マウスにおける二酸化チタンナノ粒子の潜在的な肝臓、脳、および胚の毒性

背景

ナノスケール二酸化チタン（nano-TiO ₂ ）食品業界で広く使用されています。コーティングされたキャンディー、保存された果物、チューインガム、炭酸飲料、粉末飲料（無糖剤形または濃縮）、牛乳および乳製品、およびその他の食品カテゴリーの製造に使用されてきました[1、2]。ナノTiO ₂ の濃度 食品中の含有量は0.5〜9 g / kgに達し[1、3]、ナノTiO2を含まないと主張されている多くの食品にはナノTiO2が含まれています[2]。 Nano-TiO ₂ また、生物医学、有機汚染物質処理、材料工学、化粧品にも広く使用されています[4、5、6]。ただし、nano-TiO ₂ の安全性 露出は不明なままです。

研究によると、ナノTiO ₂ 腹腔を介した投与や吸入などのいくつかの方法で体内に入った後、複数の臓器で濃縮されて毒性になる可能性があります[7、8]。 Nano-TiO ₂ ヒトリンパ芽球様細胞や肝細胞癌細胞など、いくつかの種類の細胞に毒性がある可能性があります[9、10]。それは、マウスの脳のグリア細胞に急性ストレス反応を誘発し、ニューロンの損傷と機能不全を引き起こす可能性があります[11]。ナノTiO ₂ に曝露されたニューロン細胞株の生存率 粒子は、典型的な時間および用量依存的に大幅に減少します[12]。

研究により、これらのナノ粒子が毒性を引き起こすいくつかのメカニズムが明らかになりました。 Nano-TiO ₂ 粒子は、分子複合体の構造と細胞膜の透過性を変化させることにより、遺伝毒性を引き起こす可能性があります[13、14、15]。 Nano-TiO ₂ 酸化ストレスを引き起こす可能性があります。酸化ストレスの間に、ヒドロキシルラジカルなどの活性酸素種（ROS）が生成され、DNA酸化を引き起こし、8-OHGを生成し、DNA複製のエラーと突然変異を引き起こします[16、17]。さらに、ROSは炎症を誘発し、酸化ストレスと炎症の間の相互フィードフォワード相互作用を引き起こし、DNA損傷と細胞アポトーシスを引き起こす可能性があります[18、19]。ただし、ナノTiO ₂ の毒性に関する包括的な体系的データ 制限されたままです。私たちの目的は、nano-TiO ₂ の効果と根本的なメカニズムを明らかにすることでした。 人間の健康への暴露。

この研究では、nano-TiO ₂ の効果と根本的なメカニズムを評価しました。 マウスモデルを使用した曝露。私たちの調査結果は、ナノTiO ₂ 酸化還元の不均衡や遺伝子発現の障害を引き起こすことにより、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺、脳などのいくつかの臓器に濃縮され、毒性を引き起こす可能性があります。これはまた、胚の発達に損傷を与える可能性があります。私たちの研究は、ナノTiO ₂ の人の健康に対する潜在的なリスクを評価するためのデータを提供する可能性があります 露出。

メソッド

化学薬品および試薬

マイクロスケールのTiO ₂ （マイクロTiO ₂ ）および5nmのTiO ₂ アナターゼの形で、Sigma-Aldrich（上海、中国）から購入し、10、60、および90nmのTiO ₂ （アナターゼ）はRun He Ltd.（上海、中国）から購入しました。ホルムアルデヒド、硝酸、過酸化水素、およびヘパリンナトリウムは試薬グレードであり、Sigma-Aldrich（上海、中国）から購入しました。リン酸緩衝液（PBS）、ペニシリン、およびストレプトマイシンは、Gibco（San Diego、USA）から購入しました。 Total RNA抽出キットは、Takara（Dalian、China）から購入しました。活性酸素種アッセイキットは、Jianchen Ltd.（Nanjing、China）から購入しました。ストックTiO ₂ ハンクス溶液中の懸濁液（1％）を121°Cで30分間滅菌しました。懸濁液を超音波処理し、使用直前に目的の濃度に希釈しました。

動物とモデル

肝臓と脳の毒性の研究のために、ICR（刷り込み制御領域）マウス（22±3 g、半分のオスと半分のメス）を中国医薬大学の動物センターから購入しました。動物を含むすべての実験手順は、天津科学技術大学の倫理委員会によって事前に承認されており、実験動物の世話と使用に関する国際ガイドラインに従って実施されました。マウス胚毒性の研究のために、ICRマウス（雌45匹、20〜35 g、雄15匹、35〜40 g）をBeijing Weitong Lihua Ltd.（北京、中国）から購入しました。すべてのマウスは健康で性的に成熟していた。治療の5日前に、換気が良く、12時間の明暗サイクル、20±2°C、相対湿度60±10％、餌と水を自由に摂取できる家の別々のケージでマウスを飼育しました。

投与計画1は、一般的な毒性および脳毒性試験のために設計されました。マウスをランダムに6つのグループと追加のコントロールグループに分け、10匹のマウス/グループを使用しました。ナノスケールのTiO ₂ （ナノTiO ₂ ）懸濁液を1日1回、14日間注射しました（腹腔内（i.p。）、5、10、50、100、150、および200 mg / kg）。生理食塩水を対照群のマウスに注射した。マウスは毎日観察され、研究中に死亡した動物はいなかった。 15日目に、眼窩洞から血液サンプルを採取した。すべてのマウスの体重を個別に測定し、2％フェノバルビタール（60 ml / kg、i.p。）で麻酔をかけた後、頸椎脱臼により犠牲にしました。すべての組織サンプルが収集され（皮質と海馬から分離された脳組織）、-80°Cで保存されました。各心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓は、2つの部分に切断されました。病理学的検査のために、一部を4°Cのホルマリン（10％）溶液に浸しました。残りの部分は、チタン含有量を測定するために-20°Cで保管されました。

投与計画2は、肝毒性試験用に設計されました。マウスを3つの実験群と1つの対照群に分けた。 Nano-TiO ₂ （5、10、50 mg / kg）を1日1回、強制経口投与により60日間投与しました。対照群のマウスは、0.5％CMC（カルボキシメチルセルロース）を投与されました。マウスは毎日観察され、研究中に死亡した動物はいなかった。 60日目に、マウスを2％フェノバルビタール（60 ml / kg、ip）で麻酔し、頸椎脱臼により犠牲にし、肝臓を直ちに収集し、電子顕微鏡、ROSの測定、脂質酸化を使用した検査のために処理しました。 、および遺伝子発現の分析。

標的組織中のチタン含有量の測定

0.1〜0.5 gの凍結組織サンプルを切り取り、室温で解凍した後、HNO ₃ で消化しました。 （0.5 mL）およびH ₂ O ₂ （0.5 mL）160°Cで。 3％硝酸で3 mLに希釈した後、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）を使用して溶液中のチタンの濃度を測定しました。次に、標的組織のチタン含有量を計算しました。

血液生化学検査と臓器/体重比の計算

血清サンプル中の酵素のレベルは、自動生化学分析装置（TBA-2000FR、東芝、東京、日本）によって分析されました。これらの酵素は、肝臓と腎臓の機能に関連するバイオマーカーです。

臓器/体重比は、臓器と体の重量に基づいて計算されました。麻酔と犠牲の前に体重を測定した。麻酔をかけ、犠牲にしたマウスから分離した後、臓器の重量を測定しました。

病理検査および透過型電子顕微鏡

ホルマリンに浸した肝臓または脳組織の病理学的検査は、ヘマトキシリン染色後に光学顕微鏡下で行った。透過型電子顕微鏡（TEM）の場合、肝臓組織をエポキシ樹脂EPON 812に包埋し、グルタルアルデヒドとオスミン酸で固定した後、500μM未満の薄さの切片に切断しました。切片を飽和酢酸ウラン溶液（pH 3.5）とクエン酸鉛（pH 12）で1〜2時間染色しました。染色された切片はTEMを使用して検査されました。

活性酸素種のレベル、それらの代謝酵素の活性、および神経伝達物質のレベルの決定

肝臓組織の場合、スーパーオキシドアニオン（O ₂ ^– ）レベルはXTTを使用して決定されました。カタラーゼ（CAT）の活性は、公開されている手順[20]に従って、240nmでのOD値を使用して決定されました。脂質過酸化のレベルは、公開されている手順[21]に従ってマロンジアルデヒド（MDA）の含有量によって決定されました。

分離後、脳組織を予冷した1％ポリビニルポリピロリドン溶液（pH 7.6PBS中50mM）でホモジナイズしました。 15,000 rpmで20分間遠心分離した後、上清を収集し（Eppendorf 5418、ハンブルク、ドイツ）、スーパーオキシド酵素（SOD）、CAT、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（APX）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（GSHPx）の活性のその後の分析に使用しました。 SOD活性は、NBT（ニトロテトラゾリウムクロライドブルーテスト）を使用して決定されました。カタラーゼ活性は、キット（CATアッセイキット、A007-2、南京江城生物工学研究所、南京、中国）を使用して決定されました。 APXの活性は、キット（APXアッセイキット、A123、南京江城生物工学研究所、南京、中国）を使用して測定しました。 GSHPx活性は、キット（GSHPxアッセイキット、A005、南京江城生物工学研究所、南京、中国）を使用して決定しました。構成的一酸化窒素シンターゼ（cNOS）、誘導型一酸化窒素シンターゼ（iNOS）、およびアセチルコリンエステラーゼ（AChe）の活性は、市販のキット（ACheアッセイキット、A024、南京江城生物工学研究所、南京、中国）を使用して決定されました。

脳組織のROSのレベルは、脳組織ホモジネート中の最終濃度が10μMになるように2 '、7'ジクロロフルオレセインジアセテートを添加し、37°C​​で30分間インキュベートすることによって決定されました。次に、組織をフローサイトメトリーを使用して分析しました。

相対的なmRNAレベルの決定

全RNAは、市販のキット（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、9767、Takara、Dalian、China）を使用して肝臓組織サンプルから抽出しました。相補的DNAは、ランダムプライマーによる逆転写を使用して合成されました。 SOD、CAT、GSHPx、MT、HSP70、CYPA、P53、GST、およびTFの相対mRNAレベルは、リアルタイム定量PCR（qPCR）キット（OneStepSYBR®PrimeScript™RT-PCRキット、PR066A、タカラ、大連、中国）。すべてのプライマー（表1）は、Shanghai SangonLtdから合成および購入しました。

Ex VivoEmbryo毒性テスト

子宮頸部脱臼後、雌マウスから8。5胚日の胚を分離し、ラットの即時遠心分離血清（ICS）3mLを含む50.0mLハンク溶液で培養しました。micro-TiO ₂ 、またはnano-TiO ₂ （0.0、50.0、100.0、および200.0μg/ mL）各ボトルに3つの胚を48時間入れます。

micro-TiO ₂ の効果を判断するには またはnano-TiO ₂ 胚への曝露時間、胚は、ラットからの3 mLICS、マイクロTiO ₂ を含む50.0mLハンクス溶液で培養されました。 、またはnano-TiO ₂ （200.0μg/ mL）各ボトルに3つの胚を入れて、16、26、および48時間、次に予熱した37°Cのハンクス溶液で48時間洗浄し、3 mLのICSを含む50.0mLのハンクス溶液で培養しました。ラット。

胚発生は、Maele-FabryVanスコアを使用して評価されました[22]。卵黄嚢の直径、胚の頭殿長、頭の長さ、および体の切片の数を解剖顕微鏡で調べた。発生中の胚の奇形率は、前脳、中脳、後脳、前肢芽、後肢芽、聴覚および視覚系、および心臓の形態学的変化のスコアに基づいて評価されました。胚の10。5日目に2匹のICRマウスから10個以上の胚が対照のために分離されました。

統計分析

SPSS 13（IBM、イリノイ、米国）を使用してデータを分析しました。治療群と対照群の違いは、ダネットの t を使用して分析されました。 テスト。グループ間の差異は、ANOVAを使用して分析されました。複数のサンプルのうちの2つ間の比較は、LSDおよびSNKテストを使用して分析されました。カテゴリデータは、カイ二乗検定と順位和検定を使用して分析されました。 P の場合 <0.05、差は有意であると見なされました。

結果

ナノスケールの二酸化チタン曝露後のマウスにおけるチタンの組織分布

マウスをnano-TiO ₂ で処理しました （i.p.、5、10、50、100、150、および200 mg / kg）14日間、マウスの臓器のチタン含有量を測定しました。その結果、さまざまな用量のナノTiO ₂ で処理されたマウスの臓器にチタンが蓄積していることが明らかになりました。 （図1）。蓄積の大きさは用量依存的でした（図1）。肝臓はチタンが最も濃縮された器官であり、腎臓がそれに続きました。チタンの蓄積量は、脾臓、肺、脳、心臓でほぼ同じでした（図1）。結果は、ナノTiO ₂ GIトラックを介して吸収され、循環器系を介して組織に分配され、肝臓、腎臓、脾臓、肺、脳、心臓の臓器に沈着します。

チタンは、ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの臓器に蓄積されました。 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 1日1回14日間、腹腔内注射で示される懸濁液または生理食塩水。 *コントロールと比較して、 P <0.05、＃コントロールと比較、 P <0.01

マウスにおけるナノスケール二酸化チタンの一般的な毒性

異なる用量のナノTiO ₂ でマウスを治療しました 14日間、異なる用量で治療されたマウスのグループ間で体重増加に差がないことがわかりました（データは示していません）。低用量のナノTiO ₂ （5および10 mg / kg）は、腹腔内投与後のマウスの肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、および脳の臓器/体重比を変化させませんでした。 14日間の曝露（図2）。ただし、高用量のナノTiO ₂ （50、100、150、200 mg / kg）は、肝臓、腎臓、脾臓、心臓の臓器/体重比を有意に増加させ、マウスの肺と脳の臓器/体重比を用量依存的に減少させました（図2 。

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ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの臓器/体重の比率 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 1日1回14日間、腹腔内注射で示される懸濁液または生理食塩水。 *コントロールと比較して、 P <0.05; ＃コントロールと比較して、 P <0.01

低用量（5、10、50、および100 mg / kg）のナノTiO ₂ 血液生化学指数は変化しませんでした（図3）。高用量のナノTiO ₂ （150〜200 mg / kg）上昇した肝機能バイオマーカーアルカリホスファターゼ（ALP）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アルブミン（ALB）、ロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）、ブチリルコリンエステラーゼ（PChe）、総ビリルビン（TBIL）、および総タンパク質（ TP）レベル（図3）。高用量は、腎機能のバイオマーカーである血清尿酸（UA）および血中尿素窒素（BUN）レベルを低下させました。それらは、心筋障害の指標である血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、クレアチンキナーゼ（CK）、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、およびアルファヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（HBDH）レベルを増加させました（図3）。

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ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの血液生化学指数 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 1日1回14日間、腹腔内注射で示される懸濁液または生理食塩水。 *コントロールと比較して、 P <0.05; ＃コントロールと比較して、 P <0.01。 a 肝機能バイオマーカーの生化学指標。 b 腎機能バイオマーカーの生化学指標。 c 心筋障害バイオマーカーの生化学指数

これらの結果は、高用量のTiO ₂ 肝臓、腎臓、心臓、その他の臓器に用量依存的に深刻な損傷を与える可能性があります。

Nano-TiOの肝臓毒性 ₂ マウスで

さらに、ナノTiO ₂ の肝毒性を評価しました。 。光学顕微鏡を使用して、低用量（i.p. 14日間、5 mg / kg）のナノTiO ₂ に曝露されたマウスの肝臓に有意な変化がないことを発見しました。 （図4a、b）。顕著な血管閉塞と拡張（図4c、50 mg / kg）、好塩基球の増加（図4d、100 mg / kg）、肝臓の部分的虚血（図4e、150 mg / kg）、および閉塞が観察されました。ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの中心静脈（図4f、200 mg / kg）の （i.p。）。

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nano-TiO ₂ で処理されたマウスの肝臓の組織学 ナノTiO ₂ にさらされる 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 1日1回14日間、腹腔内注射で示される懸濁液または生理食塩水。 a コントロール。 b TiO ₂ 、5 mg / kg。 c TiO ₂ 、50 mg / kg。 d TiO ₂ 、100 mg / kg。 e TiO ₂ 、150 mg / kg。 f TiO ₂ 、200 mg / kg

しかし、TEMを使用すると、肝細胞のミトコンドリアがわずかに腫れ、低用量のナノTiO ₂ に曝露されたマウスの肝臓組織に凝縮したクロマチンとアポトーシス細胞が存在することがわかりました。 （60日間の強制経口投与、5 mg / kg）（図5a、b）。ナノTiO ₂ を観察しました 肝細胞のミトコンドリア、腫れているミトコンドリア、および10 mg / kgのナノTiO ₂ で処理されたマウスの肝細胞のミトコンドリアの液胞 （60日間の強制経口投与、図5c）。さらに、50 mg / kgのナノTiO ₂ で処理したマウスの肝細胞で、核小体の崩壊、クロマチンの散乱、明らかなアポトーシス、および/またはアポトーシス小体を観察しました。 （60日間の強制経口投与、図5d）。結果は、ナノTiO ₂ 細胞内および細胞レベルで肝細胞に病理学的損傷を引き起こす可能性があります。

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ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの肝細胞の超微細構造 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 60日間、1日1回の強制経口投与で示されます。対照群のマウスは、0.5％CMC（カルボキシメチルセルロース）を投与されました。 a コントロール（×8000）。 b TiO ₂ （5 mg / kg）（×8000）。 c TiO ₂ （10 mg / kg）（×10,000）。矢印はミトコンドリアとミトコンドリアの液胞を示しています。 d TiO ₂ （50 mg / kg）（×10,000）

5 mg / kgのナノTiO ₂ によるマウスの治療 60日間、O ^2- などのROSのレベルは変化しませんでした 、H ₂ O ₂ 、一酸化窒素（NO）、およびMDA（図6）、または肝臓組織におけるSOD、CAT、GSHPx、MT、GST、HSP70、P53、およびTF遺伝子のmRNAレベル（図7）。 10または50mg / kgのナノTiO ₂ によるマウスの治療 60日間、O ^2- のレベルが大幅に上昇しました。 、H ₂ O ₂ 、NO、およびMDA（図6）は、SOD、CAT、MT、GST、HSP70、P53、TF、およびGSHPx遺伝子のmRNAレベルを低下させ、マウスの肝臓におけるCYP1A遺伝子のmRNAレベルを上昇させます（図6）。図7）。結果は、高用量のナノTiO ₂ 曝露されたマウスの肝臓における酸化ストレスと保護遺伝子の発現の変化を誘発しました。

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ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの肝臓におけるROS産生率と脂質過酸化レベル 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 60日間、1日1回の強制経口投与で示されます。対照群のマウスは、0.5％CMC（カルボキシメチルセルロース）を投与されました。 *コントロールと比較して、 P <0.05、総タンパク質に正規化

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ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの肝臓における遺伝子の相対的発現レベル 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 60日間、1日1回の強制経口投与で示されます。対照群のマウスは、0.5％CMC（カルボキシメチルセルロース）を投与されました。 *コントロールと比較して、 P <0.05; ＃コントロールと比較して、 P <0.01、β-アクチンに正規化

マウスにおけるナノスケール二酸化チタンの脳毒性

さらに、ナノTiO ₂ の脳毒性を評価しました。 。最初に、ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの脳/体重の比率を調べました。 （i.p. 14日間）。低用量（5、10、50 mg / kg）は脳/体重の比率を変化させず、高用量（100、150、200 mg / kg）は用量依存的に脳/体重の比率を大幅に減少させましたマナー（図2）。脳組織中のTi濃度は、用量依存的に有意に増加しました（図1）。

また、ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの脳の組織学的変化を調べました。 （i.p. 14日間）ヘマトキシリン染色を使用します。低用量のナノTiO ₂ （50 mg / kg）は、腹腔内投与後のマウスの脳組織の組織像を変化させませんでした。 14日間の曝露（図8a、b）。 100 mg / kgのナノTiO ₂ によるマウスの治療 その結果、脳組織の神経細胞が破裂し、ひび割れました（図8c）。 150 mg / kgのナノTiO ₂ によるマウスの治療 その結果、脳組織に炎症細胞が侵入しました（図8d）。結果は、高用量のナノTiO ₂ 脳組織に形態学的損傷を引き起こし、炎症反応を引き起こす可能性があります。

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ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの脳組織の病理学的変化 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 1日1回14日間、腹腔内注射で示される懸濁液または生理食塩水。 a コントロール。 b 50 mg / kg。 c 150 mg / kg。 d 200 mg / kg

nano-TiO ₂ の効果を測定しました ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの脳組織における酸化還元状態とシグナル分子に関する研究 （i.p. 14日間）。低用量（5 mg / kg）のナノTiO ₂ O ^2- は変更されませんでした 、H ₂ O ₂ およびMDAレベルは、抗酸化酵素APX、CAT、GSHPx、およびSODの活性、または非酵素的抗酸化剤ASA / DASAおよびGSH / GSSGのレベルを変更しませんでした。また、脳組織における一酸化窒素合成酵素（NOS）活性とNOレベルも変化しませんでした（図9および10）。高用量のナノTiO ₂ 増加したO ^2- 、H ₂ O ₂ 、およびMDAレベルは、抗酸化酵素APX、CAT、GSHPx、およびSODの活性を低下させ、非酵素的抗酸化剤ASA / DASAおよびGSH / GSSGのレベルを低下させ、NOのレベルおよびNOSの活性を上昇させ、脳組織のAchEと血糖値（GLU）のレベル（図9と10）。これらの結果は、ナノTiO ₂ 腹腔内投与後、マウスの脳に損傷を与える可能性があります。露出。

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ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの脳のASA / DASAおよびGSH / GSSG比 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 1日1回14日間、腹腔内注射で示される懸濁液または生理食塩水

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ナノTiO ₂ に曝露されたマウスの脳におけるROS、抗酸化酵素、NOシグナル伝達、グルタミン酸、およびAchE活性の変化 。マウスをナノTiO ₂ で処理した 1日1回14日間、腹腔内注射で示される懸濁液または生理食塩水。 N =10、*コントロールと比較して、 P <0.05; ＃コントロールと比較して、 P <0.01。 a ナノTiO2に曝露されたマウスの脳におけるROS（O2-、H2O2、およびMDA）の変化。 b ナノTiO2に曝露されたマウスの脳における抗酸化酵素（SOD、CAT、APX、およびGSHPx）の変化。 c ナノTiO2に曝露されたマウスの脳におけるNOシグナル伝達成分（cNOS、iNOS、およびNO）の変化。 d ナノTiO2に曝露されたマウスの脳におけるグルタミン酸含有量とAchE活性の変化

Nano-TiO ₂ の毒性効果 Ex Vivo Mouse Embryos

ナノTiO ₂ の発生毒性を評価する 、最初に、invivo胚とexvivo胚の成長と発達を比較しました。結果は、exvivo胚の成長と発達がinvivo胚のものと類似していることを示しました（データは示していません）。したがって、ex vivo胚を使用して、ナノTiO ₂ の毒性作用を研究しました。 胚について。

さまざまな用量（最終濃度0.0、50.0、100.0、および200.0μg/ mL）とマイクロTiO ₂ のさまざまな曝露時間の影響を調査しました。 / nano-TiO ₂ 胚のVXY直径、頭殿長、頭の長さ、および体の切片の数を調べることにより、胚の成長と発達、および組織と器官の形態について調べます。結果は、マイクロTiO ₂ これらの指標はどの用量でも変化しませんでした（表2）。

さまざまなサイズのナノTiO ₂ 、5〜10 nm、60 nm、90nmの胚を50.0μg/ mLのTiO ₂ で処理 胚のVXY直径、頭殿長、頭長、および体の切片数には影響しませんでした（表2）。高用量（100.0および200.0μg/ mL）では、VXYの直径、頭殿長、頭の長さ、体の切片の数が減少し、奇形率が増加しました（表2）。同じ用量で、異なるサイズのナノTiO ₂ で処理されたグループ間に明らかな違いはありませんでした。 、50.0、または100μg/ mL。 200μg/ mLのナノTiO ₂ による胚の処理 nano-TiO ₂ のサイズが大きくなると、VXYの直径、頭殿長、頭の長さ、およびマウス胚の体の切片の数が大幅に減少しました。 粒子（表2）。

マイクロTiO ₂ によるマウス胚の処理 （200.0μg/ mL）16、24、および48時間の間、VXYの直径、頭殿長、頭の長さ、および体の切片の数は変化しませんでした（表3）。ナノTiO ₂ によるマウス胚の処理 （5〜10nmおよび60nm、90 nm、200.0μg/ mL）16時間でも、VXYの直径、頭殿長、頭の長さ、および体の切片の数は変化しませんでした（表3）。ただし、nano-TiO ₂ によるマウス胚の処理 （5〜10nmおよび60nm、90 nm、200.0μg/ mL）24時間および48時間で、VXY直径、頭殿長、頭の長さ、体の切片の数が減少し、奇形率が増加しました（表3）。同じ曝露時間で、異なるサイズのナノTiO ₂ のグループ間で、VXY直径、頭殿長、頭の長さ、体の切片の数、または奇形率に差はありませんでした。 粒子（表3）。

In summary, these results indicate that nano-TiO₂ had toxic effects on the growth and development of mouse embryos in dose-dependent and time-dependent manners. The sizes of the nano-TiO₂ particles may affect toxicity with a trend of increasing toxicity associated with larger nano-TiO₂ particles.

Discussion

Nano-TiO₂ has been widely used in industry and medicine. However, the safety of nano-TiO₂ exposure remains unclear. In the present study, we investigated the potential toxicity of nano-TiO₂ , using mice models. We find that nano-TiO₂ accumulates in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after exposure (i.p. injection) in a dose-dependent manner. High doses of nano-TiO₂ significantly increase the organ/body weight ratios of the liver, kidney, spleen, and heart, and decrease those of the lung and brain in a dose-dependent manner. Moreover, high doses of nano-TiO₂ significantly increase the levels of ALT, ALP, LAP, PChE, TP, ALB, and TBIL, which are indices for liver function. They decrease the levels of UA and BUN, which are renal function indicators. Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO₂ do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO₂ may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.

In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO₂ 。 We find that high doses of nano-TiO₂ may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO₂ , we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO₂ in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO₂ generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO₂ can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO₂ liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.

In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO₂ 。 We find that high doses of nano-TiO₂ can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe₂ O ₃ nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO₂ on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO₂ may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.

We find that the micro-TiO₂ and low doses of nano-TiO₂ (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO₂ (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO₂ in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO₂ does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO₂ 。 This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO₂ , for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO₂ may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO₂ concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO₂ is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO₂ particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles (Table 2).

In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO₂ 。 This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO₂ is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO₂ in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO₂ can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO₂ can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO₂ 。 Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO₂ 。

Conclusions

Ingested nano-TiO₂ can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO₂ causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO₂ has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO₂ particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO₂ exposure on human health.

略語

ALB:

Albumin

ALP:

Alkaline phosphatase

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartate aminotransferase

BUN:

Blood urea nitrogen

CK:

Creatine kinase

cNOS:

Constitutive nitric oxide synthases

HBDH:

Hydroxybutyrate dehydrogenase

ICR:

Imprinting control region

iNOS:

Inducible NOS

LAP:

Qleucine aminopeptidase

LDH:

Lactate dehydrogenase

Nano-TiO₂ ：

Nanoscale titanium dioxide

PChe:

Butyrylcholinesterase

ROS:

活性酸素種

TBIL:

Total bilirubin

TP：

Total protein

UA:

Uric acid