invitroおよびinvivoでのグラフェンおよび酸化グラフェンのバイオセーフティおよび抗菌能力

背景

近年、外科用インプラントは骨折やその他の病気の治療に広く使用されていますが、拒絶反応や感染を防ぐために、優れたバイオセーフティと抗菌特性の両方が必要です。実際、感染性骨欠損の整形外科治療は依然として大きな問題です。バクテリアの面では、黄色ブドウ球菌 整形外科および整形外科インプラントで最も一般的な病原体です[1]。骨の欠損や感染症[2]のため、治療は困難であり、患者さんの治癒には長い時間がかかります。傷が治らない場合、最後の治療は手足の切断です[3、4]。

感染性骨欠損の適切な治療は、感染管理と骨欠損修復要求の再構築の両方を同時に満たす必要があります。骨組織工学の発展に伴い、整形外科治療の分野で使用される生体材料の用途が増えています。したがって、骨の感染の治癒率を大幅に改善することができます。これらの材料には、主に不均一な骨[5]、バイオセラミック[6]（ヒドロキシアパタイト[7]、リン酸カルシウム[8]など）、ポリマー[9、10]、タンパク質材料（コラーゲン繊維[11]など）、等々。これらの資料に加えて、Beatriz Pelaz etal。インプラントにおけるナノテクノロジーの重要性と有望な展望を明らかにした[12]。これらのナノ粒子の中で、グラフェンとその誘導体は、骨修復の要件を満たす他の新しい材料です。

グラフェンは2次元であり、ハニカム構造に単層または数層の炭素原子があります[13、14、15]。物性に優れているため、複合材料[16、17]、センサー[18、19]、エネルギー[16、20]などの分野で広く使用されています。酸化グラフェンは、酸素とその酸化グラフェンの形態を含むベース表面活性基の二次元無限延長に接続された炭素原子の層にある表面官能化グラフェン材料です[21]。グラフェン（G）とその誘導体は、その独特の2次元構造、および特定の物理的および化学的特性により、生物医学分野で大きな懸念を引き起こしています[22]。機能化されたグラフェンとその誘導体には、薬物負荷[23]、抗菌[24]、バイオイメージング[25、26]、癌治療[27]などの多くの機能があります。

抗菌能力の面で、Li等。 Gの抗菌メカニズムは主に電荷移動[28]と細菌の移動によって引き起こされることが明らかになりました。バクテリアは鋭いナノシートの表面に移動し、鋭いエッジでバクテリアを裂きます[29]。さらに、Tu etal。また、Gが細胞に浸透し、細胞膜から大量のリン脂質を抽出する可能性のある別の潜在的な抗菌メカニズムを示しました[30]。したがって、Gと酸化グラフェン（GO）は生物活性と抗菌能力を備えており、骨修復材料としての資格を得る要件を満たしています。

ただし、大規模な生産とアプリケーションでは、グラフェンのバイオセーフティの問題が特に重要です。労働者は、吸入、皮膚接触、胃腸経路などの複数の媒体を介したナノ粒子（NP）への暴露に苦しむ可能性があります。アンドレア・プロディ他さらなる保護のためにNP曝露を評価するための段階的アプローチを提案した[31]。評価を除いて、バイオセーフティと生体適合性は他の研究の重要なポイントです。カン・ワング他GOの生体適合性を示しました。これは、用量が20μg/ ml未満の場合はヒト線維芽細胞に対して毒性を示しますが、用量が50μg/ mlを超える場合は明らかな細胞毒性を示し、細胞接着を大幅に低下させます[32]。現在、より一貫性のある見解は、GとGOが細菌に毒性作用を及ぼすが、細胞に毒性作用とは相容れないことを確認しています[33、34、35、36]。 GとGOの機能と毒性については、さらに具体的な研究が必要です。 Beatriz Pelaz etal。 「リスクを減らし、利益を増やす方法は、安全で効果的なナノメディシンの開発に不可欠です」という質問を提起しました。これは、GとGOの潜在的なリスクとinvivoおよびinvitroでの抗菌能力の組み合わせに向けた研究を思い出させ、促します[12]。 。

骨髄間葉系幹細胞（BMSC）は、多能性の成体幹細胞です。それらは、組織工学における骨欠損を修復するための重要な細胞源になっています[37、38]。さらに、グラフェンと誘導体および幹細胞との相互作用については、まだ研究が不足しています[39、40]。

したがって、この研究では、GMSCのinvitroマウス筋肉組織黄色ブドウ球菌に対するGとGOの影響を調査しました。 、invivoおよびinvitroでのGおよびGOの細胞毒性および抗菌能力を調査し、カーボンナノマテリアルナノメディシンおよびナノ毒性の研究を促進することを目的としています。

結果

GおよびGOの細胞毒性

G and GO Cytotoxicity In Vitro

電子顕微鏡下では、GまたはGOナノ粒子は30.41±5.59 nmのサイズの不規則な形状を示し、粒子の凝集が見られました（図1a、b）。 7日間の培養後、細胞の形態は紡錘形に変化しました（図1c）。骨形成分化培地で培養した後、カルシウム結節が形成された（図1d）。脂肪生成分化後に油の蓄積が形成されました（図1e）。

GおよびGOの細胞毒性（ a 、 b）。 GのTEM画像（ a ）およびGO（ b ）形成されたナノネットワークを示した。 c BMSCの細胞形態学。 d カルシウム沈着のためのアリザリンレッド。 e 脂質のオイルレッドO。 f GおよびGO処理後の細胞活性、* P <0.01、対照群、 ^＃ P <0.01、対照群、 ^○ P <0.05、G50μg/ mlグループ、 ^{☆、□、△} P 同じ濃度のG基で<0.01。 r 2（G）=0.843、 r 2（GO）=0.93。スケールバー a 、 b 200 nm、 c 、 d 100μm、 e 50μm。 r 、相関係数

濃度が10μg/ mlより高い場合、GまたはGOはBMSCの増殖を阻害しました。細胞毒性は1000μg/ ml群で最も高く、用量依存的に示された。濃度が10μg/ mlより高い場合、GOグループの細胞毒性は同じ濃度のGグループよりも高かった。濃度が高くなるほど、その差はより顕著になりました（図1f）。

ＳＥＭの観察下で、ＧまたはＧＯの濃度が１０μｇ ／ ｍｌであるとき、ＢＭＳＣは、良好な接着性および形状を備えた良好な状態であった。 Gの濃度が50μg/ mlを超えると、サイズの減少、表面分泌の増加、細胞表面の微絨毛の伸長など、細胞が変化することがわかりました。 GOの濃度が50μg/ mlを超えると、BMSCが収縮して変形し、ほとんどの細胞が死んでいることがわかりました。これらの結果は、GOが同じ濃度のGと比較してBMSCに対してより高い細胞毒性を持っていることを示しました（図2）。

G、GO、およびBMSCの共培養のSEM画像。 a Gグループ、10μg/ ml。細胞は良好な状態です。 b Gグループ、50μg/ ml。細胞の大きさが小さくなり、表面の分泌が増え、細胞表面の微絨毛が長くなります。 c GOグループ、50μg/ ml。 BMSCは収縮および変形します。 Gグラフェン、GO酸化グラフェン、B BMSC

TEMの観察下で、GまたはGOがBMSCに入り、細胞内部に沈着する可能性があることがわかりました。また、濃度が50μg/ mlを超えると、細胞構造障害などの細胞微小環境の変化や微絨毛の乱れが見られ、G群に比べてGOの細胞毒性が高いことがわかりました（図3）。

G、GO、およびBMSCの共培養のTEM画像。 a Gグループ。 b GOグループ。 GとGOはどちらも、細胞構造の障害と細胞表面の微絨毛の混乱を引き起こす可能性があります。 GOは細胞毒性の高い細胞微小環境の変化を引き起こします

SEMおよびTEM観察の結果に基づいて、10μg/ mlがGおよびGOのセーフティクリティカル濃度であることがわかりました。 GOの濃度が10μg/ mlを超えると、GOはGと比較してBMSCに対して高い細胞毒性を示しました。

G and GO Cytotoxicity In Vivo

インビボでのGおよびGO細胞毒性を分析するために、整形外科における局所移植状況を表現およびシミュレートする骨格組織を選択します。対照群およびG群の骨格組織のHE染色の結果は、垂直軸に平行な筋原線維を伴う正常な構造を示した。断面では、細い斑点と核として現れる筋原線維の断面が細胞の端に位置していた。上記の変化は正常な骨格細胞にも見られ、Gは筋肉組織に対してほとんど毒性がないことを示しています。

それどころか、GOグループでは、縦断面の筋線維の横線が骨折しており、はっきりしていなかったため、筋の萎縮と壊死が明らかになりました。したがって、GOは動物に対してより高い毒性を示しました（図4）。

HE染色で染色された組織切片。 a コントロールは無傷の組織を表します。 b Gグループ。骨格細胞はまっすぐなストリップとして存在します。筋原線維は長軸に沿って平行であり、横線は明確であり、断面は不規則なブロックです。筋原線維セクションは薄いスポットとして現れます。核は端にあります。 c GOグループ。縦断面の筋線維の横線は骨折しており、はっきりしていません

GおよびGO抗菌特性

インビトロでの抗菌能力

インビトロでの静菌実験において、GまたはGOのROIの光子強度は用量依存的に示された。そして、光子強度は濃度の増加に伴って減少しました。同じ濃度のGグループと比較した場合、GOグループの光子強度は低かった（図5）。

S の生物発光の強度モニタリング 。 アウレウス 試験管内で。 GとGOは、invitroでの抗菌能力に用量依存的な方法を示しています。 a Xen-29の生物発光は、37°C​​で0、8、および24時間のインキュベーション後にin vitroで画像化され、色の変化は光強度を表します（Bin M（8）、FOV12、f1、15秒）。 b PI =0時間、 r 2（GO-0 h）=0.924。 c PI =8時間、 r 2（G-8 h）=0.584、 r 2（GO-8時間）=0.960。 d PI =24時間、 r 2（G-24 h）=0.616、 r 2（GO-24 h）=0.943。* P <0.01、対照群、 ^＃ P <0.01対照群、 ^{☆、□、△、○} P 同じ濃度のG基で<0.01。 r 、相関係数

Ｇの濃度が１００、５００、および１０００μｇ ／ ｍｌである０、８、および２４時間で、Ｇは、対照群と比較して、Ｘｅｎ－２９成長に対する阻害能力を示した。ただし、10および50μg/ mlグループの光子強度は、コントロールグループと比較して有意差を示しませんでした。

GOの濃度が50、100、500、および1000μg/ mlの場合、0、8、および24時間で、GOはXen-29に対する成長阻害の効果を示しました。同様に、10および50μg/ mlグループの光子強度は、コントロールグループと比較して統計的に有意な差を示しませんでした。

結果は、Gが100μg/ mlを超える濃度で抗菌能力を示し、GOが50μg/ mlを超える濃度で抗菌能力を示したことを示した。 GまたはGOの抗菌能力は用量依存的でした。 GOは同じ濃度のGと比較してより強い抗菌能力を持っていました。

生体内の抗菌能力

インビボでの静菌実験において、GOグループは、0時間および24時間で有意に低い光子強度（PI）値を示した。 PI値はG群および対照群と比較して減少した。しかし、G群のPI値は対照群と比較して統計的に有意な差はありませんでした（図6）。結果は、GOが強力な抗菌能力を示したが、Gは100μg/ mlの濃度でinvivoで明らかな抗菌能力を示さなかったことを示しました。

S の生物発光の強度モニタリング 。 アウレウス インビボ。 GOは、invivoでの抗菌能力に用量依存的な方法を示します。 a インキュベーションの0時間および24時間後にinvivoで画像化されたXen-29の生物発光。色の変化は光強度を表します（Bin M（8）、FOV12、f1、60秒）。 b PI =0時間、 ^＃ P 対照群で<0.01。 c PI =24時間、 ^＃ P <対照群で0.01

ディスカッション

組織工学の発展に伴い、整形外科治療の分野で使用される生体材料の用途が増えています[41]。生体材料には優れたバイオセーフティが必要です。 GとGOは、その安全性と独自の物理的および化学的特性により、医療分野で広く使用されています。抗菌力の面では、GとGOが優れた抗菌物質です。主要な抗菌メカニズムは、電荷移動[28、29]および細胞への浸透[30]です。したがって、GとGOの抗菌能力は、安全範囲内の骨修復材料の要件を満たすことができます。

この研究では、バイオセーフティの特性を特定するために、SEMおよびTEMを介してBMSCに対するGおよびGOの細胞毒性効果を観察し、この効果を用量依存的に示しました。さらに、GOはより高い細胞毒性効果を示した。抗菌性の面では、GとGOが用量依存的に抗菌性を持ち、GO効果がinvivoでGよりも有意に優れていることをさらに観察しました。結論として、50〜100μg / mlの範囲の濃度は、マイナーな細胞毒性効果とメジャーな抗菌能力のバランスを保つためにより良いかもしれません。

この研究は、GとGOの両方がBMSCと骨格細胞に対して細胞毒性効果を示し、GO毒性がGよりも高いことを示しました。多くの研究がGナノ細胞毒性とその材料の物理的および化学的特性（サイズ、形状、および表面官能基）を細胞に向けて[35、42、43]。さらに、研究者らは、元のGがミトコンドリア膜電位（MMP）の枯渇と細胞内活性酸素種（ROS）の増加を通じて細胞毒性を誘発し[12]、したがってミトコンドリア経路の活性化によってアポトーシスを誘発することを発見しました[34、44]。 。しかし、GOの細胞毒性がGよりも高いという現象は、GOの表面に含まれる基に関連している可能性があります[45]。研究者は、GOの細胞毒性が血清含有量に直接関係していることを発見しました。 Hu W etal。 GOは、血清タンパク質を吸着してタンパク質封入体を形成できる強力な吸着能力を持っていることを示し[46]、Gと比較してGOの細胞毒性塩基性が高いことを示しています。さらに、動物毒性は、GおよびGOの生物学的安全性評価のもう1つの重要な指標です。この研究では、GOグループで筋肉組織の深刻な病理学的反応が見られ、Gグループと比較して毒性が高いことが示されました。

第二に、抗菌特性はGおよびGOの用量変化と一致しています。 50〜100μg / mlのGO濃度は、生物学的毒性と抗菌能力のバランスをより良くすることができます。私たちの研究は、生物学的毒性と抗菌能力の両方が用量依存的に存在することを示しました。したがって、いくつかの濃度範囲は、マイナーな生物学的毒性とメジャーな抗菌能力のバランスを保つ可能性があります。

結果は、GとGOの両方がBMSCと筋肉組織に対していくらかの生物学的毒性を持っていたことを示しましたが、GOグループでは、抗菌能力はinvivoで有意でした。 GおよびGO毒性の以前の結果に基づいて、50〜100μg / mlの濃度が、マイナーな生物学的毒性とメジャーな抗菌能力のバランスを保つためのより良いものである可能性があることを発見しました。臨床研究におけるinvivoおよびinvitroでのGおよびGOの能力。

GOには多くの毒性効果がありますが、GOを変更することで毒性を回避できる可能性があります[47、48]。同時に、改変されたGO材料は、体内で分解および除去される可能性があります[49]。したがって、GOの修正に関する新たな研究の方向性が求められています。さらに、他の重要な臓器や組織に対するGとGOの効果は、ホリズム医学に到達するためにさらに研究する必要があります。一方、GOが細菌に酸化ストレスによる損傷を引き起こすかどうか、および追加の抗菌メカニズムの存在については、さらに調査する必要があります。組織工学に適用する前に、GおよびGO毒性のメカニズムと、毒性を低減するための修正された方法について、さらに明確にする必要があります。

メソッド

動物

オスのSprague-Dawley（SD）ラットとオスのBalb / Cマウスは、イランのパスツール研究所から購入し、25°Cで12時間の明暗条件下で維持しました。 4週齢のSDラットをBMSCの単離に使用した。 Balb / Cマウスをinvivoでの動物実験に使用しました。すべての動物は第4軍事医科大学の実験動物センターで飼育され、手術はXijing病院の動物実験手術基準に従った。すべての動物実験は、第4軍事医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

グラフェンと酸化グラフェン

GまたはGO（レイヤー1〜2）（Hengqiu Graphene Technology、中国）をそれぞれ、無水エタノール（透過型電子顕微鏡テスト、TEMに使用）、PBSバッファー（in vitro細胞実験に使用）、および食塩水（ GまたはGO溶液を調製するためのinvivo動物実験）（ラマン分光法の試験結果はHengqiuグラフェンテクノロジーによって提供されました）。 GまたはGO溶液の初期濃度は1mg / mlでした。 GまたはGO溶液は、実験の2時間前に超音波を使用して分散させました。

細胞毒性

細胞培養

細胞培養培地には、10％ウシ胎児血清（Gibco、Carlsbad、California、USA）、DMEM / F12（Corning、NY、USA）、100 U / mlペニシリン、および100 U / mlストレプトマイシン（Sigma、St。Louis、ミズーリ州、米国）。 BMSCは、骨髄培養法[50]によって4週齢の雄ラットから抽出されました。ラットの処刑後、大腿骨と脛骨を無菌状態で除去した。髄腔を細胞培養培地で洗浄した。次に、混合物を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して骨髄を収集した。骨を細胞培養培地で再懸濁し、37°C​​および5％二酸化炭素細胞インキュベーターでゼラチンコーティングされた細胞培養ボトルに接種しました。細胞培養ボトルの培地は48時間後に交換し、非接着細胞を除去しました。その後、48時間ごとに培地を交換しました。 3〜5継代の細胞を次の実験に使用しました。

ＢＭＳＣでの骨形成分化および脂肪生成分化は、分化培地（Ｃｙａｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実施された。 2週間の分化誘導後、細胞を4％ホルムアルデヒド溶液で30分間固定しました。その後、骨形成分化のためのアリザリンレッド染色と脂肪生成分化のためのオイルレッド染色を行った。

セルアクティビティ

BMSC懸濁液の濃度を5×10 ⁴ に調整しました / lおよび細胞を96穴プレートで培養し、各穴に100μlを入れました。 24時間後、培地を、0（対照群として）、10、50、100、500、および1000μg/ mlの濃度のGまたはGOを含む細胞培養培地と交換した。 24時間培養した後、10μlのalamarBlue（Bio-rad、Hercules、CA、USA）を各穴に加えてさらに4時間培養しました。マイクロプレート（Bio-rad、Hercules、CA、USA）を使用して570および600 nmでのOD（光学密度）値を検出し、次にalamarBlue®比色計算機（Bio-rad、Hercules、California、USA）を使用して細胞増殖の速度を評価します。

SEMを使用した特性評価

ＢＭＳＣは、厚さ０．１７ｍｍ、直径１４ｍｍの２４穴の薄いガラス板に播種された。 ２４時間の培養後、培地を、０（対照群として）、１０、５０、１００、５００、および１０００μｇ ／ ｍｌの濃度のＧまたはＧＯを含む細胞培養培地と交換した。細胞を24時間培養し続け、その後上清を除去した。細胞を2.5％グルタルアルデヒド溶液で24時間固定しました。次に、脱水と金メッキを行った後、走査型電子顕微鏡（Hitachi S-4800 SEM、JPN）で細胞を観察しました。

TEMを使用した特性評価

GおよびGO懸濁液を50μg/ mlに調整しました。細胞をGまたはGOと24時間共培養し、0.25％トリプシンで消化しました。 1000rpmで10分間遠心分離した後、上清を除去した。細胞を2.5％グルタルアルデヒド溶液で24時間固定し、透過型電子顕微鏡（FEI Tecnai G2 TEM、米国）でスライスを観察しました。

筋組織の毒性と同定

インビボでのGおよびGO細胞毒性を分析するために、整形外科における局所移植状況を表現およびシミュレートする骨格組織を選択します。 GまたはGOは、それぞれBalb / Cマウスの内側大腿筋組織に注射されました。 7日後にマウスを殺し、GまたはGOを注射した筋肉組織を10％中性ホルムアルデヒド溶液で24時間固定した。アルコール脱水後、組織をパラフィンで包み、スライスしてヘマトキシリンおよびエオシン（HE）染色を行いました。スライスは倒立顕微鏡（ライカDMI6000B倒立顕微鏡、RBT）で観察されました。

抗菌能力

細菌培養

発光反応のために培養するXen-29を選択しました。 Xen-29は、黄色ブドウ球菌の生物発光細菌でした。 （キャリパー、LS、米国）ATCC-12600から派生。細菌は、200μg/ mlカナマイシン（Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国）を含むLuria Bertani培地（LB、Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国）で37°Cで培養されました。単一のコロニーを37°CのLBブロスに取り、200 rpmの速度で2〜3時間振とうしました。 LBブロスブランクの吸光度と比較して、600 nmでの吸光度が0.5（1.44×108 cfu / mlにほぼ相当）に達したら、細菌を次の実験に使用しました。

生物発光イメージング

生物発光イメージングを提示するために、IVIS Lumina II冷却CCD光学巨視的イメージングシステム（Caliper、LS、USA）を使用しました。細菌の生物発光シグナルは、光子強度（PI）に変換されました。 LivingImage®4.2ソフトウェア（Caliper、LS、USA）を使用して、関心領域（ROI）のPIを定量化しました。イメージングプロセスでのマウスの動きを防ぐために、受信信号の不安定さを避けるためにマウスに麻酔をかけました。

インビトロでの抗菌能力

Xen-29を24穴プレートに追加し、各穴の濃度は10 ⁷ でした。 cfu。次に、GまたはGO懸濁液を添加して、濃度を0（コントロール）、10、50、100、500、および1000μg/ mlに調整しました。各穴の一定容量は500μlでした。 GとGOの抗菌能力を分析するために、ROIの細菌PIを、介入後0、8、24時間に順次測定しました。

生体内の抗菌能力

上記の実験結果に基づいて、抗菌能力を特定するために100μg/ mlのグループが選択されました。 Xen-29懸濁液（200μl）をBalb / Cマウスの内側大腿筋組織に注射しました。 ROIのPIは、手術後0時間と24時間に検出されました。

データ分析

すべてのデータは、平均±標準偏差（SD）として表されました。学生の t 同じ濃度のGとGOを比較するためにテストを使用しました。一元配置分散分析（ANOVA）を使用して、それぞれ異なる濃度のGとGOの違いを比較しました。 P <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結論

結論として、GとGOは、用量依存的に生物学的細胞毒性効果を示します。 GとGOは抗菌性があり、用量依存的に機能します。 GOの抗菌特性はinvivoでGよりも大幅に優れています。 50〜100μg / mlの濃度は、マイナーな生物学的毒性とメジャーな抗菌能力のバランスを保つためにより良いかもしれません。さらに、毒性を低減するためのGOの変更は、ナノメディシンでのGおよびGOアプリケーションに貢献するために明確にする必要があります。

略語

BMSC：

骨髄間葉系幹細胞

G：

グラフェン

GO：

酸化グラフェン

HE：

ヘマトキシリンおよびエオシン

LB：

ルリアベルターニ培地

NP：

ナノ粒子

PI：

光子強度

ROS：

活性酸素種

SEM：

走査型電子顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡