈へカテーテルを挿入し、500 mL生理食塩水で全身灌流して血液を洗い流しました。海馬組織を分離し、1.5 mL遠心管に入れて重量測定後、-80°Cで保存しました。海馬の一部を4%パラホルムアルデヒドで2時間固定し、勾配ショ糖で脱水後、パラフィン包埋しました。

酸化ストレス関連および炎症指標の検出

血清を再加温し、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、マロンジアルデヒド（MDA）、グルタチオン（GSH）、インターロイキン（IL）-β、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、一酸化窒素（NO）濃度を測定しました。SOD、MDA、GSH検出キットはBeyotime Institute of Biotechnology（上海、中国）、IL-β、TNF-α、NO用ELISAキットはNanJing JianCheng Bioengineering Institute（南京、中国）から入手しました。

ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色

パラフィン切片を脱蝋、エタノールで水和、蒸留水で洗浄し、ヘマトキシリン染色液で20分間染色しました。その後、切片が青くなるまで水道水で洗浄し、1%エタノール塩酸溶液で10秒間処理、水道水で洗浄、エタノールで脱水後、エオシンで2分間染色、高濃度アルコールで脱水、キシレンで透明化しました。最後に封入し、生物顕微鏡で観察しました。

神経伝達物質発現の検出

海馬組織を秤量し、生理食塩水（100 μL/10 mg）で超音波ホモジナイズしました。ホモジネートを4°Cで30分間放置し、12,000 rpm（4°C）で3分間遠心分離して上清を回収しました。上清の蛋白濃度をビシンコニン酸（BCA）蛋白検出キット（CWBIO、北京、中国）で測定し、ノルエピネフリン（NE）、セロトニン（5-HT）、ドパミン（DA）の発現レベルをELISAキットで測定しました。NE、5-HT、DA ELISAキットはLiweiping Biotechnology Co., Ltd.（北京、中国）から入手しました。

逆転写定量PCR（RT-qPCR）

海馬組織からRNA抽出キット（Promega、マディソン、ウィスコンシン州、米国）でRNAを抽出し、紫外分光光度計で濃度と純度を測定しました。逆転写キット（DRR047S、Takara、大連、中国）の指示に従い、RNAを相補的DNA（cDNA）に逆転写しました。mRNAはGoldScript one-step RT-PCR Kit（Applied Biosystems、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）、miRNAはHairpin-it™ miRNA quantitative detection kit（GenePharma）でcDNAに逆転写しました。RT-qPCR検出キット（Promega）で海馬組織中のHDAC1、miR-124-5p、NPY発現を測定しました。内部対照として、miR-124-5pにはU6、HDAC1とNPYにはβ-actinを用いました。PCRプライマーはSangon Biotech Co., Ltd.（上海、中国）から入手しました（表1）。標的遺伝子の相対発現を2^(-ΔΔCt)法で算出しました。

ウエスタンブロット解析

海馬組織を氷上で切断し、放射免疫沈殿アッセイ溶解液（Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.、北京、中国）で溶解して蛋白を抽出しました。蛋白濃度をBCA法で測定しました。総蛋白（50 μg）に5×SDSサンプルバッファーを1:4で添加し、沸騰水浴で5分間加熱しました。その後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、メンブレンに電気転写し、5%脱脂乳で1時間ブロッキングしました。一次抗体（HDAC1 1:1000、Cell Signaling Technology、ビバリー、マサチューセッツ州、米国；NPY 1:800、NeoMakers、フリーモント、カリフォルニア州、米国；β-actin 1:1000、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、英国）で一晩反応させ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体で再反応させました。増強化学発光法で現像し、Quantity Oneグレー解析ソフトウェアで光学密度を算出しました。標的遺伝子の蛋白発現を、β-actinグレー値に対するグレー値の比として表しました。

クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイ

ChIPアッセイをEZ-ChIPキット（Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国）の指示に従って行いました。HEK293T細胞を1%ホルムアルデヒドで10分間処理し、グリシンで停止しました。その後、2000 rpmで5分間遠心分離し、SDSライシスバッファーを添加して超音波処理しました。10,000 g、4°Cで10分間遠心分離し、細胞（100 μL）を900 μL ChIP希釈バッファー、20 μL 50×PIC、60 μL ProteinA Agarose/サーモン精子DNAと4°Cで1時間反応させ、10分間静置しました。沈殿物を700 rpmで1分間遠心分離し、20 μLをインプットとしました。1本のチューブにHDAC1抗体（1 μL）とイムノグロブリンG抗体を、もう1本には抗体なしで添加しました。両チューブのサンプルを一晩インキュベートし、溶出・脱クロスリンクしました。DNA回収後、RT-qPCRで測定しました。

デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

バイオインフォマティクスウェブサイト（https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/）でmiR-124-5pとNPYの結合部位を解析しました。NPY-ワイルドタイプ（WT）とNPY-変異型（MUT）プラスミドをHuayueyang Biotechnology Co., Ltd.（北京、中国）で作製しました。mimic NCまたはmiR-124-5p mimicとプラスミドを組み合わせてHEK293T細胞にトランスフェクションしました。細胞ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼ検出キット（BioVision）とGlomax20/20ルミノメーター（Promega）で測定しました。

統計解析

SPSS 21.0統計ソフトウェア（IBM Corp.、アーモンク、ニューヨーク州、米国）でデータ解析を行いました。結果を平均±標準偏差で表しました。2群間比較はt検定、多群比較は一元配置分散分析（ANOVA）を行い、事後検定としてTukey法を用いました。Pは両側検定を表し、P < 0.05を統計的有意としました。

結果

HDAC1またはmiR-124-5pの阻害は抑うつモデルラットの体重を増加させる

ラット体重をCUMSモデリング前日（0日目）、モデリング終了翌日（36日目）、レンチウイルス介入7日後（52日目）に測定しました。モデリング前には各群間で体重に差はありませんでした（すべてP > 0.05）。モデリング後、CUMS群、sh-NC群、sh-HDAC1群、anti-miR-NC群、anti-miR-124-5p群の体重は正常群と比較して減少していました（すべてP < 0.05）。CUMS群、sh-NC群、sh-HDAC1群、anti-miR-NC群、anti-miR-124-5p群間で体重に差はありませんでした（すべてP > 0.05）。介入後、CUMS群の体重は正常群と比較して減少していました（すべてP < 0.05）。CUMS群、sh-NC群、anti-miR-NC群間で体重に差はありませんでした（すべてP > 0.05）。sh-HDAC1群とanti-miR-124-5p群の体重は、それぞれのNC群と比較して増加していました（両方ともP < 0.05）。これは、HDAC1またはmiR-124-5pの阻害が抑うつモデルラットの体重を増加させることを示しています（図2a）。

Inhibition of either HDAC1 or miR-124-5p increases weight and improves learning and memory abilities of depressed rats. a Effects of inhibition with HDAC1 or miR-124-5p on the body weight of depressed rats; b SPP before and after inhibition with HDAC1 or miR-124-5p; c Frequency of crossing the grid in OFT before and after inhibition with HDAC1 or miR-124-5p; d Incidence of rearing in OFT before and after inhibition with HDAC1 or miR-124-5p; e Escape latency in MWM test before and after inhibition with HDAC1 or miR-124-5p; f Space exploration time in MWM test before and after inhibition with HDAC1 or miR-124-5p; n = 10; a P < 0.05 compared with the normal group; b P < 0.05 compared with the sh-NC group; c P < 0.05 compared with the anti-miR-NC group. Comparisons among multiple groups were evaluated by one-way ANOVA, and pairwise comparisons by Tukey's post hoc test

HDAC1またはmiR-124-5pの阻害は抑うつモデルラットの学習・記憶能力を改善する

SPT、OFT、MWM試験でSPP、グリッド通過頻度、立位頻度、逃避潜時、空間探索時間を測定しました（図2b-f）。介入前、正常群と比較して、CUMS群、sh-NC群、sh-HDAC1群、anti-miR-NC群、anti-miR-124-5p群ではSPP、グリッド通過頻度、立位頻度、空間探索時間が減少し、逃避潜時が延長していました（すべてP < 0.05）。これはラットに抑うつ様行動が発現したことを示唆します。CUMS群、sh-NC群、sh-HDAC1群、anti-miR-NC群、anti-miR-124-5p群間でこれらの指標に差はありませんでした（すべてP > 0.05）。介入後、sh-NC群とanti-miR-NC群と比較して、sh-HDAC1群とanti-miR-124-5p群ではSPP、グリッド通過頻度、立位頻度、空間探索時間が増加し、逃避潜時が短縮していました（すべてP < 0.05）。CUMS群、sh-NC群、anti-miR-NC群間で差はありませんでした（すべてP > 0.05）。これは、HDAC1沈黙またはmiR-124-5p抑制が抑うつ様行動を減弱させ、ラットの学習・記憶能力を改善することを示唆しています。

HDAC1またはmiR-124-5pの阻害は抑うつモデルラットの病理学的神経細胞損傷を減弱させる

HE染色による海馬病変の観察（図3a）では、正常群の海馬神経細胞は整然と配列し、明確な形態、正常な構造、密な層、明確な核と明確な核小体を示しました。CUMS群の神経細胞は縮小し、数が減少し、疎に配列し、クロマチンが不均一に分布し、層が薄くなっていました。sh-NC群とanti-miR-NC群はCUMS群と同様の状況でした。sh-HDAC1群とanti-miR-124-5p群は、それぞれのNC群と比較して神経細胞が整然と増加し、損傷が減弱していました。これは、HDAC1ノックダウンまたはmiR-124-5p阻害が抑うつモデルラットの海馬病変を軽減することを示しています。

Inhibition of either HDAC1 or miR-124-5p attenuates pathological hippocampus damage and up-regulates neurotransmitter expression in depressed rats. a HE staining of hippocampal lesions of depressed rats; b ELISA of NE expression in hippocampal tissues; c ELISA of 5-HT expression in hippocampal tissues; d ELISA of DA expression in hippocampal tissues; n = 6; a P < 0.05 compared with the normal group; b P < 0.05 compared with the sh-NC group; c P < 0.05 compared with the anti-miR-NC group. Comparisons among multiple groups were evaluated by one-way ANOVA, and pairwise comparisons by Tukey's post hoc test

HDAC1またはmiR-124-5pの阻害は抑うつモデルラットの神経伝達物質発現を上方制御する

抑うつは脳神経伝達物質障害と関連しています。したがって、ラット海馬のDA、NE、5-HT神経伝達物質レベルをELISAで測定しました。結果（図3b-d）は、正常群と比較して、CUMS群、sh-NC群、sh-HDAC1群、anti-miR-NC群、anti-miR-124-5p群でDA、NE、5-HTレベルが低下していました（すべてP < 0.05）。CUMS群、sh-NC群、anti-miR-NC群間で神経伝達物質発現に差はありませんでした（すべてP > 0.05）。sh-NC群とanti-miR-NC群と比較して、sh-HDAC1群とanti-miR-124-5p群ではDA、NE、5-HTレベルが上昇していました（すべてP < 0.05）。これは、HDAC1ダウンレギュレーションまたはmiR-124-5p減少が、抑うつモデルラット海馬のDA、NE、5-HTレベルを上方制御することを示唆しています。

HDAC1またはmiR-124-5pの阻害は抑うつモデルラットの酸化ストレスと炎症を抑制する

血清中の酸化ストレス関連および炎症因子発現を測定しました。正常群と比較して、他の抑うつモデル群ではSODとGSH活性が低下し、MDA、IL-1β、TNF-α、NOレベルが上昇していました（すべてP < 0.05）。CUMS群、sh-NC群、anti-miR-NC群間でSOD、GSH活性、MDA、IL-1β、TNF-α、NOレベルに差はありませんでした（すべてP > 0.05）。sh-NC群とanti-miR-NC群と比較して、sh-HDAC1群とanti-miR-124-5p群ではSODとGSH活性が上昇し、MDA、IL-1β、TNF-α、NOレベルが低下していました（すべてP < 0.05）（図4a-f）。これは、HDAC1枯渇またはmiR-124-5pダウンレギュレーションが、抑うつモデルラットの酸化ストレスと炎症を軽減することを示しています。

Inhibition of either HDAC1 or miR-124-5p suppresses oxidative stress and inflammation in depressed rats. a-c Effect of inhibition of either HDAC1 or miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum of depressed rats; d-f Effect of inhibition of either HDAC1 or miR-124-5p on IL-1β, TNF-α, and NO concentration in serum of depressed rats; n = 10; a P < 0.05 compared with the normal group; b P < 0.05 compared with the sh-NC group; c P < 0.05 compared with the anti-miR-NC group. Comparisons among multiple groups were evaluated by one-way ANOVA, and pairwise comparisons by Tukey's post hoc test

HDAC1はmiR-124-5pを介在させてNPYを制御する

RT-qPCRとウエスタンブロット解析で海馬のHDAC1、miR-124-5p、NPYを検出しました（図5a, b）。正常群と比較して、CUMS群ではHDAC1とmiR-124-5pが上昇し、NPYが低下していました（すべてP < 0.05）。CUMS群とsh-NC群間でHDAC1、miR-124-5p、NPY発現に変動はありませんでした（すべてP > 0.05）。sh-NC群と比較して、sh-HDAC1群ではHDAC1とmiR-124-5pが低下し、NPYが発現上昇していました（すべてP < 0.05）。これらの所見は、レンチウイルス介入の成功と、miR-124-5pとHDAC1発現の正の相関を示唆しています。

HDAC1 mediates miR-124-5p to regulate NPY. a HDAC1, miR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of HDAC1 by RT-qPCR (n = 6); b HDAC1 and NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of HDAC1 by western blot analysis (n = 6); c MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of miR-124-5p by RT-qPCR (n = 6); d NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of miR-124-5p by western blot analysis (n = 6); a P < 0.05 compared with the normal group; c P < 0.05 compared with the sh-NC group. Comparisons among multiple groups were evaluated by one-way ANOVA, and pairwise comparisons by Tukey's post hoc test

また、miR-124-5p抑制後のmiR-124-5pとNPY発現を検出しました（図5c, d）。正常群と比較して、CUMS群ではmiR-124-5pが上昇し、NPYが低下していました（両方ともP < 0.05）。逆に、anti-miR-124-5p群はanti-miR-NC群と比較してmiR-124-5pが低下し、NPYが上昇していました（両方ともP < 0.05）。CUMS群とanti-miR-NC群間でmiR-124-5pとNPY発現に差はありませんでした（両方ともP > 0.05）。これらの結果は、レンチウイルス介入の成功と、NPYとmiR-124-5pの負の相関を示しています。

ChIPアッセイでHDAC1がmiR-124-5pプロモーターに結合するかを検証しました。結果（図6a, b）は、HDAC1がmiR-124-5pプロモーター領域のみに関連していた（P < 0.001）ことを示し、HDAC1がmiR-124-5pを直接制御できることを示しています。

HDAC1 binds to the promoter of miR-124-5p. a Binding abundance of HDAC1 and miR-124-5p promoter region in HEK293T cells by ChIP assay (n = 3); b Binding abundance of HDAC1 and unrelated intergenic regions in HEK293T cells by ChIP assay (n = 3); c MiR-124-5p and NPY binding site by biological information software website; d Targeting relationship between miR-124-5p and NPY by dual luciferase reporter gene assay (n = 3); Comparisons between two groups were tested by t test

RNA22ツールとデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで、miR-124-5pとNPYの標的関係を予測・検証しました（図6c, d）。NPY-3'UTR-WTとmimic NCを共トランスフェクションした細胞と比較して、NPY-3'UTR-WTとmiR-124-5p mimicを共トランスフェクションした細胞ではルシフェラーゼ活性が低下していました（P < 0.05）。NPY-3'UTR-MUTとmimic NCを共トランスフェクションした細胞と、NPY-3'UTR-MUTとmiR-124-5p mimicを共トランスフェクションした細胞間でルシフェラーゼ活性に差はありませんでした（P > 0.05）。

NPYノックダウンは、miR-124-5p阻害の抑うつモデルラットに対する保護効果を消失させる

NPYとmiR-124-5pの自然枯渇をプログラムし、抑うつモデルラットでの相互作用を探索しました（図7a, b）。anti-miR-124-5p + sh-NPY群では、anti-miR-124-5p + sh-NC群と比較してNPY発現レベルが低下していました（P < 0.05）。体重と行動機能検査では（図7c-f）、anti-miR-124-5p + sh-NC群と比較して、anti-miR-124-5p + sh-NPY群のラットでは体重減少、SPP低下、グリッド通過頻度減少、立位頻度減少、空間探索時間短縮、逃避潜時延長が認められました（すべてP < 0.05）。海馬病変のHE染色（図8a）では、anti-miR-124-5p + sh-NC群と比較して、anti-miR-124-5p + sh-NPY群では海馬神経細胞数が減少し、濃染性、疎で無秩序な配列、不規則な形状、層の減少が見られました。さらに、anti-miR-124-5p + sh-NC群と比較して、anti-miR-124-5p + sh-NPY群ではDA、NE、5-HTが減少していました（すべてP < 0.05）（図8b）。また、anti-miR-124-5p + sh-NC群と比較して、anti-miR-124-5p + sh-NPY群ではSODとGSH活性が低下し、MDA、IL-1β、TNF-α、NOレベルが上昇していました（すべてP < 0.05）（図8c, d）。総じて、NPYノックダウンは、抑制されたmiR-124-5pの抑うつモデルラットに対する保護効果を消失させました。

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on body weight and behavioral function of depressed rats. a MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by RT-qPCR (n = 6); b NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by western blot analysis (n = 6); c Body weight of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); d SPP of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); e Frequency of crossing the grid and incidence of rearing after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); f Escape latency and space exploration time after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); Comparisons between two groups were tested by t test

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on hippocampal damages of depressed rats. a HE staining of hippocampal lesions of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); b ELISA of NE, 5-HT and DA expression in hippocampal tissues of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); C. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum (n = 10); D. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on IL-1β, TNF-α and NO concentration in serum (n = 10). Comparisons between two groups were tested by t test

考察

抑うつは、多様な症状を伴う様々な状態を含む精神疾患の一種です。新たな研究でmiRNAの抑うつにおける役割が示唆されていますが、miR-124-5pの正確な作用はほとんど調べられていません。したがって、本研究はmiR-124-5p/HDAC1/NPY軸の抑うつにおけるメカニズムのより良い理解を目的とし、主要な成果としてHDAC1またはmiR-124-5pの沈黙がNPYを上方制御し、抑うつモデルラットの記憶と学習能力を改善することを明らかにしました。

まず、本研究では海馬組織でのHDAC1発現を発見し、その発現上昇を示唆しました。続いて、抑うつモデルラットでのHDAC1の機能的役割を解明するために機能喪失アッセイを行い、HDAC1ノックダウンが体重増加、学習・記憶能力改善、病理学的損傷減弱、神経伝達物質発現上方制御、酸化ストレスと炎症抑制をもたらすことを明らかにしました。現在、ストレス世代間伝達による抑うつ様・不安様表現型でHDAC1発現増加が示唆されています。また、光血栓性脳梗塞のペンブラでのHDAC1発現上方制御、側頭葉てんかんの顆粒細胞と錐体細胞でのHDAC1 mRNA発現増加が報告されています。HDAC1の機能的役割として、神経細胞HDAC1の海馬でのウイルス媒介過剰発現が、マウスの状況依存性恐怖記憶喪失に特異的に影響することが報告されています。機序的に、HDAC阻害剤は神経変性疾患と加齢性記憶喪失における認知機能障害を逆転させます。実際、チアネプチンによるHDAC1抑制が神経可塑性を促進し、記憶を強化することが受け入れられています。先行研究では、HDAC1抑制がミトコンドリア疾患における運動ニューロン変性につながる病的プロセスを阻害することが結論付けられています。実験的に、5-チエニル置換2-アミノベンズアミド型によるHDAC1沈黙が、パーキンソン病モデルでの神経細胞死予防に部分的に関与することが示されています。これらの研究により、HDAC1沈黙の保護効果が、抑うつを含む脳疾患で確認されています。

次に、本研究ではHDAC1とmiR-124-5pの標的関係を発見しました。これは、EVI1が脱アセチル化酵素HDAC1と結合して作用することでmiR-124転写を担うという先行研究によって支持されています。miR-124-5pは抑うつモデルラットで過剰発現しており、miR-124-5pノックダウンは抑うつモデルラットでHDAC1沈黙と類似の機能を持ちました。実際、海馬でのmiR-124発現が抑うつ様行動表現型で5～6週目に上方制御されることが示されています。別の研究では、コカイン使用障害女性でのmiR-124発現増加が同定されています。また、大うつ病性障害のストレス負荷齧歯類でmiR-124-3pが高発現することが以前記載されています。効果については、前頭前野でのmiR-124ノックダウンがマウスの抑うつ様行動を減弱させることが報告されています。さらに、miR-124ノックダウンが慢性コルチコステロン誘導ギペノシドのマウスにおける抗うつ剤として機能することが信じられています。先行研究では、miR-124ノックダウンがより軽度なストレスパラダイムへの行動感受性改善をもたらすことが報告されています。レンチウイルストランスフェクションによる海馬でのmiR-124抑制が、ケタミン誘導神経変性をin vivoおよびin vitroで保護することが報告されています。いずれにせよ、miR-124-5p抑制は抑うつ減弱の能動的な因子です。

さらに、NPY発現がHDAC1とmiR-124-5pによって制御されることを検証しました。HDAC2に関連するヒストンアセチル化の悪化した欠損は、NPY発現低下と関連し、不安様行動と飲酒行動の制御に用いられる可能性があります。NPYは抑うつモデルラットでダウンレギュレーションされており、NPY上方制御は抑うつモデルラットの学習・記憶能力回復を促進しました。抑うつ様行動の発達において、ラットモデルはNPY発現減少を示します。学術的に、NPY発現が抑うつマウスで低下することが証拠として示されています。上記研究知見は、先行文献と一定程度一致しています。

本研究の新規知見は、miR-124-5p阻害またはHDAC1抑制が、抑うつモデルラットの学習・記憶能力を改善し、体重を増加させることを示唆しています。さらに、miR-124-5pノックダウンまたはHDAC1阻害が、酸化ストレスと炎症を抑制し、抑うつモデルラットの神経伝達物質発現を促進すること。また、HDAC1がmiR-124-5pを介在させてNPYを制御すること。レスキュー実験では、NPYノックダウンがmiR-124-5p阻害の抑うつモデルラットに対する保護効果を消失させることが示されました。

結論

要約すると、本研究はHDAC1/miR-124-5p/NPY軸の抑うつにおける効果を強調し、主要な知見としてmiR-124-5p阻害またはHDAC1抑制が、抑うつモデルラットの学習・記憶能力改善、体重増加、酸化ストレスと炎症抑制、神経伝達物質発現促進をもたらすことを示しました。HDAC1/miR-124-5p/NPY軸は神経疾患治療の参考となり得るものであり、抑うつの既存知識を更新する可能性があります。しかし、抑うつにおけるHDAC1/miR-124-5p/NPY軸の複雑なメカニズムの完全な理解には、さらなる研究が必要です。

データと材料の入手可能性

該当なし。

略語

miR-124-5p:

MicroRNA-124-5p

HDAC1:

ヒストン脱アセチル化酵素1

NPY:

神経ペプチドY

CUMS:

慢性予測不能軽度ストレス

SD:

スプラグ・ドーリー

SPF:

特定病原体フリー

NC:

ネガティブコントロール

OFT:

開放野試験

SPT:

ショ糖選好試験

SPP:

ショ糖選好率

MWM:

モリス水迷路試験

SOD:

スーパーオキシドジスムターゼ

MDA:

マロンジアルデヒド

GSH:

グルタチオン

IL-β:

インターロイキン-β

TNF-α:

腫瘍壊死因子-α

NO:

一酸化窒素

ELISA:

酵素免疫測定法

HE:

ヘマトキシリン・エオシン

BCA:

ビシンコニン酸

NE:

ノルエピネフリン

5-HT:

セロトニン

DA:

ドパミン

RT-qPCR:

逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応

cDNA:

相補的DNA

SDS:

ドデシル硫酸ナトリウム

ChIP:

クロマチン免疫沈降

UTR:

非翻訳領域

MUT:

変異型

WT:

ワイルドタイプ

ANOVA:

一元配置分散分析