薬剤耐性菌を滅菌するためのinsituエレクトロスピニングクルクミン複合ナノファイバーの二重抗菌効果

要約

特に多剤耐性菌によって引き起こされる細菌感染は、依然として人命を危険にさらしています。光線力学療法（PDT）はバクテリアを効果的に殺すことができ、ナノファイバーベースのPDTは正常組織への損傷を効果的に減らすことができます。しかし、繊維の表面にコーティングされた現在の光増感剤は、創傷に放出され、いくつかの副作用を引き起こします。また、従来の方法で調製されたナノファイバーは、創傷への接着性が低く、短距離効果のためにPDT効果が大幅に低下します。ここでは、コアシェルクルクミン複合ナノファイバーは、自作のポータブルエレクトロスピニングデバイスを介してその場エレクトロスピニング法によって調製されます。得られた複合ナノファイバーは、従来の調製方法とは異なる生体表面で優れた接着性を示します。 808 nmの照射により、これらの複合ナノファイバーは一重項酸素（¹ ）を効果的に生成しました。 O ₂ ）クルクミンが落ちることなく。これらの複合ナノファイバーが薬剤耐性菌にさらされた後、それらは二重の抗菌作用を示し、薬剤耐性菌を効率的に殺します。優れた接着性を備えたこれらの二重抗菌ナノファイバー膜は、抗菌ドレッシングとしての創傷感染の適用に役立つ可能性があります。

背景

タイムリーな治療を伴わない細菌感染は敗血症を引き起こし、敗血症は生命と健康を深刻に危険にさらします[1,2,3]。抗生物質は細菌を殺すことができますが、抗生物質を長期間使用すると、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）などの薬剤耐性菌が発生します[4,5,6]。 MRSAは、多剤耐性菌の一種であり、創傷感染を引き起こす一般的な細菌の1つです[7]。このような状況では、耐性を発達させることなく細菌を安全に殺すための戦略を見つける必要があります。光線力学療法（PDT）が効果的な滅菌方法であることがすでに証明されています[8、9、10、11]。ただし、PDT用のほとんどの光増感剤は紫外線または短波長励起を必要とします[12、13]。生物の光の侵入深さは波長に依存するため、紫外線と可視光線の侵入深さは浅く、近赤外（NIR）光の侵入深さは比較的深い。さらに悪いことに、紫外線と短波長の光は人間の組織をひどく燃やします。深部組織で安全で抗菌的な治療を実現するために、NIR光によって励起される光増感剤を開発することが需要とトレンドです。アップコンバージョンナノ粒子（UCNP）は、NIR光を短波長光に変換できます[14、15]。この特性により、光増感剤はアップコンバージョンと組み合わせてNIR励起を実現するように設計できます。 UCNPは、近赤外光を短波長に変換して光増感剤を励起し、一重項酸素（¹ ）を生成する波長変換ステーションとして使用されます。 O ₂ ）[16、17、18、19]。ただし、これまでの研究では、光増感剤でコーティングされたナノ粒子構造の調製に関するものがほとんどでした。ナノ粒子の最外層に裸の光増感剤は脱落しやすく[20、21]、また、組織のコラーゲン成長を阻害するなど、直接接触するために生体組織にいくつかの副作用があります[22、23]。実際、光増感剤が滅菌を達成できるのは、一重項酸素が生成されるためです。つまり、光増感剤が細菌や生体組織と直接接触する必要はありません。したがって、起こりうる副作用を回避するために、光増感剤を生体組織から分離するスペーサーを設計することができます。

エレクトロスピニングは、有機および無機ナノファイバーを含むナノファイバーを調製するための高速で効率的な方法です[24、25、26、27、28]。ナノファイバーの調製プロセス中に、ナノ粒子は繊維と結合して複合ナノファイバーを形成するのが簡単です。複合ナノファイバーを形成するには、主に2つの方法があります。 1つはナノファイバー内に粒子をドーピングすることであり[29]、もう1つはナノファイバーの表面に粒子をロードすることです[30、31]。光増感剤を生体組織から分離する目的を考えると、脱落しやすい繊維表面に光増感剤を充填するよりも、ナノファイバーに光増感剤を組み込む方が好ましい。しかし、ナノファイバーが疎水性で浸透できない場合、一重項酸素を生成して繊維表面に送達することは困難であり、抗菌特性を実現します[32]。しかし、親水性ナノファイバーは、間質液で汚染されていると簡単に溶解します。したがって、NIR光増感剤をナノファイバーと組み合わせて、光線力学的ナノファイバーが細菌、特に薬剤耐性菌を効果的に殺すことができるようにする必要があります。

この研究では、クルクミンは生物抽出物からの幅広い供給源があるため、光増感剤として使用されています。 UCNPのコアシェルナノ構造は波長伝達ステーションとして使用され、¹ を生成するための高い変換効率を示します O ₂ 。 UCNPs @ Curcumin複合ナノファイバーは、自作のエレクトロスピニングデバイスを介したinsituエレクトロスピニング法によって調製されます。この方法で得られた複合ナノファイバーのさまざまな生体表面への接着性は、従来のエレクトロスピニング調製法よりも優れています。 808 nmの照射により、これらの複合ナノファイバーは効果的に¹ を生成できます。 O ₂ クルクミンが落ちることなく。これらの複合ナノファイバーがMRSAの薬剤耐性菌で汚染された後、薬剤耐性菌を効果的に殺す二重の抗菌作用が発生します。

メソッド

資料

塩化ツリウム、塩化イッテルビウム、塩化ネオジミウム、および塩化イットリウムは、Sigma-Aldrichから購入しました。メタノール、エタノール、シクロヘキサン、クルクミン、ジクロロメタン、アセトン、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリカプロラクトン（PCL）、およびポリエチレンイミン（PEI）は、Sinopharm ChemicalReagentsから購入しました。すべての材料はさらに精製することなく使用されました。

コアシェルNaYFの合成₄ ：Yb / Tm @ NaYF ₄ ：Nd @ Curcumin

NaYF ₄のアップコンバージョンナノ粒子（UCNP）：Yb / Tm @ NaYF ₄ ：Ndは共沈法を使用して合成されました[33、34]。その後、200 mgの調製したままのUCNP、90 mgのPEI、および180 mgのクルクミンを添加し、ジクロロメタンに溶解しました。反応物を室温で20時間均一に攪拌し、得られた生成物を遠心分離で精製し、エタノールで2回洗浄しました。

InSituエレクトロスピニングによるクルクミン複合ナノファイバーの調製

1グラムのPCL、0.16 gのPVP、および0.1gのNaYF ₄ ：Yb / Tm @ NaYF ₄ ：Nd @Curcuminを5mLのアセトンに加えました。 12時間攪拌した後、エレクトロスピニング用の均質な前駆体溶液が得られました。エレクトロスピニングには、5mLシリンジに3mLの前駆体溶液を入れ、直径0.4 mmの金属針、2つのアルカリ電池、および変換可能な高電圧コンバーターで構成される、自作のハンドヘルドエレクトロスピニング装置を使用しました。エレクトロスピニング用に3Vのバッテリーから10kVまで。コレクターとエレクトロスピニング針の間のエレクトロスピニング距離は約10cmでした。

検出 ¹ O ₂ フォーメーション

¹ を検出するために、一重項酸素センサーグリーン（SOSG）が使用されました。 O ₂ 形成。異なる濃度のUCNPs @ Curcuminを含む9×9mmの正方形の調製されたままのナノコンポジットファイバーメンブレンを石英キュベットに加え、次に25μMのSOSGを含む3mLのメタノールを加えました。その後、キュベットは異なる照射時間で808nmのレーザーの下で照射されました。励起波長504nmの蛍光分光光度計を使用して、一重項酸素レベルを反映するこの溶液の蛍光強度を測定しました。

抗菌アッセイ

MRSAと大腸菌の薬剤耐性菌を用いて抗菌力を評価しました。手短に言えば、細菌株はトリプシン大豆ブロス培地で培養された。細菌株を含む培地を37℃で15時間培養しました。培養後の菌株濃度は1×10 ⁶ でした。 CFU / mL。合計で、100μLの細菌溶液を滅菌超清浄テーブルの96ウェルプレートの各ウェルに入れました。次に、直径6mmの円形ファイバーメンブレンを96ウェルプレートの各ウェルに追加しました。 808 nmのレーザー照射を20分間行った後、プレート内の細菌溶液を滅菌水で10倍に希釈しました。 10μLの希釈剤を栄養寒天プレートに入れて、均一にコーティングされた寒天プレートを得ました。処理した寒天プレートを恒温バクテリアインキュベーター内で37℃で18時間培養し、写真を撮りました。対照群では、808 nmのレーザー照射を使用しなかったことを除いて、手順は上記と同じでした。各グループは5枚のプレートで繰り返されました。

特性評価

TEMおよびSEM画像は、JEM-2010およびSU-1510電子顕微鏡から取得されました。蛍光スペクトルは、エジンバラFLS1000蛍光分光光度計で測定されました。吸収スペクトルは島津UV2550分光計で記録されました。フーリエ変換赤外分光法は、NicoletiS50分光計で行われました。ゼータ電位はWJL-608アナライザーで測定しました。液滴法による親水性は、PT-602Atest装置によってテストされました。

結果と考察

ナノ粒子と複合ナノファイバーの特性評価

図1aは、NaYF ₄のTEM画像を示しています。：Yb / Tm @ NaYF ₄ ：Ndナノ粒子（UCNP）。これは、平均直径が約45nmのUCNPの均一なサイズ分布を示しています。これらのナノ粒子のゼータ電位は、+ 19 mVであることがさらにテストされました（追加ファイル1：図S1）。 UCNPをクルクミンでコーティングした後、図1bはコアシェル構造を示し、クルクミンシェルの厚さは約5nmです。その後、これらのコアシェルクルクミンナノ粒子はPCL / PVPファイバーに埋め込まれました。図1cは、自己設計のハンドヘルドエレクトロスピニングデバイスによって作成されたこれらの複合ナノファイバーのSEM画像を示しています。このデバイスで作成された連続および非破壊ナノファイバーの直径は約400nmであり、ファイバーの均一性は従来のエレクトロスピニングデバイスと同様です（追加ファイル1：図S2）。このポータブルエレクトロスピニングデバイスは、1.5 Vの乾電池2個で動作できることに注意してください（追加ファイル1：図S3）。これにより、都市の電源を使用する際の制限がなくなります。軽量（160 g）と小型のその他の利点と組み合わせると、屋外での使用に役立ちます。図1dは、これらの複合ナノファイバーのTEM画像を示しています。これは、ナノ粒子がナノファイバー内で良好な分散性を持っていることを示しています。

NaYF ₄をコーティングする理由：NaYF ₄のNdシェル：Yb / Tmコアは、フォトルミネッセンスを強化できることでした（図2a）。 UCNPの蛍光スペクトルはクルクミンのUV-Vis吸収スペクトルとよく重なり合っているため（図2b）、UCNPのより強いフォトルミネッセンスがより多くのエネルギーをクルクミンに伝達できることを意味します。これは光増感剤の励起を助長しました。さらに、波長808 nmのNIR光は、波長980 nmのNIR光よりも生体組織に深く浸透することを考慮して、このNaYF ₄ ：Ndシェルは、励起波長を980〜808 nmに変調できるため（追加ファイル1：図S4）、正常組織での望ましくない火傷を減らすことができます。 FTIR測定をさらに測定しました。図2cからわかるように、1628 cm ^-1 でのC =Oの伸縮振動、1282 cm ^-1 でのC–O 、および1028 cm ^-1 でのC–O–C クルクミン（緑色の線）に由来するナノコンポジット粒子（オレンジ色の線）で発生します。一方、1125 cm ^-1 ではC–Nの伸縮振動があります。、PEI（青い線）から来ています。それらの分子構造図は付録に示されています（追加ファイル1：図S5）。さらに、約1660 cm ^-1 に弱いC =Cがあります。、これは、UCNPの合成と同時にオレイン酸に対応します。 UCNPs @クルクミン複合ナノファイバーの成分を示すことができます。

図2dは、クルクミンのコーティング前後のUCNPの蛍光減衰曲線を示しています。クルクミンシェルでコーティングした後、UCNPの蛍光寿命が700μsから390μsに減少したことを示しています。 γに基づいて =1 − τ ₂ / τ ₁ 、ここでτ ₂ およびτ ₁ クルクミンのエンベロープの前後のUCNPの寿命ですγ はエネルギー伝達効率です[35]。したがって、γ 44.3％と計算されました。このような高いエネルギー伝達効率が得られました。これは、最初の側面では、クルクミンの吸収スペクトルとUCNPのフォトルミネッセンススペクトルの良好なオーバーラップによるものであり（図2b）、それらの間で非放射エネルギー伝達が発生する可能性があります。 2番目の側面は、UCNPがNaYF ₄を持っていたことです。：Ndシェルは、蛍光強度を高め、スペクトルの重なり積分面積を増やします。 3番目の側面は、クルクミンとUCNPの間の距離がコーティングの厚さ（<5 nm）であり、この短い距離が高効率の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の生成につながることでした。 FRET法では、44.3％ものエネルギー移動効率を得ることができます。これは、次の¹ の効率的な生成にも役立ちます。 O ₂ 。

^1を生成 O ₂ 複合ナノファイバーから

ナノコンポジット繊維が¹ を生成する能力を評価するため O ₂ 、SOSGメソッドが使用されました。まず、ドーピング濃度が固定されたナノコンポジットファイバーを使用して、¹ の生成を観察しました。 O ₂ 異なる照射時間の下で。図3aに示すように、0.20 wt％などの固定濃度の場合、照射時間は¹ の生成に影響を与える要因の1つです。 O ₂ 。照射時間が長いほど、¹ が多くなります。 O ₂ 生産されました。ただし、¹ の濃度にもかかわらず、 O ₂ 照射時間の増加とともに徐々に増加し、上昇率は徐々に遅くなり、20分後もほぼ一定に保たれます。これは、密な曲線間隔によって表されます。この現象は、¹ を生成することによって消費される局所的な酸素が速いことが原因である可能性があります。 O ₂ 持続的な近赤外光放射により、局所領域の酸素レベルが比較的低くなり、¹ の生成速度が低下します。 O ₂ 。

¹ の生成に対するドーピング濃度の影響を観察する O ₂ 、図3bがさらに描かれています。図3bに示すように、20分などの固定照射時間で、ドーピング濃度を上げると、より多くの¹ O ₂ 生産されました。ただし、¹ の上昇率 O ₂ 濃度が0.20wt％を超えると、速度が低下しました。これらの実験結果は、より多くの¹ を生成するために、照射時間とドーピング濃度を無限に増やす必要がないことを示唆しています。 O ₂ 。最適な選択は20分で0.20wt％であるため、次の実験ではこの濃度と照射時間がかかります。

InSituエレクトロスピニングナノファイバー膜の湿潤性と接着性

¹ の作成を検討中 O ₂ は、体液中の酸素と相互作用するために繊維中のUCNPs @クルクミンナノ粒子を必要とするプロセスであるため、この繊維膜の接触角をさらにテストしました。図4aは、この複合ナノファイバー膜の表面に滴下した水滴と、20秒後の湿潤性を示しています。純粋なPCLナノファイバー膜（図4b）と比較して、複合ナノファイバー膜はより優れた湿潤性を備えています。興味深いことに、複合ナノファイバー膜をリン酸緩衝液（PBS）に浸した後、吸収分光計によってPBSでUCNPs @クルクミンが検出されませんでした。これは、繊維からクルクミンが放出されなかったことを意味します。クルクミンがUCNPにコーティングされていたため、UCNPs @クルクミンのサイズ（〜50 nm）が大きすぎて繊維を貫通できなかったことが原因である可能性があります。粒子や繊維に光増感剤をコーティングする方法と比較して、最初にクルクミンのサイズを大きくしてから湿潤繊維にドープすると、光増感剤の脱落を効果的に回避し、¹ の生成と拡散を促進できます。 O ₂ 。さらに、PDTの短距離効果と、従来のエレクトロスピニング法で作成された繊維膜の創傷表面への接着不良を考慮すると（図4c、追加ファイル1：図S6）、光力学的効果が影響を受けます。繊維膜と表面の間の間隔のため。幸いなことに、これらのクルクミン複合ナノファイバーは、良好な形態のin situエレクトロスピニング法によって調製でき（図1c）、さまざまな物体表面で良好な接着性も示しました（図4d）。これは、光線力学的繊維膜を調製するためのその場エレクトロスピニング堆積法が、繊維膜を箔上に集めてから創傷表面に押し付ける従来の紡糸法よりも好ましいことを意味します。

クルクミン複合ナノファイバーの二重抗菌効果

デバイスによって調製されたナノコンポジット繊維は、MTTアッセイによって無毒であることが証明されています（追加ファイル1：図S7）。さらに、繊維が良好な抗菌特性を有することを証明するために、カウント法を使用して、複合ナノファイバーの抗菌特性を評価した。図5に示すように、808 nmの光が純粋なファイバーに照射されているかどうかに関係なく、抗菌性はありません（図5a、b）。これらの結果は、808nmの光自体には殺菌効果がないことを示しています。繊維にUCNPをドープしても、バクテリアは減少しません。これは、UCNPに殺菌効果がないことを確認しています（図5a '、b'）。興味深いことに、繊維にクルクミンをドープすると、細菌の数がある程度減少します。これは、クルクミン自体が特定の抗菌活性を示すことを証明しています（図5c、c '）。さらに、明らかな殺菌結果は、NIR光照射下でUCNPs @クルクミンをドープした繊維で発生しました（図5d '、e'）。図3の結果と組み合わせると、これらの殺菌結果は¹ O ₂ 808nmの照射下でUCNPs @ Curcuminから生成されたものは、バクテリアを効果的に殺すことができます。一方、クルクミンの吸光度は可視光範囲にあるため（図2b）、808 nmの照射の有無でクルクミンの抗菌活性は同じであり、808nmの光でした。効果的ではありませんでした。これは、クルクミンがUCNPの表面をコーティングするように設計された理由でもあります。さらに、図5d、eは、それぞれ0.15 wt％と0.20 wt％のUCNPs @Curcuminをドープしたファイバーを示しています。比較すると、0.20 wt％のグループは、20分の光照射でより優れた殺菌特性を示し、抗菌効果は95％に達したことがわかります。これは、¹ が O ₂ 光線力学的効果で光増感剤クルクミンによって生成された薬剤耐性菌を殺すことができます。この結果は、¹ とも一致しています。 O ₂ これらのデータはさらに、UCNPs @ Curcuminをドープした繊維は、その二重の抗菌活性、つまりUCNPs @ CurcuminとPDTをドープした繊維により、MRSAを殺すことができ、PDTはUCNPs @Curcuminをドープした繊維よりも優れた抗菌効果を持っていることを示しています。。さらに、大腸菌を用いた実験も実施し、その場でエレクトロスピニングされたクルクミン複合ナノファイバーが薬剤耐性菌に対して二重の抗菌効果を有することも確認しました（追加ファイル1：図S8）。そして、ナノファイバーの抗炎症効果は、MRSAのH＆E染色によってさらに検証されました（追加ファイル1：図S9）。創傷感染の異なる治療後、組織損傷および化膿性感染による紫および青の細胞クラスターである、ナノコンポジット繊維のないグループに多数の好中球が収集された。しかし、少量の肉芽組織と赤血球がナノファイバーグループに現れました。これは、ナノコンポジットファイバーの抗菌特性を間接的に反映しています。創傷感染の炎症をブロックする効果があります。

結論

要約すると、コアシェルクルクミン複合ナノファイバーは、自作のポータブルエレクトロスピニングデバイスを介したinsituエレクトロスピニング法によって調製されます。得られた複合ナノファイバーは、従来の調製方法よりも異なる生物学的表面で優れた接着性を示します。この方法では、最初にクルクミンのサイズを大きくし、次にそれを水和性繊維にドープすることで、光増感剤の脱落を効果的に回避できるため、¹ の生成が促進されます。 O ₂ そしてその拡散は、他の光線力学的ナノ材料を設計するためのインスピレーションを提供するかもしれません。これらの複合ナノファイバーが薬剤耐性菌で汚染された後、それらは二重の抗菌作用を示し、薬剤耐性菌を効率的に殺します。これらの二重抗菌ナノファイバー膜は優れた接着性を備えており、止血と組み合わせて抗菌ドレッシングとして使用できるため、屋外での止血が可能になります。