インシチュエレクトロスピニングによるクルクミンナノファイバー：薬剤耐性菌殺菌のための二重抗菌作用

要旨

多剤耐性菌による細菌感染は依然として人命を脅かしている。光線力学療法（PDT）は効果的に細菌を殺菌でき、ナノファイバーベースのPDTは正常組織へのダメージを効果的に軽減できる。しかし、従来法で繊維表面に担持された光増感剤は創傷へ遊離し、副作用を引き起こす。また、従来法で調製されたナノファイバーは創傷への付着性が低く、PDTの短距離効果によりその効果が著しく減少する。本研究では、自作の携帯型エレクトロスピニング装置を用いたインシチュエレクトロスピニング法により、コア-シェル構造クルクミン複合ナノファイバーを調製した。得られた複合ナノファイバーは、従来調製法より様々な生体表面への優れた付着性を示す。808 nm照射下で、これらの複合ナノファイバーはクルクミンが脱落することなく効果的に一重項酸素（¹O₂）を生成する。薬剤耐性菌に曝露させると、二重抗菌挙動を示し、効率的に薬剤耐性菌を殺菌する。優れた付着性を持つこれらの二重抗菌ナノファイバー膜は、抗菌ドレッシングとして創傷感染治療への応用が期待される。

背景

適切な治療なしの細菌感染は敗血症を引き起こし、敗血症は生命と健康を深刻に脅かす[1-3]。抗生物質は細菌を殺菌できるが、長期使用はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）などの薬剤耐性菌の発生を招く[4-6]。MRSAは多剤耐性菌の一種で、創傷感染を引き起こす常在菌の一つである[7]。この状況下、耐性獲得なしに安全に細菌を殺菌する戦略を見出す必要がある。光線力学療法（PDT）が効果的な殺菌法であることはすでに証明されている[8-11]。しかし、PDT用のほとんどの光増感剤は紫外線や短波長光での励起を必要とする[12, 13]。生体内での光の浸透深度は波長に依存し、紫外線と可視光の浸透深度は浅いが、近赤外（NIR）光の浸透深度は比較的深い。さらに悪いことに、紫外線と短波長光は人体組織を深刻に損傷する。深部組織で安全かつ抗菌的な治療を実現するには、NIR光で励起される光増感剤の開発が要求され、トレンドとなっている。アップコンバージョンナノ粒子（UCNP）はNIR光を短波長光に変換できる[14, 15]。この特性により、光増感剤をアップコンバージョンと組み合わせてNIR励起を実現できる。UCNPは波長変換ステーションとしてNIR光を短波長に変換し、光増感剤を励起して一重項酸素（¹O₂）を生成する[16-19]。しかし、先行研究の多くは光増感剤担持ナノ粒子構造の調製に焦点を当てている。ナノ粒子最外層に露出した光増感剤は脱落しやすく[20, 21]、生体組織と直接接触することでコラーゲン成長阻害などの副作用も生じる[22, 23]。実際、光増感剤が殺菌できるのは一重項酸素を生成するためであり、光増感剤が細菌や生体組織と直接接触する必要はない。したがって、光増感剤と生体組織を隔てるスペーサーを設計し、副作用を回避できる。

エレクトロスピニングは、有機・無機ナノファイバーを含むナノファイバー調製の迅速かつ効率的な手法である[24-28]。ナノファイバー調製過程で、ナノ粒子は容易に繊維と結合し複合ナノファイバーを形成する。複合ナノファイバー形成には主に2つの方法がある：ナノファイバー内部への粒子ドープ[29]、およびナノファイバー表面への粒子担持[30, 31]。光増感剤を生体組織から分離する目的を考えると、ナノファイバー内部への光増感剤組み込みが、表面担持（脱落しやすい）より好ましい。しかし、ナノファイバーが疎水性で浸透しない場合、一重項酸素の生成と繊維表面への輸送が困難となり抗菌性が発現しにくい[32]。一方、親水性ナノファイバーは間質液で汚染されると溶解しやすい。したがって、NIR光増感剤とナノファイバーを結合し、光線力学ナノファイバーが特に薬剤耐性菌に対して効果的に殺菌できることを保証する必要がある。

本研究では、生物抽出物由来で広く入手可能なクルクミンを光増感剤として用いた。コア-シェル構造UCNPを波長変換ステーションとして用い、¹O₂生成の高い変換効率を示す。UCNPs@クルクミン複合ナノファイバーを、自作エレクトロスピニング装置によるインシチュエレクトロスピニング法で調製した。この方法で得られた複合ナノファイバーの、様々な生体表面への付着性は従来のエレクトロスピニング調製法より優れている。808 nm照射下で、これらの複合ナノファイバーはクルクミン脱落なしに効果的に¹O₂を生成する。これらの複合ナノファイバーをMRSA薬剤耐性菌で汚染すると、二重抗菌挙動を示し、効果的に薬剤耐性菌を殺菌する。

方法

材料

チウム塩化物、イッテルビウム塩化物、ネオジム塩化物、イットリウム塩化物をシグマアルドリッチから購入。メタノール、エタノール、シクロヘキサン、クルクミン、ジクロロメタン、アセトン、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレンイミン（PEI）をシノファーム試薬から購入。すべての材料を精製なしで使用した。

コア-シェルNaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@クルクミンの合成

アップコンバージョンナノ粒子（UCNP）NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Ndを共沈殿法で合成した[33, 34]。その後、調製済みUCNP 200 mg、PEI 90 mg、クルクミン 180 mgをジクロロメタンに添加溶解した。反応物を室温で20時間均一に攪拌し、遠心分離で精製、エタノールで2回洗浄した。

インシチュエレクトロスピニングによるクルクミン複合ナノファイバー調製

PCL 1 g、PVP 0.16 g、NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@クルクミン 0.1 gをアセトン 5 mLに添加した。12時間攪拌後、エレクトロスピニング用の均一な前駆体溶液を得た。5 mLシリンジに3 mLの前駆体溶液を取り、自作携帯型エレクトロスピニング装置でエレクトロスピニングを行った。装置は直径0.4 mmの金属針、2本のアルカリ乾電池、3 Vの電池電圧をエレクトロスピニング用10 kVに変換する高圧変換器で構成される。コレクターとエレクトロスピニング針の距離は約10 cmとした。

¹O₂生成検出

一重項酸素センサーグリーン（SOSG）を用いて¹O₂生成を検出した。異なる濃度のUCNPs@クルクミンを含む9×9 mm角の調製済みナノコンポジットファイバー膜を石英キュベットに入れ、25 μM SOSGを含むメタノール 3 mLを添加した。その後、異なる照射時間で808 nmレーザー照射を行った。励起波長504 nmの蛍光分光光度計で溶液の蛍光強度を測定し、一重項酸素レベルを反映させた。

抗菌アッセイ

薬剤耐性菌MRSAと大腸菌を用いて抗菌能を評価した。簡潔に述べると、細菌株をトリプトソイ培地で培養し、37 ℃で15時間培養した。培養後、細菌濃度は1×10⁶ CFU/mLとなった。96ウェルプレートの各ウェルに無菌クリーンベンチ上で100 μLの細菌溶液を分注し、直径6 mmの円形ファイバー膜を各ウェルに添加した。808 nmレーザーで20分間照射後、プレート内の細菌溶液を無菌水で10倍希釈し、10 μLを寒天平板に滴下して均一塗布した。処理済み寒天平板を37 ℃の恒温培養器で18時間培養し、撮影した。対照群では上記手順と同じだが、808 nmレーザー照射を行わない。各群を5プレートで繰り返した。

キャラクタリゼーション

TEMとSEM像はJEM-2010とSU-1510電子顕微鏡で撮影。蛍光スペクトルはエディンバラFLS1000蛍光分光光度計で測定。吸収スペクトルは島津UV2550分光計で記録。フーリエ変換赤外分光はニコレットiS50分光計で測定。ゼータ電位はWJL-608アナライザーで測定。親水性はPT-602A試験装置で固定滴法により試験した。

結果と考察

ナノ粒子と複合ナノファイバーのキャラクタリゼーション

図1aにNaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Ndナノ粒子（UCNP）のTEM像を示す。平均直径約45 nmの均一なサイズ分布を示す。これらのナノ粒子のゼータ電位は+19 mVと測定された（追加ファイル1: Fig. S1）。UCNPをクルクミンでコート後、図1bにコア-シェル構造が示され、クルクミンシェル厚は約5 nmである。その後、これらのコア-シェルクルクミンナノ粒子をPCL/PVP繊維に埋め込んだ。図1cに自作携帯型エレクトロスピニング装置で調製した複合ナノファイバーのSEM像を示す。この装置で調製された連続的で破断のないナノファイバーの直径は約400 nmで、繊維均一性は従来のエレクトロスピニング装置と類似している（追加ファイル1: Fig. S2）。この携帯型エレクトロスピニング装置は1.5 Vの乾電池2本で動作可能（追加ファイル1: Fig. S3）であり、商用電源の制約から解放される。軽量（160 g）と小型という他の利点と合わせ、屋外使用に有益である。図1dに複合ナノファイバーのTEM像を示し、ナノ粒子がナノファイバー内で良好に分散していることを示す。

NaYF₄:NdシェルをNaYF₄:Yb/Tmコア上にコートした理由は、光ルミネッセンスを増強できるためである（図2a）。UCNPの蛍光スペクトルがクルクミンのUV-Vis吸収スペクトルとよく重なる（図2b）ため、より強いUCNP光ルミネッセンスがクルクミンへより多くのエネルギーを移転させ、光増感剤励起に有利となる。さらに、波長808 nmのNIR光が波長980 nmのNIR光より生体組織への浸透深度が深いことを考慮し、このNaYF₄:Ndシェル導入により励起波長を980 nmから808 nmへ変調可能（追加ファイル1: Fig. S4）であり、正常組織への望ましくない火傷を低減できる。FTIR測定をさらに実施した。図2cから、ナノコンポジット粒子（橙線）で1628 cm⁻¹のC=O伸縮振動、1282 cm⁻¹のC–O伸縮振動、1028 cm⁻¹のC–O–C伸縮振動が観察され、これらはクルクミン（緑線）に由来する。同時に、1125 cm⁻¹にC–N伸縮振動が見られ、これはPEI（青線）に由来する。それらの分子構造図は付録（追加ファイル1: Fig. S5）に示す。さらに、約1660 cm⁻¹に弱いC=Cが見られ、これはUCNP合成時に同時に存在するオレイン酸に対応する。これらはUCNPs@クルクミン複合ナノファイバーの成分を実証する。

図2dに、クルクミンコート前後のUCNP蛍光減衰曲線を示す。クルクミンシェルコートによりUCNP蛍光寿命が700 μsから390 μsへ減少した。γ = 1 - τ₂/τ₁（τ₁、τ₂はクルクミン被覆前後のUCNP寿命、γはエネルギー移転効率）[35]に基づき、γ = 44.3%と計算された。このような高いエネルギー移転効率が得られたのは、第一にクルクミン吸収スペクトルとUCNP光ルミネッセンススペクトルの良好な重なり（図2b）により非輻射エネルギー移転が起こるため、第二にUCNPがNaYF₄:Ndシェルを持ち蛍光強度が増強されスペクトル重なり積分面積が増大するため、第三にクルクミンとUCNPの距離がコート厚（<5 nm）であり、この短距離が高効率蛍光共鳴エネルギー移転（FRET）生成に有利であるためである。FRET法により44.3%の高いエネルギー移転効率が得られ、これは続く効率的な¹O₂生成にも有益である。

複合ナノファイバーからの¹O₂生成

ナノコンポジットファイバーの¹O₂生成能力を評価するため、SOSG法を用いた。まず、固定ドープ濃度のナノコンポジットファイバーを用い、異なる照射時間での¹O₂生成を観察した。図3aに示すように、0.20 wt%などの固定濃度では、照射時間が¹O₂生成に影響する因子の一つである。照射時間が長いほどより多くの¹O₂が生成される。しかし、¹O₂濃度の上昇率は照射時間増加とともに徐々に鈍化し、20分後にはほぼ一定となり、曲線間隔が密になる。この現象は、持続的NIR光照射による¹O₂生成での局所酸素高速消費により、局所酸素濃度が相対的に低下し、¹O₂生成上昇率が低下するためと考えられる。

ドープ濃度の¹O₂生成への影響を観察するため、図3bをさらに示す。図3bに示すように、固定照射時間（20分）では、ドープ濃度増加に伴いより多くの¹O₂が生成される。しかし、濃度が0.20 wt%を超えると¹O₂上昇率が鈍化する。これらの実験結果は、照射時間とドープ濃度を無限に増やしても更なる¹O₂生成増加は期待できないことを示唆する。最適選択は0.20 wt%、20分照射であり、以降の実験ではこの条件を用いる。

インシチュエレクトロスピニングナノファイバー膜の濡れ性と付着性

¹O₂生成は繊維内UCNPs@クルクミンナノ粒子が体液中の酸素と相互作用するプロセスであるため、このファイバー膜の接触角をさらに試験した。図4aに、この複合ナノファイバー膜表面への水滴滴下後20秒の濡れ性を示す。純粋PCLナノファイバー膜（図4b）と比較し、複合ナノファイバー膜はより良好な濡れ性を示す。興味深いことに、複合ナノファイバー膜をリン酸緩衝液（PBS）に浸漬後、吸収分光光度計でPBS中にUCNPs@クルクミンが検出されず、クルクミンが繊維から脱落しなかったことを意味する。理由は、クルクミンがUCNP上にコートされているため、UCNPs@クルクミンのサイズ（～50 nm）が繊維を貫通するには大きすぎるためと思われる。光増感剤を粒子や繊維表面に担持する従来法と比較し、クルクミンサイズをまず大きくしてから濡れ性繊維へドープすることで、光増感剤の脱落を効果的に防ぎ、¹O₂生成と拡散を促進できる。さらに、PDTの短距離効果と従来エレクトロスピニング法で調製されたファイバー膜の創傷表面への付着性不良（図4c、追加ファイル1: Fig. S6）を考慮すると、ファイバー膜と創傷表面の間隔により光線力学効果が影響を受ける。幸い、これらのクルクミン複合ナノファイバーは良好な形態（図1c）でインシチュエレクトロスピニング法により調製可能であり、様々な物体表面へ良好な付着性を示す（図4d）。これは、フォイル上に回収したファイバー膜を創傷表面に押し付ける従来紡糸法より、インシチュエレクトロスピニング堆積法で光線力学ファイバー膜を調製する方が好ましいことを意味する。

クルクミン複合ナノファイバーの二重抗菌効果

装置で調製したナノコンポジットファイバーはMTTアッセイで無毒性が証明された（追加ファイル1: Fig. S7）。さらに、ファイバーの優れた抗菌特性を証明するため、コロニー形成数法で複合ナノファイバーの抗菌特性を評価した。図5に示すように、純粋ファイバーに808 nm光を照射しても照射しなくても抗菌性はない（図5a, b）。これは808 nm光自体に殺菌効果がないことを示す。ファイバーにUCNPをドープしても細菌数は減少しないため、UCNPに殺菌効果がないことが確認される（図5a', b'）。興味深いことに、ファイバーにクルクミンをドープすると細菌数がある程度減少し、クルクミン自体に一定の抗菌活性があることが証明される（図5c, c'）。さらに、UCNPs@クルクミンドープファイバーにNIR光照射すると明確な殺菌結果が得られた（図5d', e'）。図3の結果と合わせ、UCNPs@クルクミンから808 nm照射下で生成される¹O₂が効果的に細菌を殺菌することを示す。一方、クルクミンの抗菌活性は808 nm光照射の有無で変わらない。これはクルクミン吸収が可視光域にあるため（図2b）、808 nm光が効果的でないためである。これがクルクミンをUCNP表面にコートするように設計した理由でもある。また、図5d, eはUCNPs@クルクミンを0.15 wt%と0.20 wt%でドープしたファイバーを示す。比較すると、0.20 wt%群が20分照射でより優れた殺菌特性を示し、抗菌効果は95%に達した。これは光増感剤クルクミンによる光線力学効果で生成される¹O₂が薬剤耐性菌を殺菌できるためである。この結果は図3の¹O₂結果とも整合する。これらのデータはさらに、UCNPs@クルクミンドープファイバーが二重抗菌活性、すなわちUCNPs@クルクミンドープファイバー自体とPDTによる抗菌活性を持ち、PDTの方がUCNPs@クルクミンドープファイバー単独より優れた抗菌効果を持つことを示している。さらに、大腸菌でも実験を行い、インシチュエレクトロスピニングクルクミン複合ナノファイバーが薬剤耐性菌に対して二重抗菌効果を持つことを確認した（追加ファイル1: Fig. S8）。また、MRSAのH&E染色によりナノファイバーの抗炎症効果をさらに検証した（追加ファイル1: Fig. S9）。異なる創傷感染処置後、ナノコンポジットファイバー非使用群では組織損傷と化膿性感染により多数の好中球（紫色と青色の細胞クラスター）が集積した。一方、ナノファイバー群では少量の肉芽組織と赤血球が出現し、ナノコンポジットファイバーの間接的な抗菌特性を反映し、創傷感染の炎症を抑制する効果がある。

結論

要約すると、自作携帯型エレクトロスピニング装置によるインシチュエレクトロスピニング法でコア-シェルクルクミン複合ナノファイバーを調製した。得られた複合ナノファイバーは従来調製法より様々な生体表面へ優れた付着性を示す。クルクミンサイズをまず大きくしてから濡れ性繊維へドープする手法は、光増感剤脱落を効果的に防ぎ、¹O₂生成と拡散を促進し、他の光線力学ナノ材料設計への示唆を与える。これらの複合ナノファイバーを薬剤耐性菌で汚染すると、二重抗菌挙動を示し効率的に殺菌する。優れた付着性を持つこれらの二重抗菌ナノファイバー膜は、止血と組み合わせて抗菌ドレッシングとして使用可能であり、屋外止血を可能にする。

データおよび材料の入手可能性

本研究中に生成および/または分析されたデータセットは、責任著者から妥当な要請があれば入手可能です。

略語

PDT

光線力学療法

¹O₂

一重項酸素

MRSA

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌

NIR

近赤外

UCNPs

アップコンバージョンナノ粒子

PVP

ポリビニルピロリドン

PCL

ポリカプロラクトン

PEI

ポリエチレンイミン

SOSG

一重項酸素センサーグリーン

FRET

蛍光共鳴エネルギー移転

PBS

リン酸緩衝液