ハイドロゲルの柔軟性を活用した3D耳軟骨形状コレクターへのコンフォーマル電気紡糸ナノファイバー被覆

要旨

電気紡糸は、ナノファイバーを生成し、それらをコレクター上に二次元ナノファイバーマットまたは三次元（3D）巨視的構造として堆積させる汎用的なプロセスです。しかし、突起、曲面、凹部を含む複雑な形状を持つ3D導電性コレクターでは、一般的にコンフォーマルな堆積が妨げられ、ナノファイバーによる不完全な被覆が生じます。本研究では、ハイドロゲル支援電気紡糸に基づき、3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクター上への電気紡糸ナノファイバーマットのコンフォーマルな製造を提案します。複雑な形状の影響を軽減するため、ハイドロゲルの柔軟性を利用して3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクターの突起部分を平坦化しました。数値シミュレーションの結果、この製造技術により、3Dコレクターの複雑な形状によって生じる不均一に集中した電界が大幅に減少し、標準偏差が70%以上軽減されることが示されました。さらに実験により、平坦化されたハイドロゲルコレクター上では、元のコレクターでは達成できなかった均一な厚さでナノファイバーマットがコンフォーマルに被覆されることが確認されました。本研究で確立された3D導電性コレクター上でのコンフォーマル電気紡糸技術は、組織工学、薬物/細胞送達、環境フィルター、衣類など、電気紡糸に関連する様々な研究に貢献するものです。

はじめに

電気紡糸は、ナノファイバーおよびそのアセンブリを製造する効果的かつ汎用的な技術であり、過去数十年にわたり広く研究されてきました。高い多孔性、高い表面積/体積比、細胞外マトリックス模倣構造といった独自の特性により、電気紡糸ナノファイバーとそのアセンブリは、衣類、環境フィルター、電池、組織工学用足場など、様々な研究分野から大きな関心を集めています。しかし、曲げ不安定性によるナノファイバーのカオス的な運動は、ナノファイバーアセンブリの正確な制御を妨げ、一般的にランダムに絡み合った2Dナノファイバーマットを形成します。近年の電気紡糸プロセスの進歩により、ナノファイバーアセンブリの範囲は2D平坦マットから3Dナノファイバー巨視的構造へと拡大しました。3Dテンプレート電気紡糸、ナノファイバーフィルム積層、遠心紡糸などの3Dナノファイバー足場製造技術により、中空管状形状、成形3D複雑形状、天然組織形状ナノファイバー足場など、様々な3Dナノファイバー巨視的構造が製造されています。これらの構造は、生体模倣ナノファイバー構造を持つだけでなく、天然組織の3D巨視的構造も模倣するため、特に組織工学において注目されています。

様々な3D電気紡糸技術の中でも、3D導電性コレクター上での電気紡糸は、後処理なしで電気紡糸ナノファイバーを3Dナノファイバー巨視的構造に組み立てる容易な方法を提供します。3D導電性コレクターの複雑な形状（大きな曲がりや凹形状）は、配向ナノファイバーマットやふわふわした3Dナノファイバー巨視的構造の生成を可能にします。しかし、同時にそうした複雑な形状は、コレクターの凹部へのナノファイバー堆積を妨げ、不完全な被覆を引き起こします。したがって、3D導電性コレクターの複雑な形状を3Dナノファイバーマットに高精度で複製することは非常に困難でした。不完全な被覆は、ろ過効率や機械的特性などの機能低下を招く可能性があるため、高複雑性の3D導電性コレクターの形状を3Dナノファイバー巨視的構造に高精度で複製する技術の開発が、電気紡糸ナノファイバーアセンブリの応用拡大に不可欠です。

本研究では、複雑な形状を持つ3D導電性コレクターの形状を複製するコンフォーマルな電気紡糸ナノファイバーマットの製造を提案します。代表例として、複雑な形状を持つ3D耳軟骨形状コレクターを選択しました。先行研究では、金属コレクターのように電界を生成するのに十分な移動イオンを持つハイドロゲルを、電気紡糸用の導電性コレクターとして提案しました。ここでは、ハイドロゲルコレクターの柔軟性を利用して、3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクター上に電気紡糸ナノファイバーをコンフォーマルかつ均一に堆積させます。金属コレクターとは異なり、ハイドロゲルコレクターは柔軟性により平坦化可能であり、それにより3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクターの全表面にナノファイバーを均一に堆積させる均一な電界を生成できます。さらに、ハイドロゲルの機械的強度は、適切なハイドロゲルを見つけることで天然組織のものに調整可能です。優れた生体適合性のため、アルギン酸とゼラチンをハイドロゲル材料として選択しました。これらを混合することで、天然耳軟骨に類似した機械的特性を得られます。3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクターの平坦化が、同コレクター上でのコンフォーマルなナノファイバーマット製造に与える影響を数値的に検討しました。最後に、ヘリックス、アンチヘリックス、スキャファ、アンチトラガスなど複数の位置でのナノファイバーマット厚さを測定し、コンフォーマル製造を確認しました。

材料と方法

材料

シラード184シリコーンエラストマーベース（PDMSモノマー）およびシラード184シリコーンエラストマー硬化剤をダウ・コーニング（米国）から購入。ポリ乳酸（PLA）フィラメントをスナップメーカー（米国）から入手。牛皮由来ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、塩化カルシウム二水和物（≥99%）、ポリε-カプロラクトン（PCL、Mw 80,000）、クロロホルム（≥99.5%）をシグマ・アルドリッチ（米国）から調製。脱イオン水およびメチルアルコール（≥99.5%）をサムチョン化学（韓国）から入手。すべての材料を追加精製なしで使用しました。

3D耳軟骨形状テンプレートのPDMSネガティブ金型の作製

寸法70（長さ）×20（幅）×1.1mm（厚さ）の3D耳軟骨形状テンプレートのCADファイルをTurbosquidウェブサイトから入手し、3ds Maxで修正。3Dプリンター（A150、スナップメーカー、米国）でテンプレートを造形。PDMSモノマーと硬化剤を10:1の比率で混合。未硬化PDMS混合物を5分間手動で均一に撹拌し、真空チャンバーで目視できる気泡がすべて消えるまで脱気。気泡消失後、混合物を使い捨て秤量皿に注ぎ、テンプレートを完全に浸漬。皿をオーブンに入れ、50℃で24時間硬化。硬化後、皿を半分に切断し、テンプレートを取り出してPDMSネガティブ金型を得ました。

アルギン酸-ゼラチンハイドロゲルの調製

異なる重量比（表1）のアルギン酸-ゼラチンハイドロゲルを4種類調製。ゼラチンを50℃の水に磁力撹拌（300rpm、1時間）で溶解。アルギン酸を加え、5分間手動で混合。ゲル溶液をPDMSネガティブ金型に注入。10% w/w塩化カルシウム溶液中で2時間イオン架橋。その後、ハイドロゲルを金型から取り出し、電気紡糸用の導電性コレクターとして使用しました。

アルギン酸-ゼラチンハイドロゲルの機械的試験

ASTM D638 Type IV試験片形状でハイドロゲルを調製し、万能試験機（QM100S、QMESYS、韓国）で引張試験を実施。一定変位速度10mm/minで実施し、応力-ひずみ曲線から弾性率と極限引張強度（UTS）を算出しました。

電気紡糸ナノファイバーマットのコンフォーマル製造

PCL（7.5wt%）をクロロホルム-メタノール（3:1）に溶解（6時間撹拌）。3mLプラスチックシリンジに充填し、シリンジポンプ（NE-1000、ニュー・エラ・ポンプ・システムズ、米国）で0.4mL/hの流量で23ゲージ金属針（内径0.6mm）から押出。アルギン酸-ゼラチンハイドロゲルコレクター（比率25:75、A25G75）をPMMA平坦基板上に置き、基板を針から20cm下方に配置。室温、湿度40-50%制御下で、針とコレクター間に19kVの高電圧（HV30、ナノNC、韓国）を印加して電気紡糸を実施。コフォーマルな堆積のため、ハイドロゲルコレクターの外側部分を平坦化。片面にナノファイバーマットを形成後、コレクターを裏返して反対面にも形成しました。

電気紡糸ナノファイバーマットの評価

走査型電子顕微鏡（SEM；Supra 25、カールツァイス、ドイツ）でナノ構造を観察し、ImageJでナノファイバー径を測定。厚さ測定のため、ナノファイバーマット付きハイドロゲルコレクターをPDMSモノマー/硬化剤混合物（10:1）に浸漬し、50℃で24時間硬化。PDMS埋め込みマットを断面切断し、顕微鏡（オリンパスBX53F2、日本）で断面画像を撮影して厚さを測定しました。

数値シミュレーション

COMSOL Multiphysics v5.0で針とコレクター間の電界をシミュレーション。銅、PLA、ハイドロゲルの3種類の耳軟骨形状モデルコレクターを使用。コレクターを2D断面形状に簡略化。金属グランド線をコレクターに接続。幾何学的パラメータは実験値：針-コレクター距離20cm、印加電圧19kV。ハイドロゲルコレクターは、間質液の空間電荷密度に基づきモデル化。移動イオンはボルツマン方程式で記述され、誘電率は70と設定。コレクターの凹部から10mm上方に10mmの基準線を引き、電界方向をプロットしました。

統計解析

MINITAB v17.1.0で一元配置分散分析（ANOVA）を実施。p<0.05を有意としました。

結果と考察

ハイドロゲル支援電気紡糸

図1は、3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクター上でのコンフォーマルナノファイバーマット製造工程を概略的に示しています。図1a：FDM式3Dプリンターでテンプレートを造形。3Dプリンターを用いるため、耳軟骨のような高度に複雑な形状にも自由に設計・変更可能。SLAやDLP式プリンターを採用すれば、光重合による高解像度構造も得られます。図1b：3Dプリントテンプレートで複製したPDMSネガティブ金型。図1c：PDMS金型で複製したアルギン酸-ゼラチンハイドロゲルコレクター。図1d：平坦化されたコレクター上でのコンフォーマルナノファイバーマット製造。コレクターを平坦基板上に置くと、耳軟骨の複雑な形状によりヘリックスが基板から浮き、ヘリックス、スキャファ、アンチヘリックス間に高さ差が生じます。一般的に、3D導電性コレクターの突起部分による高さ差が、コンフォーマル製造を妨げます。突起部分が大部分のナノファイバーを引き寄せ、低い部分への堆積を阻害するためです。これを軽減するため、ハイドロゲルの柔軟性を利用して突起部分を基板に平坦化。電気紡糸実施後、平坦化されたコレクターを元の耳軟骨形状に復元可能です。これは、平坦化がハイドロゲルの弾性変形領域内で行われ、ナノファイバーマットの厚さがコレクターに比べて無視できるほど薄いため、機械的特性への影響が無視できるからです。

アルギン酸-ゼラチンハイドロゲルの作製と機械的特性評価

図2a：PLAフィラメントで造形した3D耳軟骨形状テンプレート。PLAは十分な機械的特性と高融点（~130℃）を持ち、元の耳形状を維持したままPDMS成形に適しています。図2b：PDMSネガティブ金型。PDMSは、複雑な形状のハイドロゲルコレクターの脱型に必要な柔軟性があるため金型材料として選択。図2c：アルギン酸-ゼラチンハイドロゲルコレクター。ヘリックス、スキャファ、アンチヘリックスなど耳の複雑な構造が再現されています。機械的特性の幅広い選択肢を示すため、アルギン酸とゼラチンの異なる混合比で4種類の試験片を調製し引張試験を実施。図2d、e：応力-ひずみ曲線とヤング率。純ゼラチン（A0G100）が最も低い機械強度を示し、アルギン酸含有量増加に伴い線形的に強度上昇。ヤング率は0.04MPa（A0G100）から5.53MPa（A100G0）の範囲。A0G100は最低ヤング率（0.04±0.01MPa）で電気紡糸中に形状保持が困難。一方、A100G0は最高ヤング率（5.53±0.77MPa）で形状保持可能。A50G50（2.10±0.45MPa）とA25G75（1.35±0.03MPa）は中間的特性。特に、天然耳軟骨のヤング率範囲（1-2MPa、図2e灰色領域）内にあるA25G75を3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクターとして採用しました。

アルギン酸-ゼラチンハイドロゲルコレクター上でのナノファイバーマット形成

銅コレクター、PLAコレクター、アルギン酸-ゼラチンハイドロゲルコレクターの3タイプで電界の数値シミュレーションを実施し、ナノファイバー堆積挙動を調査。ナノファイバーの堆積は、帯電ナノファイバーと電界の相互作用で決まるため、電界シミュレーションで堆積を理解できます。PLAコレクターでは、電界の大部分がグランド線に集中し（補足図S1b）、コレクター表面への堆積が期待できません。一方、アルギン酸-ゼラチンハイドロゲルコレクターでは、銅コレクター（補足図S1a）と同様に、コレクター表面全体に電界が集中（補足図S1c）。これは、ハイドロゲルコレクターが移動イオンにより十分な導電性を持ち、金属コレクターのように均一な電界を生成するためです。PLAは誘電体であり、室温ではハイドロゲルより誘電率がはるかに低いため、電界がコレクター自体に集中せず、グランド線などにナノファイバーが堆積します。この結果は、PLAとハイドロゲルコレクターでの電気紡糸実験とナノファイバーマット厚さ比較で確認済み（補足図S1d）。PLAコレクターでは、グランド線とヘリックス部分に大部分のナノファイバーが堆積し、それ以外の場所ではマイクロメートルオーダー以下。ヘリックス部分の厚さは、PLAで3.09±0.37μm、ハイドロゲルで33.24±2.43μmであり、ハイドロゲルコレクターでは10倍以上厚く堆積。これは、ハイドロゲルコレクターが電界を十分に集められることを示し、電気紡糸時の効果的なコレクターであることを意味します。次に、ナノスケールファイバーが生成されるか確認。図3aにアルギン酸-ハイドロゲルコレクター上のナノファイバーマットを示します（コレクター表面への不完全被覆あり）。図3bは拡大SEM像。ナノスケール厚さとマイクロスケール長さの高アスペクト比ナノファイバーが確認され、気泡などの欠陥はなく、厚さ変動も有意差なし。平均径564±153nm、大部分が400-600nm範囲（図3c）。継続的なファイバー製造プロセスと見なせます。

図3aのように、元のコレクターでは、ヘリックスとアンチヘリックス間の凹部（スキャファ）でナノファイバーマットが完全に被覆されていません。ボイドスペースが存在し、ナノファイバーが傾斜ギャップ法で観察されるような配向構造で浮遊堆積しています。耳軟骨形状に限らず、3D導電性コレクターの突起や高曲率などの複雑形状は、一般的にコレクター表面への不完全被覆を引き起こします。

3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクター上でのコンフォーマル製造の数値シミュレーション

コンフォーマル製造のため、金属コレクターでは一般的に不可能なハイドロゲルコレクターの柔軟性を利用し、コレクター形状を変化させて高さ差を低減・平坦化しました。まず数値的に確認。図4a-(i)：電気紡糸プロセスの構成。ナノファイバーが凹部に堆積しにくいため、ヘリックスとアンチヘリックス間の凹部を2D断面でハイライト（図4a-(ii)）。ヘリックスは基板に対して約60°傾斜し、凹部を形成。この凹部を緩和するため、ハイドロゲルの柔軟性を利用してヘリックスを曲げ、角度を減らしました。曲げ角度0°、30°、60°のシミュレーション結果を図4b-(i)〜(iii)に示す。図4b-(iv)は基準線上の電界角度。平均角度は0°で79.56°、30°で79.39°、60°で77.26°で、バイアス角度は各ケースで有意な変動なし。これは凹部がコレクターの左側にあるため。一方、電界角度の偏差は、0°で8.23°、60°で2.36°となり、60°曲げにより0°ケースから70%以上軽減されました。0°での大きな偏差は、突出したヘリックスへの電界集中によるもので、ナノファイバーがヘリックスに集中堆積し、コンフォーマル製造を妨げます。ヘリックス曲げによる偏差軽減は、こうした電界集中を緩和し、コンフォーマル堆積を可能にすると期待されます。

3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクター上でのコンフォーマル製造

シミュレーション結果に基づき、ハイドロゲルコレクターを平坦化してコンフォーマル製造を実現。ヘリックスと外側部分を金属治具で平坦化（補足図S2b）。ナノファイバー被覆ハイドロゲルコレクターは、ハイドロゲルの弾性変形領域で変形させたため、元の形状に復元可能。ナノファイバーマットの厚さがコレクターに比べて無視できるほど薄いため、機械的特性への影響は無視できます。元のコレクターと平坦化コレクターで電気紡糸を実施。断面像を図5a-(i)、(ii)に示す。元のコレクターでは、ナノファイバーがヘリックスとアンチヘリックス間で浮遊し、スキャファに堆積していません。平坦化コレクターでは、ヘリックス、スキャファ、アンチヘリックス全体をナノファイバーマットが完全被覆。特に、平坦化なしでは不可能だったヘリックスとアンチヘリックス間の凹部への堆積が可能になりました。図5bに劇的な厚さの差を示す。元のコレクターでは凹部での堆積が遅延し、平坦化コレクターでは十分な量のナノファイバーが凹部に引き寄せられます。これにより、ヘリックスやアンチヘリックスなどの複雑形状を持つコレクター上でも、平坦化によりコンフォーマルな堆積が可能になります。

最後に、平坦化コレクター上のナノファイバーマットの均一性を確認（図6）。図6a：元のコレクターではボイドが見られたのに対し、平坦化コレクターでは全体をボイドなしで被覆。図6b：ヘリックス（54.58±3.99μm）、アンチヘリックス（55.40±1.17μm）、アンチトラガス（53.05±1.39μm）、スキャファ（51.49±1.24μm）での厚さ。元のコレクターではスキャファに堆積しなかった場所でも均一な厚さで堆積。前回のハイドロゲル支援電気紡糸研究の結果に基づき、ハイドロゲルコレクターを活用することで、製造される3Dコンフォーマルナノファイバーマットの厚さ制御も可能と確信。将来的には、このナノファイバーマットを持つ3D耳軟骨形状ハイドロゲルが、天然耳軟骨と類似の機械的特性と生体模倣ナノ構造を持つため、人工耳軟骨インプラントへの応用が期待されます。組織工学利用を考えると、ナノファイバーマットの残留電荷が細胞挙動に影響を与える可能性を無視できません。本コンフォーマル製造技術は、3Dナノファイバーメンブレン製造の先駆的研究であり、3D天然組織模倣足場や効率的ろ過用3D多孔質メンブレンなど、新しいタイプのナノファイバーアセンブリの幅広い応用を示唆しています。

結論

本研究では、凹部を持つ3D耳軟骨形状ハイドロゲルコレクター上での電気紡糸ナノファイバーマットのコンフォーマル製造を開発しました。その結果、コレクターの形状が完全に複製されたナノファイバーマットが得られました。最も重要なのは、ハイドロゲルコレクターの柔軟性を利用して凹部を調整することで、従来の電気紡糸では被覆できなかったコレクター全表面に、均一な厚さでコンフォーマルにナノファイバーマットが堆積したことです。このコンフォーマル製造技術は、様々なハイドロゲル材料と互換性があるため、組織工学、薬物/細胞送達、衣類、電池など、様々な分野でのコンフォーマルナノファイバーマット製造により汎用的かつ効果的な技術となり得ます。

データと材料の入手可能性

本論文の結論を支持するすべてのデータは、本論文および補足資料に含まれています。

略語

3D:

三次元

PDMS:

ポリジメチルシロキサン

PLA:

ポリ乳酸

PCL:

ポリε-カプロラクトン

PMMA:

ポリメチルメタクリレート

SEM:

走査型電子顕微鏡

FDM:

熱溶解積層法

SLA:

光造形法

DLP:

デジタルライトプロセッシング

A100G0:

純アルギン酸

A0G100:

純ゼラチン

A50G50:

アルギン酸/ゼラチン=50:50

A25G75:

アルギン酸/ゼラチン=25:75