酸化グラフェンベースのデリバリーシステムを介したメタロプロテイナーゼ-1の組織阻害剤の連続放出は、皮膚の再生を促進することができます

背景

皮膚病変は、事故、糖尿病性合併症、火傷、または表在性手術などの多くの要因によって引き起こされる可能性があります[1]。自家植皮、または人工皮膚の製造に使用される生体高分子は、創傷閉鎖に使用される最も一般的なアプローチです[2]。これらの代替物には、特に重度の火傷を負った患者[3]、感染症[4]、痛み、皮弁壊死[5]で利用可能なドナー軟組織の制限が含まれ、材料の治癒と生体適合性が低下します。

メタロプロテイナーゼ-1の組織阻害剤（TIMP-1）は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）と阻害複合体を形成することにより、細胞外マトリックス（ECM）の分解を防ぎます[6、7]。 TIMPタンパク質はまた、MMPによる代謝回転と成長因子のプロセシング、および創傷の修復と再生に関連するサイトカインを制御します[8]。 TIMPとMMPは通常の創傷治癒中に調節され、それらの不均衡は皮膚修復の欠陥、ケロイド、および線維症に関係しています[9]。上皮由来TIMP-1は、直接的または間接的にさまざまな段階で上皮化を調節することができます。切除創の修復と皮膚の再生の重要な段階は、外傷性表面上での上皮の再成長である再上皮化です[10]。再上皮化は、創傷縁の細胞が細胞間および細胞-ECMの接触を緩め、創傷を横切って移動し始めるときに発生します。これらのプロセスはTIMP-1生物学に関連しています[11]。

皮膚の回復のための最適な局所TIMP-1投与システムは、使用される送達媒体に依存します。サイトカインを放出するように設計されたいくつかの送達媒体が開発された[12]。担体には、PLGA（ポリ（乳酸-co-グリコール酸））[13]、キトサン[14]、PLGAナノスフェア[15]、およびヒドロゲルが含まれます。送達ビヒクルの使用は、皮膚再生のためのTIMP-1投与量を減らし、薬剤の局所送達を可能にするのに役立つであろう。グラフェンは、平坦な単分子層とハニカム状の2次元構造を持つ炭素原子で構成されています[16]。酸化グラフェン（GO）は、効率的な負荷（吸収）があり、生体適合性があり、毒性が低いため、文献で小分子ドラッグデリバリービヒクルとして使用されています[17、18、19]。 GOの本質的な特徴には、疎水性のπが含まれます。 エッジに沿ってイオン化された領域を持つ構造のコアのドメイン。特徴的なπ – π スタッキング相互作用により、GOは水溶性で効率的になり、比表面積が大きく、高い負荷容量が得られます[20、21]。

本研究では、組換えヒトTIMP-1タンパク質を送達媒体としてGOと組み合わせて、皮膚の再生を改善できるかどうかを調査しました。皮膚再生への影響を調べるために、TIMP-1をGOフレークにロードし、その放出と毒性をラット線維芽細胞を介してinvitroで測定しました。結果は、皮膚創傷モデルが使用されているラットで最終的にテストされます。

材料と方法

細胞培養

ラット線維芽細胞は、CASの生化学細胞生物学研究所（上海、中国）から購入し、10％（ v ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、GibcoBRL、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）で培養しました。 / v ）ウシ胎児血清（FBS、Gibco）。培地は2日ごとに交換されました。すべてのセルは37°Cに保たれました。

GOの特性評価

GOフレークはChengduOrganic Chemicals Co.、Ltd。中国科学アカデミー（中国、成都）から購入し、プラチナコーティング後に走査型電子顕微鏡（SEM、JSM-6701F、JEOL、東京、日本）を使用して特性評価しました。サンプルは、走査型電子顕微鏡（Hitachi S3000N）の下で15kVの加速電圧でスキャンされました。 GOフレークのサイズ分布は、ゼータ電位ベースの分光光度計（Zetasizer 3000 HSA、Malvern、UK）を使用して決定されました。 GOフレークの形態は、原子間力顕微鏡（AFM、MultiMode、VEECO、米国）と倒立顕微鏡（IX71倒立顕微鏡、オリンパス、東京、日本）を組み合わせて使用​​して決定しました。熱重量分析と示差走査熱量測定は、TGA / DSC熱重量分析装置（Pyris 1 TGA、Perkin-Elmer、USA）を使用して、サンプルをアルミナパンに入れ、10°Cで25〜1100°Cの加熱ランプを適用することによって実行されました。分。

GOでのTIMP-1吸着

GOフレークは、ヒト組換えTIMP-1（Huaan Co.、Hangzhou、China）吸着前に、1,1-ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラム-エチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（DiI、赤、Sigma）で標識されました。 TIMP-1の吸着には、フルオレセインイソチオシアネート（FITC、グリーン、Thermo Scientific、ロックフォード、イリノイ州、米国）結合TIMP-1（Huaan Co.、杭州、中国）およびDiI標識GOをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に添加しました。 ）、4°Cで4時間インキュベートします。 GOと組換えTIMP-1の比率は1：1重量でした。 GOへのTIMP-1の負荷を測定するために、TIMP-1（1μg）をGOを含む20μlのPBSに添加し、4°Cで4時間インキュベートしました。 GOに吸着したTIMP-1は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（IX81-FV1000倒立顕微鏡、オリンパス）を使用して可視化しました。 GOへのTIMP-1の吸着を確認するために、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）を、2 mgGOと100mgをブレンドして調製したペレット（直径10 mm）に対してNicolet 5700分光法（ThermoFisher Co.、SGE、オーストラリア）を使用して実行しました。 KBrとプレスにより、分析対象のペレットを生成します。スペクトルは、ソフトウェアEZ OMNIC（Nicolet）によるベースライン補正後に分析されました。

TIMP-1タンパク質の放出動態

さまざまなGO濃度（10、20、および30μg/ ml）からのTIMP-1の放出プロファイルは、市販のヒトTIMP-1特異的酵素結合免疫吸着測定法（ELISA、R＆D Systems Inc.、ミネソタ州ミネアポリス、米国）。 4°Cで4時間インキュベートした後、上清のELISAにより、実質的にすべてのTIMP-1がGOに吸着されたことが示されました。 TIMP-1をロードしたGOを、1.5mlのPBSを含む60mmの培養皿に懸濁しました。次に、皿を37℃でインキュベートしました。様々な時点で、連続的に攪拌した後、上清を収集し、新鮮な緩衝液を培養皿に加えた。上清中のヒトTIMP-1の濃度はELISAによって決定されました。

GO生体適合性アッセイ

20μg/ mlの濃度のTIMP-1をロードした1ミリリットルあたり20マイクログラムのGOフレークをラット線維芽細胞培養物に添加し、細胞を6、24、48、および72時間培養しました。細胞生存率は、製造元の指示に記載されているように、cell counting-8（CCK8）アッセイを使用して評価しました。サンプルの吸光度は、450 nm（ n ）での吸光度値として表されました。 =グループごとに5）。

フローサイトメトリーによる特性評価

線維芽細胞はトリプシン処理によって採取され、Hoechst33258およびAnnexin-V-FITC / PIで標識されました。続いて、細胞周期活性および細胞アポトーシスを、フローサイトメトリー分析キット（Lianke、杭州、中国）によって決定した。ブロッキング試薬（Lianke、杭州、中国）の存在下で4°Cで30分間標識を行い、続いてPBSを使用して2回洗浄しました。洗浄して固定した後、少なくとも10 ⁴ 細胞を取得して分析した。フローサイトメトリー分析は、Becton Dickinson FACSCantoIIを使用して実行されました。

InVivo実験

すべての実験手順は、米国のNIHのガイドラインに従って実施されました。実験手順のための動物は、浙江大学倫理委員会によって承認されました。 4週齢のオスのSprague-Dawleyラットに、前述のように皮膚欠損手術（SDS）を実施しました（図4a）[22]。皮膚の離反のサイズは10mm×10mmでした。手術後、動物は個々のケージに戻された。 SDSの14日後、動物をランダムに4つのグループに分け、治療を開始しました。コントロールエージェント（4 ml PBSのみ）、GOエージェント（4 ml GOとPBS、1：20）、TIMP-1エージェント（4 mlTIMP-1とPBS1：20）、またはTIMP-1-GOエージェントの局所注射（TIMP-1を使用した4 ml GO、1：1 v / w ）皮下投与した。注射は、皮膚の欠陥の周りに毎週行われ（合計4ポイント、各1 ml）、2週間にわたって合計2回の治療が行われました。ラットは、手術の4週間後に犠牲にされました（図4a）。再生された皮膚を解剖し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン-エオジン染色とマッソン染色で調べました。

組織学的および免疫組織化学的分析

再生された皮膚は、4％ホルマリンで72時間固定されました。次に、サンプルを9％ギ酸で、室温で2週間脱灰しました。皮膚のサンプルは段階的なエタノールによって脱水されました。連続した切片は、ヘマトキシリン-エオジン（HE）およびマッソンで染色されました。皮膚欠損部でのCD34の発現を免疫組織化学的染色によって分析した。切片をキシレンで脱ロウし、段階的アルコールで水和しました。 1％ヤギ血清（1：100希釈、Sigma）でブロッキングした後、切片をCD34（Abcam、Cambridge、UK）に対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートしました。 PBSで3回洗浄した後、切片を二次抗体とともに37℃で1時間インキュベートしました。染色は、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）溶液（Dako、ハンブルグ、ドイツ）で開発されました。再生された皮膚は、3人の訓練された観察者によって観察された。免疫組織化学的切片は、DBAのパーセンテージを使用してステージングされました。

統計分析

すべての実験は3回繰り返され、データは平均値±標準偏差として表されました。一元配置分散分析とStudent–Newman–Keuls事後検定により、有意水準が決定されました。 p 0.05および0.01未満の値は、それぞれ有意および非常に有意であると見なされました。統計分析は、SPSS 17.0（SPSS Inc.、シカゴ、米国）を使用して実行されました。

結果

GOの特性評価

GO画像の2D表現は、AFMで表示されます（図1a）。 SEMは、GOフレークが不規則な形状のシートであることを示しました（図1b）。 GOフレークのサイズ分布は、電位ベースの分光光度計によって測定されました。サイズ分布の最大強度は1140nmであり、GOの最大強度ボリュームは10,674.1 nmでした（図2a）。

GO吸収。 a AFMで表示されたGO画像の2D表現。 b SEMは、GOフレークが不規則な形状のシートであることを示しています。 GOフレークは不規則な形状のシートでした。 c GOフレークのサイズ分布。最大強度は1140nmで、最大強度ボリュームは10,674.1nmでした

GOおよびTIMP-1-GOの特性評価。 a TIMP-1はGOに吸収されました。分析の結果、GOの75±1.2％がTIMP-1に吸収されたことが明らかになりました。 b TIMP-1の累積放出プロファイルが記録されました。 GOに組み込まれたTIMP-1は、TIMP-1のリリースを約40日間延長するのに適したシステムです。 c GOとTIMP-1-GOの間の化学組成は、FTIR分光法を使用して調査されました。 GOの波形と波のピークはTIMP-1-GOのものとは大幅に異なっていました。 d 熱重量分析の曲線は、50〜800°CでGOとTIMP-1-GOの間に大きな違いがないことを示しています。熱重量分析の曲線は、コントロールGOとTIMP-1-GOの間に感知できるほどの違いを示さなかった

GOでのTIMP-1吸着

以下は、FITC結合TIMP-1（緑）とDiI標識GO（赤）をPBSで4時間インキュベートしたものです。 TIMP-1はGOに吸着されました。分析により、GOの75±1.2％が4時間後にTIMP-1に吸収されたことが明らかになりました。これは、GOがTIMP-1タンパク質に効率的に結合することを示唆しています（図1c）。 FTIR分光法を使用してTIMP-1-GOの化学組成を調査しました（図2b）。 GOの波形と波のピークはTIMP-1-GOのものとは大幅に異なっていました。さらに、コントロールGOとTIMP-1-GOの間の熱重量分析を調査しました（図2d）。熱重量分析の曲線は、コントロールGOとTIMP-1-GOの間に感知できるほどの違いを示さなかった。

TIMP-1リリース

さまざまな濃度のTIMP-1（グループ13μg/ ml、グループ22μg/ ml、およびグループ310μg/ ml）をGOにロードしました。 TIMP-1の累積放出プロファイルを図2cに示します。 2μg/ mlのTIMP-1-GO放出は、10および30μg/ mlのTIMP-1用量と比較して、より迅速に50％の累積放出に達しました。 TIMP-1は約40日間継続的にリリースされました。これは、GOに埋め込まれたTIMP-1の適用が、TIMP-1の長期放出に適したシステムである可能性があることを示唆しています（図2c）。

TIMP-1-GOでの細胞増殖と生存率

コントロール、GOおよびTIMP-1で培養されたラット線維芽細胞の増殖と生存率は、TIMP-1-GOの異なるサンプルで培養された細胞の増殖と生存率にそれほど違いはありませんでした（ p > 0.05）。コントロール、GOおよびTIMP-1で培養された線維芽細胞の細胞周期とアポトーシスは、TIMP-1-GOのサンプルで増殖した細胞の細胞周期とアポトーシスにそれほど違いはありませんでした（ p > 0.05）（図3a–c）。

ラット線維芽細胞の増殖と生存率に対するTIMP-1-GOの効果。 a 異なるグループで培養された線維芽細胞の生存率は、異なる時点で有意差を示しません（ p > 0.05）。 b 線維芽細胞の細胞周期は、異なるグループで成長した細胞の細胞周期と有意差はありませんでした（ p > 0.05）。 c 線維芽細胞の細胞アポトーシスは、異なるグループで増殖した細胞のアポトーシスと有意差はありませんでした（ p > 0.05）

切除皮膚創傷モデルにおけるTIMP-1-GOの有効性

TIMP-1-GOをラットに皮下投与して、実験的創傷の治癒を促進できるかどうかを判断しました。手術の4週間後、対照群と比較して、TIMP-1-GOで治療された皮膚欠損は終点に有意差を示しました（ p <0.05）、TIMP-1で治療された皮膚欠損は、終点で対照群およびGO群と有意差を示しました（ p <0.05）。さらに、TIMP-1-GOグループは、毛包の再生において強化された治療効果を示しました（ p <0.05）。 TIMP-1で治療された皮膚欠損は、終点で対照群とGO群との有意差を示しました（ p <0.05）（図4b）。

インビボ実験。 a スキームとSDSおよびモデル。 b インビボでの組織学的および免疫組織化学的分析（1cm）。連続コラーゲン線維はTIMP-1-GOグループで見られます。 c 定量的評価により、TIMP-1およびTIMP-1-GOと比較して対照とGOの間に有意差が明らかになりました（ p <0.05）。異なるグループの毛包は有意に異なっていました（ p <0.05）。 TIMP-1で治療された皮膚欠損は、半定量的（ p ）によって対照群およびGO群と有意差を示しました。 <0.05）

組織学的および免疫組織化学的分析

PBSで処理した後の皮膚再生の組織学的特徴を図4bに示します。皮膚欠損後の対照群の特徴は、治療の4週間後に標本に見える壊れたコラーゲン繊維を示しています。対照的に、連続コラーゲン線維は、同じ時点でTIMP-1-GOグループに表示され、コントロールグループと比較して統計的差異を示します。 TIMP-1-GOの治療後の血管新生の免疫組織化学的特徴を図3cに示します。 CD34 +皮下細胞は、TIMP-1-GO治療群の4週間後に検体に見られます。定量的評価により、対照群とTIMP-1-GO治療群の間に有意差が明らかになりました（ p <0.05）（図4c）。

ディスカッション

本研究では、組換えTIMP-1タンパク質とGOからの制御放出を組み合わせることにより、切除創の修復を強化するための潜在的な新しいアプローチを分析しました。 GOはinvitroで良好な生体適合性を示しています。また、TIMP-1は、最大40日間GO車両から継続的に解放されることが示されています。 TIMP-1とGOの組み合わせは、実験的な皮膚欠損モデルにおいて血管新生とコラーゲン再生を促進することが示されています。

組織再生における薬剤の送達のための治療媒体として、様々な生物医学材料が評価されてきた。コラーゲン、シルク、チタン、リン酸カルシウムセメント、ポリ乳酸-ポリグリコール酸などのビヒクルは、生物剤の急速な放出を引き起こす傾向がありますが、これは一部の治療環境では望ましくない場合があります[23]。したがって、生物学的分子のゆっくりとした連続放出を提供する生物医学的ベクターの能力は、重要な特徴と見なすことができる。この品質の要件は、電荷の助けを借りて薬物をロードするために使用される柔軟性です[24]。酸化グラフェン（GO）は、invitroおよびinvivoの両方でさまざまな生物学的薬剤の徐放に有用性を示した「オフスタート」効果を提供します[25、26、27]。ここでは、GOを使用して組換えヒトTIMP-1タンパク質の徐放を発揮できることを示しました。疎水性π間の相互作用 GOのドメインと静電相互作用は、GOの負に帯電したドメインを活性化し、内側の疎水性領域を介してGOへの効率的なTIMP-1タンパク質の吸収を可能にします。 GOからのTIMP-1の長期放出は、皮膚創傷修復に必要な血行再建術に理想的に適しています。

50 mg / mlを超える濃度の炭素粒子が組織に沈着する可能性があることが示唆されています[28]。王ら。 GOの直径は非常に小さいが機能表面積が大きいため、これが炎症反応を引き起こす可能性があることを示唆している[29]。以前の研究とは対照的に、GO沈着は私たちの研究では検出されませんでした。ここで見られる明らかな副作用がないことを考えると、GOナノ粒子の潜在的なネガティブはサポートできません。生物学的反応や安全性試験など、グラフェンに関するさらなる研究が示唆されています[30]。

酸化グラフェンの細胞への相互作用の影響に関する研究は重要な問題です。グラフェンは新しく開発された生物医学材料であり、その特性は多くの生物学的用途での使用を示唆しています。ただし、2次元炭素構造/グラフェン毒性学および一般的な生物学的相互作用の潜在的な生物学は完全には理解されていないため、広範な追加研究が必要になります。

結論

酸化グラフェン（GO）は、組換えTIMP-1をゆっくりと送達するための媒体として使用すると、持続的な生体適合性を示します。 TIMP-1は最大40日間GOから継続的に放出されることが示され、TIMP-1とGOの組み合わせは、皮膚再生のモデルで血行再建術とコラーゲン再生を促進することが示されています。