PEG化リポソームを介したブファリンの改善された抗腫瘍効果および薬物動態

背景

毎年増加する癌患者の人口は2020年までに半分に増加する可能性があるため、癌疾患は世界的に非常に重要です[1]。血液脳関門（BBB）と多剤耐性が存在するため、神経膠腫腫瘍は、臨床的に有効な治療薬がない最も生命を脅かす疾患の1つです[2]。ブファリンは Venenum Bufonis から分離および同定されました 、ヒキガエルの皮膚と耳下腺の分泌物です Bufo bufo ガルガリザン Cantorまたは Bufo melanostictus シュナイダー[3]。強心、抗ウイルス、免疫調節、特に抗腫瘍効果を含む強力な薬理効果があることが報告されています[4、5、6、7]。ただし、溶解性が低いため、水溶液への分散が困難になり、塗布が制限されます[8]。

リポソームは、含水溶液への貧弱な薬物溶解性を改善し、生物学的利用能を高め、治療効率を高め、そして副作用を減らすための新しい薬物送達システムと見なされてきた[9]。主に、ロードされたエージェントがBBBを通過して脳に配信するのに役立ちます[10]。しかし、リポソーム製剤の主な欠点の1つは、血漿タンパク質がリポソームのリン脂質膜に吸収されるために血液から急速にクリアランスされることです。これにより、単核貪食系によるリポソームの認識と取り込みがトリガーされます。幸いなことに、リポソームの表面でポリエチレングリコール（PEG）が修飾されている場合、この種の食作用は遅くなる可能性があります。したがって、ブファリンをロードしたPEG化リポソームを長期循環リポソームとして研究し、水溶性を高め、薬物動態を改善する必要があります[11]。

現在まで、ブファリンの薬物動態に関する研究はまだあまり注目されていません。一部の報告は、経口投与あたりの水溶液中の遊離ブファリンの薬物動態にのみ焦点を当てています。本研究では、ブファリンの送達システムとしてPEG化リポソームを開発し、ラットへの静脈内投与による水溶液中のブファリン負荷PEG化リポソーム、ブファリン負荷リポソーム、およびブファリン実体間の薬物動態の違いを比較しました。

メソッド

化学薬品および試薬

ブファリン（純度98％以上）はBaoJi Chenguang Technology Development Co.、Ltd。（Baoji、Shaanxi、China）から購入しました。 L-α-ホスファチジルコリン、コレステロール、および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N- [メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩; DSPE-PEG ₂₀₀₀ ）はSigma Chemical Co.、Ltd。（米国ミズーリ州セントルイス）から購入しました（これらの物質の分子式は追加ファイル1：図S1に示されています）。使用したアセトニトリルは分光学的グレードのもので、Honeywell（アメリカ）から購入しました。クロロホルムとアルコール（分析グレード）は、天津ケミオウ化学試薬株式会社（中国）から購入しました。すべての化学物質は分析または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレードでした。そして、ミリポア浄水システム（米国マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して水を脱イオン化し、0.22μmメンブレンでろ過しました。

動物と細胞

この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施されました。プロトコルは、第4軍事医科大学（中国陝西省）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました（承認2015-1013-R）。すべての手術はペントバルビタールナトリウム麻酔下で行われ、苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。オスのSprague-Dawleyラットは、最初は体重250±20 gで、第4軍事医科大学（中国、西安）から入手しました。 SW620、PC-3、MDA-MB-231、A549、U251、U87、およびHepG2細胞株は、それぞれ上海細胞銀行または第4軍事医科大学の実験動物センターから購入し、10％を添加したRPMI 1640で培養しました（ v / v ）ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質（100 U / mLペニシリンGおよび0.1mg / mLストレプトマイシン）。細胞は、5％CO ₂ の雰囲気下で指数増殖期に維持されました。 37°Cで90％の相対湿度。

ブファリンをロードしたリポソームの合成

リポソームは、高圧均質化を使用して10mLのバッチサイズとして調製されました。使用したブファリンの量は、すべてのリポソームで同じでした。簡単に説明すると、ブファリンをロードした一般的なリポソームは、ブファリン、コレステロール、およびL-α-ホスファチジルコリンのモル比が10:30:60の組成で調製されました。ブファリンをロードしたPEG化リポソームは、ブファリン、コレステロール、L-α-ホスファチジルコリン、およびDSPE-PEG ₂₀₀₀ の組成で合成されました。 それぞれ10：30：55：5のモル比で。

上記のリン脂質混合物を3mLのクロロホルムに完全に分散させた後、減圧条件下、50°Cのロータリーエバポレーターでクロロホルムを完全に揮発させました。続いて、残留溶媒（存在する場合）を真空デシケーターに一晩入れて乾燥させた後、調製した乾燥薄膜を、10 mL50°Cに予熱した脱イオン水中で10mmol / mLリン脂質で15分間ボルテックスを使用して再水和しました。このように形成された混合物は、高圧均質化でさらに処理された。均質化の圧力と時間は最適化され、35°Cで500バールであることがわかり、プロセスは10回リサイクルされました。得られたリポソーム懸濁液を、ポリカーボネート膜（0.2μmポアサイズ、Whatman、メードストン、英国）を使用してLipex押出機（ATS、カナダ）で2回直ちに押し出し、単層リポソームを形成した。ブランクのリポソーム懸濁液も、ブファリンの添加ステップを省略して、前述と同じ方法で調製されています。

ブファリンをロードしたリポソームの特性評価

粒子サイズとゼータ電位

粒子サイズとゼータ リポソームの電位は、ゼタを使用した動的光散乱法によって決定されました。 ポテンシャルアナライザー（Delsa™Nano、Beckman Coulter、カリフォルニア、米国）。サイズ分布と zeta を決定する前に、すべてのブファリンリポソームをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で適切な濃度に希釈しました。 潜在的な。測定は全自動モードで実施されました。

高分解能透過型電子顕微鏡

ブファリンリポソームは、高分解能透過型電子顕微鏡（HR-TEM）研究でさらに特徴づけられました。 300メッシュの銅グリッドで支持されたブファリンリポソーム懸濁液は、1％（ w ）でネガティブ染色されました。 / v ）リンタングステン酸。形態の直接イメージングは​​、TEM（Hitachi H-7650、東京、日本）を使用して200kVの加速電圧で実行されました。

閉じ込め効率

ブファリン含有量をHPLC法で分析した。 Shimadzu HPLCシステム（京都、日本）には、LC-20ATポンプ、SPO-M20Aダイオードアレイ検出器、CTO-10AS VPカラムオーブン、およびSIL-10AFオートサンプラーが装備されていました。すべての分離は、SinoChrom ODS-BP C18カラム（250mm×4.6mm、5μm、Yillite）（Yillite、大連、中国）で実施しました。注入量は20µLで、カラム流出液は296nmでモニターされました。データは、ClassVPソフトウェアを使用して取得および処理されました。移動相は、アセトニトリル：0.1％リン酸二水素カリウム（リン酸でpH値を3.8に調整）とグラジエント溶出（50：50、 v ）の混合物で構成されていました。 / v ）。クロマトグラフィーは、1.0 mL / minの流速で実施しました。捕捉効率を測定するために、1.0mLのブファリンリポソーム懸濁液をSephadexG50カラムに添加し、PBSで溶出しました。排水の青みがかった部分を収集し、PBSを追加して10.0 mL（最終容量）にしました。金額（ W ₁ リポソーム懸濁液中のブファリンの）は、HPLC法によって決定された。 PBSを1.0mLのブファリンリポソーム懸濁液の他の部分に加えて、最終容量が10.0 mLになるようにし、その量（ W ₂ ）含まれるブファリンの量は同じ方法で決定されました。ブファリンリポソームに捕捉されたブファリンのパーセンテージは、次の式によって計算された：

invitro安定性試験

セファデックスクロマトグラフィー法によってテストされた捕捉効率とゼタによって決定された粒子サイズ 電位アナライザーを適用して、0、7、15、30、および90日目に4°Cで保存した後の安定性プロファイルを評価しました。5つの時点で、200μLのリポソーム懸濁液を吸引してリポソーム漏出率を測定しました。すぐに、200μLのリポソーム懸濁液の遊離ブファリンをSephadex G50カラムクロマトグラフィーを使用して分離し、遊離ブファリンの量をHPLC法で測定しました。リポソーム漏出率は次の式で計算されました：

ブファリンのinvitroリリース

リポソームからのブファリンのinvitro放出挙動は、前述のようにいくつかの変更を加えて、37°C​​で透析バッグ技術を使用して実施しました。 10％ウシ胎児血清を含むPBS（pH =7.4）を放出媒体として使用しました。 4°CでPBSバッファーに対して4時間徹底的に透析することにより、ブファリンリポソームから遊離薬物を除去しました。簡単に説明すると、1.0 mLのブファリンリポソーム懸濁液をピペットで透析チューブ（Spectrumlabs、米国、MWCO 30 kDa）に入れ、室温で穏やかに水平に振とうしました（120 rpm / min）。透析チューブは、10％ウシ胎児血清を含む50 mL PBS（pH =7.4）に保持され、温度は37°Cに維持されました。透析液を培地から抜き取り、異なる時間、すなわち、等量の新鮮なPBSと交換した。時間0、0.5、1、2、4、6、12、24、および48。放出されたブファリンの濃度は、前述のようにHPLCで測定しました。

細胞毒性

SW620、PC-3、MDA-MB-を含むいくつかの種類の腫瘍細胞株でMTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用して、invitro細胞毒性研究を実施しました。 231、A549、U251、U87、およびHepG2。さらに、神経膠腫腫瘍細胞に対するブファリン負荷リポソームおよびブファリン負荷PEG化リポソームの細胞毒性効果を測定するために、U87およびU251細胞を選択した。 U87細胞とU251細胞をそれぞれ96ウェルマイクロタイタープレートに1.0×10 ⁵ で播種しました。 細胞/ウェルおよび接着させます（37°C、5％CO ₂ ）24時間後、培地を吸引し、0.1mLの新鮮な培地と交換しました。ブファリン実体、ブランクリポソーム、ブランクPEG化リポソーム、ブファリンロードリポソーム、およびブファリンロードPEG化リポソームを完全培地に希釈し、総量0.1 mLで細胞に添加して、目的の最終濃度を達成しました。コントロールについては、テストソリューションは追加されませんでした。ブファリンリポソームの調製に使用される賦形剤の毒性を試験するために、ブランクリポソームおよびブランクPEG化リポソームを評価した。 24時間後、5 mg / mL MTTを含む増殖培地で37°Cで4時間培養することにより、細胞生存率を評価しました。培地を吸引した後、形成されたホルマザン結晶を200μLの有機溶媒で可溶化しました。吸光度は、マイクロプレートリーダーで570nmの波長で測定されています。

HPLC法を使用したブファリンリポソームのinvivo薬物動態研究

薬物動態研究は、一般的なリポソームまたは長期循環リポソームからのブファリンの吸収、分布、代謝、および排泄を評価し、HPLC技術を使用してブファリンのバイオアベイラビリティの違いを調べるために実施されました。

この実験では、体重250±20 gの若くて健康な成体のオスのSprague-Dawleyラットを、第4軍事医科大学（中国、西安）から購入しました。ラットは、通常の12時間の明暗サイクルで、室温（24±2°C）および相対湿度40〜60％の換気の良いケージに収容されました。実験の前に、動物を最低3日間順応させました。動物の手順は、第4軍医科大学の動物倫理委員会のガイドラインに従って実施されました。

ブファリンをロードしたリポソーム、ブファリンをロードしたPEG化リポソーム、およびエタノールによる水性懸濁液支援可溶化中のブファリンを前述のように調製し、次にそれぞれ0.5 mg / kgの等価線量で静脈内投与しました。血液サンプルは、軽いエーテル麻酔下でラットの眼窩筋から、抗凝固剤としてヘパリンを含むマイクロフュージチューブに、2、5、15、30、45、60、90、120、240、360、600分後に収集されました。投与後、3500 r / minで15分間、4°Cで遠心分離します。分離した血漿は、アッセイ前に-20°Cで凍結保存しました。

サンプル前処理

ラットの血液からブファリンと内部標準を抽出するために、簡単な液液抽出法に従いました。 200 µLに、10.0 µgに相当する内部標準溶液（100 µg / mLシノブファギンワーキングストック20 µL）を加え、サイクロミキサーで10秒間混合した後、3.0 mLの酢酸エチル：石油エーテル、1：で抽出しました。 1（ v / v ）、および混合。混合物を5分間ボルテックスした後、Sigma 3-16k（フランクフルト、ドイツ）で4000 r / minで15分間遠心分離しました。 3.0 mLの有機層のアリコートを分離し、窒素下で蒸発乾固させた後、残留物を200μLのアセトニトリルに再溶解しました。 12,000 r / minで15分間遠心分離した後、20マイクロリットルの上清液を分析カラムに注入して分析しました。

薬物動態分析

観察された最大血中濃度（ C _max ）および半減期（ T _1/2 ）は、実験データの目視検査によって得られました。データは、薬物臨床評価のための中国薬理学会数学薬理学専門家委員会によって編集された薬物および統計（DAS 2.1.1）を使用した非コンパートメント薬物動態分析にかけられました。データは、2つのコンパートメントのオープンモデルに従って分析されました。

統計分析

すべての結果は平均±SD（ n ）として表されました。 =3）、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析（ANOVA）によって配合間の差異を比較しました。 P <0.05は、すべての場合の有意性を示します。

結果

物理化学的性質

高圧均質化技術と組み合わせたフィルムの再水和は、ブファリンをロードしたリポソームおよびブファリンをロードしたPEG化リポソームの調製に使用されました。フィルムの再水和は、親油性薬物を閉じ込めるための成熟した制御されたプロセスでリポソームを合成するための従来の方法の1つです。さらに、均質化サイクルの数は、均一で安定したリポソーム懸濁液を実現するために重要な役割を果たします。

ブファリンをロードしたリポソームとブファリンをロードしたPEG化リポソームの形態は、図1に示すように、TEMで観察するとほぼ球形または楕円形です。TEM画像によると、ブファリンをロードしたリポソームとブファリンをロードしたPEG化リポソームの平均粒子サイズリポソームは両方とも200nm未満でした。ブファリンをロードしたリポソームとブファリンをロードしたPEG化リポソームの平均粒子サイズは、 zeta で測定した場合、それぞれ127.6±3.64nmと155.0±8.46nmでした（図1c）。 ポテンシャルアナライザー（Delsa™Nano、Beckman Coulter、カリフォルニア、米国）。ブファリンをロードしたリポソームと比較して、ブファリンをロードしたPEG化リポソームは負の表面電荷を示し、優れた安定性を示唆しています（ブファリンをロードしたリポソームは2.24 mV、ブファリンをロードしたPEG化リポソームは-18.05 mV、追加ファイル2：表S1）。さらに、 zeta の分布 ポテンシャルは図1bで見ることができます。ただし、HPLCで測定したブファリンをロードしたリポソームとブファリンをロードしたPEG化リポソームへのブファリンの捕捉効率は、それぞれ76.31±3.40％と78.40±1.62％です。

ブファリンをロードしたリポソームおよびブファリンをロードしたPEG化リポソームの物理化学的性質。 a ほぼ球形または楕円形のブファリンをロードしたリポソームおよびブファリンをロードしたPEG化リポソームのTEM画像。 b 動的光散乱によって測定された、ブファリンをロードしたリポソームおよびブファリンをロードしたPEG化リポソームの典型的な粒子サイズおよび分布。 c 典型的な表面ゼタ ブファリンをロードしたリポソームとブファリンをロードしたPEG化リポソームの可能性

invitro安定性試験

ブファリンをロードしたリポソームとブファリンをロードしたPEG化リポソームの安定性プロファイルを表1に示します。さらに、リポソームの漏出率も計算されています。ブファリンをロードしたリポソームの場合、結果は0、7、15、30、および90日目の4°Cでそれぞれ0.0、16.7、25.2、27.9、および30.6％でした。ブファリンをロードしたPEG化リポソームの場合、結果はそれぞれ0.0でした。 、5.0、8.8、14.5、および18.0％、4°Cで0、7、15、30、および90日目。

invitroリリースプロファイル

ブファリンをロードしたリポソームまたはブファリンをロードしたPEG化リポソームからのブファリン放出プロファイルを図2に要約します。実験データから、同じ溶解媒体で、ブファリンは、ブファリンに続いて、制限なしに10％の子牛血清を含むPBSに迅速に拡散できました。 -ロードされたリポソームと最後にブファリンがロードされたPEG化リポソーム。

溶解媒体リン酸緩衝液、pH 7.4での、ブファリンをロードした一般的なリポソームおよびブファリンをロードしたPEG化リポソームからのブファリンのinvitro放出。データは平均値±SD、 n =3

細胞毒性

ブファリン実体の影響を受けた数種類の腫瘍細胞株の細胞生存率を、MTTアッセイでテストした場合の図3aと、最大阻害濃度の半分（IC ₅₀ ）に示します。 ）は、追加ファイル2：表S2でも計算されます。ブファリンは、用量依存的に複数の腫瘍細胞の増殖を阻害しましたが、IC ₅₀ ブファリンは、他の試験された癌細胞よりも、それぞれU251およびU87神経膠腫癌細胞に対して感受性が高いことが明らかになりました。ブファリンエンティティ、ブファリンをロードしたリポソーム、およびブファリンをロードしたPEG化リポソームを適用した場合、MTTアッセイによって実行されたU251の細胞生存率を図3bに示します。 12時間培養した場合、ブファリンエンティティ、ブファリンをロードしたリポソーム、およびブファリンをロードしたPEG化リポソームの細胞生存率は異なって示されましたが、ブランクリポソームとブランクPEG化リポソームの細胞生存率は変化しませんでした。説明したように、同じ濃度レベルで、ブファリンをロードしたPEG化リポソームグループのU251の細胞生存率は、ブファリンをロードしたリポソームグループの細胞生存率よりも常に低かった。一方、細胞生存率に対するブファリン実体の影響は最小限でした。

腫瘍細胞に対するブランクリポソーム、ブランクPEG化リポソーム、ブファリン実体、ブファリン負荷リポソーム、およびブファリン負荷PEG化リポソームのinvitro細胞毒性。 a さまざまな濃度のブファリン実体での数種類の腫瘍細胞株の細胞生存率。 b ブランクリポソーム、ブランクPEG化リポソーム、ブファリン実体、ブファリン負荷リポソーム、およびブファリン負荷PEG化リポソームのさまざまな濃度でのU251細胞の細胞生存率

生体内薬物動態研究

メソッドの検証

検量線は、内部標準のピーク面積比（ y ）に対する異議の線形回帰分析に基づいてプロットされました。 ）対濃度（ x 、μg/ mL）7つの異なる濃度の標準溶液中のブファリン。回帰方程式は y でした =0.4238 x + 0.2429（線形範囲0.05〜10.0μg / mL）、および相関係数（ R ² ）は0.9965でした。検出限界（LOD）値は0.01μg/ mLでした。これは、信号対雑音比が3（S / N ）になる注入サンプルの量として計算されました。 =3）。

特異性、精度、および回復

内因性物質による干渉の程度は、処理されたブランク血漿サンプルから得られたクロマトグラムの検査によって評価されました。追加ファイル3：図S2は、ブランク血漿、ブファリンをスパイクしたブランク血漿、ブファリンとレシブフォゲニンをスパイクしたブランク血漿（内部標準として）、ブファリン実体の静脈内投与の30分後にレシブフォゲニンをスパイクした血漿サンプル、ブファリンをロードしたリポソームの静脈内投与の30分後のレシブフォゲニン、およびブファリンをロードしたPEG化リポソームの静脈内投与の30分後の血漿サンプル。ブファリンとレシブフォゲニンは、それぞれ約7.191分と10.131分で溶出しました。ブファリンまたは内部標準の保持時間では、干渉物質およびリポソーム膜物質のピークは見つかりませんでした。精度テストと回復テストの結果を表2に示します。

薬物動態

ブファリンをロードしたリポソーム、ブファリンをロードしたPEG化リポソームの血中濃度-時間プロファイル、および水性懸濁液中のブファリン実体との比較を図4に示します。平均薬物動態パラメーターを表3に示します。結果は、これらのパラメータのほとんどと C に大きな違いがあります _max ブファリンをロードしたリポソームのそれはブファリン実体よりも少なかったが、ブファリンをロードしたペグ化リポソームのそれは最小であった。さらに、 T _{1 / 2z} ブファリンをロードしたPEG化リポソームとブファリンエンティティの比率、およびブファリンをロードしたリポソームとブファリンエンティティの比率は、約2.15倍（87.84分/40.52分）でした（ P <0.01）および1.34倍（54.40分/40.52分）（ P それぞれ<0.05）。 AUC _{（0– t ）} ブファリンをロードしたPEG化リポソームとブファリンエンティティの比率、およびブファリンをロードしたリポソームとブファリンエンティティの比率は、約5.49倍（139,157.83 ng /（mL min）/ 25,334.27 ng /（mL min））（ P <0.01）および2.28倍（57,751.88 ng /（mL min）/25,334.27 ng /（mL min））（ P それぞれ<0.01）。ブファリン実体が血流中で急速に除去され、リポソーム調製物が血漿中の薬物濃度を増加させ、その除去に耐えることが明らかになった。さらに、PEGの修飾はこの効果を促進する可能性があります。

ラットの血漿中のブファリンの濃度-時間曲線

ディスカッション

この研究では、ブファリンをロードしたリポソームとブファリンをロードしたPEG化リポソームを均質化フィルム再水和法でうまく調製しました。どちらも最適なサイズ範囲と低多分散性を持ち、大きなバッチサイズで簡単に再現できました。この研究により、リポソーム製剤がブファリンの溶解度を大幅に改善することがわかりました。

ブファリンをロードしたPEG化リポソームは、正の表面電荷を有するブファリンをロードしたリポソームよりも絶対値​​が大きい負の表面電荷を示した。 ゼータ 電位は主に表面特性によって決まります。未修飾のブファリンをロードしたリポソームは中性であり、それらの電位は一般に±5mV以内でした。ただし、DSPEは中性条件下では帯電しませんが、準備プロセスを完全に中性にすることはできないため、DSPEは負に帯電します。一方、ゼタ 高分子PEGの電位は、数ミリボルトでほぼ負であり、中性に近い負の電位です。したがって、DSPE-PEG ₂₀₀₀ の表面修飾後 ブファリンをロードしたリポソームでは、ゼタ ブファリンをロードしたPEG化リポソームの可能性は負です。これらの発見は、DSPE-PEG ₂₀₀₀ の表面修飾が リポソームの表面電位を変化させ、リポソームの安定性を高めます。インビトロ安定性試験により確認された。 Li etal。 [12]は、ブファリンで包まれたPEG化リポソームの表面に抗CD40mAbを結合するリポソーム同時送達システムを採用しました。リポソームは、ブファリン、コレステロール、EPC、DSPE-PEG ₂₀₀₀ の組成で合成されました。 、およびDSPE-PEG ₂₀₀₀ -それぞれ20：55：5：5：15のモル比のMal。次に、抗CD40モノクローナル抗体をマレイミド-チオール反応を介してリポソームに結合させ、ブファリンリポソームに固定された抗CD40を調製した。安定性プロファイルに関しては、負の表面電荷が明確で明確なデータ記述なしに優れた安定性を示唆しているとだけ述べられています。

Li etal。 [13]LipoidE-80®1.25％およびコレステロール0.06％からなるブファジエノライドをロードしたリポソーム（BU-lipo）を調製しました。ブファリン、シノブファギン、およびレシブフォゲニンの捕捉効率は、それぞれ86.5、90.0、および92.1％でした。リン脂質の安定性を考慮して、BU-lipo製剤にはpH6.5を選択しました。 pH、PSD、 zeta などのBU-lipoのプロパティ ポテンシャルと捕捉効率は、2〜8°Cで少なくとも3か月間変化しませんでした。ただし、保管条件は厳密に管理する必要がありました。輸送と保管のコストを削減するために、中性pHでのより安定した調製を研究する必要があります。これは、将来の臨床応用のために考慮に入れる必要があります。

以前の研究の準備処方によれば、我々はブファリンをロードしたリポソームについての実験を再現した。しかし、リポソームの安定性は生産ニーズを満たすことができませんでした。

本研究では、ブファリンをロードしたPEG化リポソームを、ブファリン、コレステロール、L-α-ホスファチジルコリン、およびDSPE-PEG ₂₀₀₀ の組成で合成しました。 それぞれ10：30：55：5のモル比で。特に、ポリカーボネート膜を使用してLipex押出機で押し出す前に、このように形成された混合物をさらに高圧均質化で処理しました。

中性pHで4°Cで3か月間保存すると、両方のリポソームの粒子サイズがわずかに増加し、捕捉効率が全体的に適度に低下しました。これは、臨床応用に使用するのに便利です。 TEM写真は、厚い三次元の雲のような構造がブファリンをロードしたリポソームの表面を覆っていることを示しました。これは、DSPE-PEG ₂₀₀₀ 両親媒性の線形ポリマー構造の特徴により、立体安定化に役割を果たします。

インビトロ放出研究は、ブファリン負荷リポソームおよびブファリン負荷PEG化リポソームからのブファリンの放出が同じ溶解媒体中で遅延される一方で、ブファリン実体が制限なしに迅速にPBSに拡散することを明らかにした。 DSPE-PEG ₂₀₀₀ の表面改質 水性境界層のバリア特性と膜の透過性を変化させ、リポソームからのブファリンの放出速度を低下させました。

Regarding cytotoxicity study, bufalin caused an obvious inhibition of growth in multiple tumor cells in a dose-dependent manner, while the results of IC₅₀ indicated that bufalin was more sensitive to U251 and U87 glioma cancer cells than the other kinds of cancer cells, respectively. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.

The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.

As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].

Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.

In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].

Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].

In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.

Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG₂₀₀₀ on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.

Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.

Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.

Conclusions

The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.