肥厚性瘢痕のinvitro経皮相乗光線力学/光熱療法のための生体適合性5-アミノレブリン酸/ Auナノ粒子負荷エトソーム小胞

背景

皮膚の皮膚損傷後の一般的で避けられない問題である肥厚性瘢痕（HS）は、正常な皮膚よりもはるかに厚い線維性真皮を持っています[1、2]。組織病理学的には、HSは肥厚性瘢痕線維芽細胞（HSF）の増加を示します。これは波状のパターンで配置され、上皮表面に配向し、結節構造を形成します[3]。さまざまな治療法が臨床的に利用可能ですが、HS治療法には多くの制限があるため、多くの課題があります。病巣内注射療法は、臨床診療に広く使用されています。しかし、それは不快な手術と永続的な色素脱失や皮膚萎縮などの副作用の両方によって制限されます[4]。圧力療法は、組織の虚血や組織の代謝の低下などの副作用に限定されています[5]。これらの制限を克服するために、レーザー治療は、レーザー照射を利用することにより、25年以上にわたってHS治療に開発され、適用されてきた局所的かつ非侵襲的なモダリティとして機能します[6]。一般に、レーザー治療は、さまざまな原理に基づいて、光線力学療法（PDT）と光熱療法（PTT）に分けることができます。

PDTは、HSの治療に使用されており、選択性が高く、副作用が少ないという利点があります[7]。その原理は2つのステップに発展します：（a）光増感剤はHSFで優先的に凝集し、（b）適切なレーザーの照射下で、光増感剤は細胞毒性活性酸素種（ROS）を生成し、HSFのアポトーシスを引き起こします[8、9]。さまざまな光増感剤の中で、5-アミノレブリン酸（ALA）は、重大な副作用なしに、皮膚科における局所治療法の優れた候補であることが証明されています。したがって、ALAベースのPDT（ALA-PDT）は、2010年に米国食品医薬品局からの販売許可を得てHS治療に広く使用されています[10]。ただし、その効率は2つの制限について物議を醸しています：（a）HS組織とHSFの両方へのALAの浸透性が低いこと、および（b）ROSの量子収率が低いこと。顕著な効果を生み出すために、高線量のALAまたは高レベルのレーザーが診療所で適用されます。残念ながら、高線量のALAは皮脂腺と表皮の損傷を引き起こし、高レベルのレーザーは健康な組織を傷つける傾向があります。したがって、HSのPDT治療におけるALAの浸透性とROSの量子収率を高めるために多くの注意が払われてきました。最近、特別に設計されたリポソームであるエトソーム小胞（ES）が、HSの局所送達の障壁を克服し、大きな進歩を遂げることができることがわかっています[11、12]。私たちの以前の研究では、準備されたALAロードES（ALA-ES）は、従来の水アルコール溶液システムと比較して、はるかに多くのALAをHSに供給することができます[13]。したがって、ESはALAの浸透性を高めて、HSのPDTの有効性を向上させることができます。一方、PDTとPTTを組み合わせた新しい相乗的治療法は、ROSの量子収率とHSの治療効果の両方を向上させる可能性を秘めています。

PTTは、さまざまな疾患に対する並外れた治療的アプローチでもあります[14、15]。これまで、HSの臨床治療にうまく適用されてきました[16]。そのメカニズムは、光エネルギーの収集、熱の生成を進化させ、組織の気化、凝固、HSFアポトーシス、およびコラーゲンの変性をもたらします。ただし、PTTは、高レベルレーザーによるHS組織への選択性が低いため、滲出、潰瘍、灼熱感などのHS治療に深刻な副作用があります[4]。最近、ナノテクノロジーを橋渡しするPTTは、光熱効果に対して高度に選択的で低侵襲性の潜在的なHS治療と見なされています。さらに重要なことに、効果的な光吸着剤としてのAuナノ粒子（AuNPs）に基づいて、PTTは2つの理由でROSの量子収率を高めることが確認されています。依存的に、[17]（b）AuNPはALAと結合し、局在表面プラズモン共鳴（LSPR）によりROSの量子収率を高めることができます[18、19]。したがって、ALA / AuNPベースの相乗的光線力学/光熱療法（PDT / PTT）は、HS治療におけるPDTとPTTの両方の現在の制限を克服する可能性を秘めています。

最近、AuNPベースの相乗的PDT / PTTは、注射法によるさまざまな癌治療で広く使用されています[20、21]。癌とは異なり、HSは局所投与の使用に適しています[22]。ただし、HS真皮のコラーゲン束は、ALAおよびAuNPの浸透に対する大きな障壁を示し、HSのPDT / PTT相乗的治療効率を制限します。したがって、ALAとAuNPを同時にHSに浸透させる方法は、最大の治療効果と最小の副作用を備えた相乗的なPDT / PTTにとって重要です[23、24]。さらに、適切なALA / AuNPベースの相乗的PDT / PTTは、次の条件を満たす必要があります。（a）AuNPは、ALA-PDTで使用されるHe-Neレーザーによって熱を発生する可能性があり、（b）デリバリーシステムは高い必要があります。生体適合性。しかし、報告されているさまざまな光増感剤/ AuNPは、浸透性と生体適合性の低さのために、局所経皮送達とHS治療では適用できません[25]。

ここでは、優れた生体適合性と透過性を備えたALA / AuNPロードES（A / A-ES）が、この作業でHSの相乗的なPDT / PTT用に開発されています。生体適合性のあるA / A-ESは、AuNPとALAをロードしたESの両方によって、毒性物質を使用せずに超音波処理プロセスを介して調製されます。調製されたA / A-ESは、A / A-ESに同時ロードされた隣接するAuNP間のプラズモニックカップリングの結果として、600〜650nmの範囲で強い吸光度を示します。これにより、He-Neレーザーを使用してA / A-ESを刺激し​​、熱とROSを同時に生成して、HSFアポトーシスを促進することができます。 A / A-ESは、in vitro試験で、ALAとAuNPをHSに同時に送達する優れた透過性を示します。最後に、HSFをターゲットとして、HSのinvitro効率PDT / PTTを、細胞内プロトポルフィリンIX（PpIX）の蓄積、ROSの量子収率、およびHSFのアポトーシスによって調査します。さらに、HSFへの浸透性もTEMで観察されます。相乗効果により、A / A-ESはALAとAuNPの両方がHSとHSFに同時に浸透するのを促進し、個々のPTTまたはPDTと比較してより高いレベルの細胞アポトーシスを引き起こします。一言で言えば、A / A-ESは、局所ALAおよびAuNP投与のための有望な経皮送達システムであり、HSの相乗的PDT / PTTに大きな可能性を秘め、HS治療の新しいウィンドウを開きます。

結果と考察

A / A-ESの特性評価

超音波処理は、2つの理由からA / A-ESを準備する際の重要なパラメーターでした。（a）AuNPは、毒性物質なしで超音波処理によって形成でき、A / A-ESに生体適合性を与えました。 （b）超音波処理は脂質二重層を再配列して、より小さなサイズと比較的大きな内部コアを持つより多くの小胞を形成し、より多くのALAとAuNPをロードする可能性があります。この作業では、AuNPは、次のスキームで説明されているように形成されました。（a）H ₂ のホモリシスにより、気泡内で反応性の高いH•およびOH•ラジカルが生成されました。 O（Eq。1）、（b）酸化ラジカルH•はCH ₃ のアルファHを引き抜く可能性があります CH ₂ OHと還元ラジカルCH ₂ を形成します •CH ₂ OH（Eq。2）、および（c）気泡内の熱分解中、ラジカルCH ₂ •CH ₂ OHはAu ³⁺ を減らす可能性があります AuNPを形成する（式3）[26]。

最初に、A / A-ESはUV-Visによって検証されました（図1a）。同じA / A-ES内の隣接するAuNP間のプラズモニックカップリングの結果として、600〜650nmの範囲で強い吸光度を示しました[20]。したがって、632 nmのレーザー照射を使用して、HSのPDTとPTTを同時に使用できます。さらに、図1bのDLS分析によると、A / A-ESは比較的狭いサイズ分布を示し、平均サイズは166±83nmでした。興味深いことに、2つのサイズ分布は、アンロードされたAuNPとA / A-ESに起因していました。また、2つの分布の大きな違いは、A / A-ESの量がアンロードされたAuNPの量よりもはるかに多いことを示唆しています。 PDTの効率は、A / A-ESにロードされたALAの量に依存していました。膜貫通pH勾配能動負荷法の恩恵を受けて、ALAのEEは20％であり、報告された研究のものよりも高かった（10％未満）[27]。 A / A-ESの形態も研究されました。 SEM画像（図1c）では、A / A-ESは200nmのサイズの無傷の球状層状小胞として現れ、AuNPを明確に観察してESにロードすることができました。図1dでは、AuNPに加えて、ラメラがAuNP表面まで伸びていました。これは、ESの特徴でした[28、29]。さらに、異なる数のAuNPをロードする準備されたA / A-ESは、追加ファイル1：図S1で同様のサイズでした。そのため、A / A-ESは超音波処理下で安定した変形可能な構造に調整され、A / A-ESがHSの狭いスペースを圧迫しやすくなりました。要約すると、A / A-ESは、20％EEのALAと600〜650nmでの強い吸光度で正常に調製されました。その形態はまた、浸透性を非常に助長します。これは、以下のin vitro PDT / PTT研究と一致していました。

a ES、ALA、およびA / A-ESのUV-Visスペクトル。 b 準備されたA / A-ESのサイズ分布。 c 、 d A / A-ESのSEMおよびTEM画像

A / A-ESのinvitro経皮浸透性研究

A / A-ESの保持は、A / A-ESの浸透性と処理効率を評価するための重要なパラメータでした。したがって、フランツ拡散セルを使用して、異なる時間のHSにおけるALAとAuNPの両方の保持量を調査しました。図2aに示すように、ESの浸透促進機能により、ALAとAuNPの両方が最初の2時間で急速に最大保持に達しました。最大値に達した後、A / A-ESがHS全体に浸透したため、ALAとAuNPの両方の保持は継続的に減少しました。結果は、A / A-ESが十分な浸透性を持っていることを示しました。 ALAの適用用量（2 mg）と比較して、48％のALAはHS組織にあり、HSのPDTを支持していました。さらに、ALAとAuNPの間の同じ保持の変化は、顕微鏡の結果と一致するように、ALAとAuNPの両方がESにロードされたことを示唆しました。結果によると、A / A-ESの最大保持量で、2時間は局所使用のための適切な投与時間でした。私たちの以前の研究では、ESはHS組織への薬物浸透を促進するための非常に効率的な薬物担体と見なされていました[13]。したがって、HSにおけるA / A-ESの分布と作用も、この研究でTEMを使用して研究されました。図2bに示すように、A / A-ESは無傷の構造として真皮に見られ、A / A-ESが表皮を通ってHS真皮に安定して浸透できることを示しています。図2cに示す真皮下部では、ESとAuNPが分離状態として観察され、A / A-ESがALAとAuNPの両方を放出することを示唆しています。興味深いことに、AuNPは、ESにロードされていなくても、真皮に凝集する可能性があります。さらに、より多くのAuNPが図2dの真皮に蓄積することがわかりました。これは、隣接するAuNP間のプラズモニック結合を提供して、光エネルギーを収集し、熱を発生させる可能性があります。簡単に言えば、in vitro経皮浸透性研究は、A / A-ESがHS組織へのALAとAuNPの両方の浸透を促進する非常に効率的な薬物担体であり、真皮の凝集性AuNPが熱の発生に有利であることを示しました[20]。したがって、A / A-ESはHSの相乗的PDT / PTTに大きな可能性を示しました。

a ALAおよびAuNPの保持量。 b HS組織におけるA / A-ESの分布。 c HS組織におけるESおよびAuNPの分布。 d HS組織に蓄積するAuNPs

HSFのinvitroPDT / PTT

生体適合性アッセイ

AuNPの生体適合性は報告された研究で十分に証明されていますが、HSFに対するA / A-ESの生体適合性もこの研究で研究する必要があります[30、31]。さまざまな濃度のALA-ES、Au-ES、およびA / A-ES（0.1〜10 mMのALA濃度に基づく、Au-ESはA / A-ESと同じAuNP濃度）をHSFと12時間インキュベートしました。照射なし。その結果、2.0 mM以下の濃度では暗細胞毒性はなく、細胞生存率は90％を超えていることがわかりました。濃度が2.0mMを超えると、細胞の生存率のわずかな低下が検出されました。結果は、A / A-ESが優れた生体適合性を持っていることを示しており、PDT / PTTは、以下の研究で2.0 Mmの濃度で実行する必要があります（培地中の約14％A / A-ES、 v / v 。）図3。

暗所で12時間ALA-ES、Au-ES、A / A-ESで処理した場合のHSFの細胞生存率

HSFのPDT / PTT

A / A-ESは、A / A-ESとHSF膜の融合によって表面透過性の障壁を克服し、ALAとAuNPを細胞質に直接遊離させることができます[32]。 ALA-PDTのメカニズムによると、A / A-ESから放出されたALAは、HSF細胞質でPpIXに変換される可能性があります。レーザーを使用すると、PpIXは細胞毒性ROSを生成し、細胞アポトーシスを引き起こしました。したがって、CLSMを使用して、図4のPpIXとROSの両方の蓄積を研究しました[33、34]。レーザー照射前は、PpIXの赤色蛍光は主にHSFの細胞質に分布していた。 ALA-ESおよびA / A-ESで治療されたHSFのPpIXは、Au-ESで治療されたHSFの自家PpIXよりもはるかに多かった。さらに、すべてのHSFのROSは、レーザー照射なしではほとんど見つかりませんでした。これも合理的でした。レーザー照射後、ALA-ESおよびA / A-ESで処理されたHSFのPpIX強度は低下し、これらの細胞のROSは強い強度で簡単に見つけることができました。一方、Au-ESで治療されたHSFは、十分な自家PpIXがなかったため、PpIXとROSでは反応がありませんでした。興味深いことに、A / A-ESは、AuNPに起因するROS強度の比較において、ALA-ESよりも多くのROS生成を促進する可能性があります。さらに、細胞の形態もより多くの情報を提供しました。 ALA-ESで処理されたHSFは共形性を示したが、Au-ESで処理されたHSFは原形質膜からの不健康な突起を示した。対照的に、A / A-ESで処理されたHSFは、死にかけている細胞の特徴である、突出および収縮する「ブレブ」として示されました[35]。 ROSの生成と細胞形態のこれらの違いは、AuNPに基づくPTTに起因します。これは、図5の赤外線イメージングでも調査されました。AuNPs-PTTのメカニズムによると、HSF細胞質内のAuNPsは632 nmのレーザーを吸収し、十分な熱を発生させることができます。照射下で細胞をアポトーシスまたは壊死させる。したがって、ALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESの光熱効果は、赤外線熱画像カメラを使用して監視されました。比較したALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESは、照射時に明らかに高い温度（Au-ESおよびA / A-ESでは41.3°C、ALA-ESでは36.5°C）を示しました。レーザーを取り外した後、すべての温度が1分で通常の値に急速に低下しました。これは、レーザー照射治療が安全である可能性があることを示唆しています[36]。したがって、ESにロードされたAuNPは、アポトーシスおよび壊死アッセイによっても提供される効果的なPTTを提供する可能性があります。要約すると、A / A-ESはROSの量子収率を高め、光線熱効果を提供して、HSFのPDT / PTT相乗治療の優れた効率を達成することができます。

ALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESで6時間処理し、照射なし/照射ありで追跡したHSFの共焦点画像。スケールバーは100μmです

。 （ a の下で6時間ALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESで処理されたHSFの赤外線顕微鏡画像 ）および照射後（ b ）

アポトーシスおよび壊死アッセイ

PDT / PTTの効率は、レーザー照射下でALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESによって処理されたHSFのアポトーシスと壊死によってさらに研究されました。アネキシンV-FITCのフローサイトメトリー分析とヨウ化プロピジウム（PI）二重染色を使用して、アポトーシスアッセイを実施しました（図6）。対照の結果は、レーザー照射が細胞生存率に影響を与えなかったことを示しました（図6a）。照射前に、ALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESは良好な生体適合性を示しました。照射後、壊死とアポトーシスの両方のALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESの比率で処理されたHSFには、有意差がありました。簡単に言えば、A / A-ESで治療されたHSFの壊死とアポトーシスの両方の割合が最も高く、これはCLSMの結果と一致していました。図6eでは、実験の統計分析により、壊死細胞死がA / A-ESによる治療で61.8％に増加したことが明らかになり、A / A-ESが個々のPDTよりもHSFに対して優れた相乗的PDT / PTT効率を示した（ 47.7％の壊死性細胞死）およびPTT（24.3％の壊死性細胞死）。興味深いことに、この結果は、PDTがPTTと比較してHS治療においてより効果的な役割を果たし、AuNPベースのPTTがPDTの効果を助ける可能性があることも示しています。これらの結果は、A / A-ESがROSの量子収率を高め、光線熱効果を提供して、HSFのPDT / PTT相乗治療の優れた効率を達成できると説明されるかもしれません。 A / A-ESのALAのEEはALA-ESのEEよりもはるかに低かったが（20対54％）、A / A-ESとALA-ESの両方で同様の壊死性細胞死があった（61.8対78）。 ％）。この結果は、A / A-ESがAuNPの光熱効果とLSPRによってROSの量子収率を高める可能性があることから説明できます。

ALA-ESで処理されたHSFのアポトーシスアッセイ（ b ）、Au-ES（ c ）、およびレーザー照射なし/レーザー照射ありのA / A-ES（ d ）、および生存、初期アポトーシスおよび後期アポトーシスおよび壊死の統計分析（ e ）。 a コントロールでした。レーザー（-）および（+）は、レーザー照射なし/レーザー照射ありを意味します

HSFでのA / A-ESの視覚化

PDT / PTTによって引き起こされるHSFの形態と構造の詳細な変化も、図7の光学顕微鏡とTEMの両方で調査されました。照射前に、HSFはA / A-ES成長で十分に処理され、共形性がしっかりと付着しており、A / A-を示しています。 ESは予想通り優れた生体適合性を示しました（図7a）。彼らのTEM画像では、正常な細胞質のさまざまな細胞小器官に加えて、処理されたHSFは細胞質に多くのAuNPが凝集していました（図7cの空白のフレーム）。 A / A-ESと細胞膜の融合により、より多くのAuNPとALAがHSFに送達される可能性があると説明できます。したがって、AuNPは、より強力なプラズモニックカップリング効果により、より効果的な光熱源として機能し、LSPRによるROSの量子収率を高めることができます。興味深いことに、図7cの破線のフレームに示されているように、一部のAuNPはエキソサイトーシスのためにHSFから外れており、A / A-ESの優れた生体適合性をもう一度示しています。照射後、HSFは死にかけている細胞の特徴、すなわち原形質膜からの突起を示した（図7b）[37]。 ROSと光熱効果により、HSF死のその他の指標として、ミトコンドリアの腫れと外膜の破裂がHSF細胞質に見られました（図7d）[35]。さらに、ESはその特徴的な膜構造（図7dの赤い枠）でも見られました。要約すると、A / A-ESは、ALAとAuNPがHSFに侵入するのを容易にし、相乗的なPDT / PTTによってHSFを破壊する可能性があります。

以前にA / A-ESで処理されたHSFの光学顕微鏡画像（ a ）および照射後（ b ）。以前にA / A-ESで処理されたHSFのTEM画像（ c ）および照射後（ d ）

結論

生体適合性A / A-ESは、HSに浸透してHSFを破壊することにより、HSのinvitro相乗的PDT / PTT用に容易に準備されました。超音波処理を利用して、AuNPを合成し、毒性物質がない状態で同時にロードしました。 A / A-ESは、ALAのEEが高い（約20％）ES内の隣接するAuNP間のプラズモニックカップリング効果として、600〜650nmで強い吸光度を示しました。インビトロ経皮浸透性研究は、A / A-ESがHS組織へのALAとAuNPの両方の浸透を増強するための非常に効率的な薬物担体であることを示しました。 HSFのinvitro PDT / PTTは、A / A-ESがAuNPの光熱効果とLSPRによってROSの量子収率を高め、高レベルの細胞アポトーシスまたは壊死を引き起こす可能性があることを示しました。一言で言えば、生体適合性A / A-ESは、HSFの相乗的なPDT / PTT効率が、個々のPDTおよびPTTよりも優れており、HSの治療の見通しを奨励しています。さらなる研究は、瘢痕モデルにおけるHSの相乗的PDT / PTTのinvivo研究に焦点を合わせ、関連する研究が進行中です。

実験と方法

A / A-ESの準備

1.8 mL CH ₃ に溶解した180ミリグラムのホスファチジルコリン（PC、95.8％大豆レシチン、Lipoid GmbH、ドイツ） CH ₂ OH、0.6 mL HAuCl ₄ （10 mM、アラジン、上海、中国）、および3.6 mLのALA-クエン酸緩衝液（CBS、0.01 M、12 mg ALA、pH 4.0）を、PC溶液に滴下して加えました。混合物を700rpmで10分間撹拌して、前駆体溶液を調製しました。スキーム1に示すように、前駆体溶液を200 Wの超音波環境に30分間入れて、鮮やかなワインレッド色にしました。次に、遠心分離機（8000 rpm、20分）を使用して反応溶液を実行し、残留HAuCl ₄ を除去しました。 とPC。最後に、沈着物を3 mlのALA水性アルコール溶液（ALA-HA、2 mg / ml ALA、30％エタノール）に再分散させ、以前の研究[13]に従って膜貫通pH勾配能動負荷法でインキュベートしました。インキュベーションでは、多くの外部の非イオン化ALAがES二重層を介してESの内部酸性水性コアに拡散し、次にプロトン化されてESに閉じ込められました。インキュベーション後、A / A-ESが調製されました。この作業では、ALA-ESは、A / A-ESと同じALA濃度で以前の作業に従って準備されました。 AuNPをロードしたES（Au-ES）は、A / A-ESと同じAuNP濃度でALAなしのA / A-ESとして調製されました。

A / A-ESの準備の概略図

A / A-ESの特性評価

A / A-ESはリンタングステン酸（1.5 wt％）でネガティブ染色され、透過型電子顕微鏡（TEM、JEOL、日本、加速電圧120 kV）で観察されました。 A / A-ESは、走査型電子顕微鏡（SEM、JEOL、日本、加速電圧10 kV）でも調べました。 A / A-ESサイズ分布は、NiComp 380ZLS検査システム（Nicomp、米国）での動的光散乱（DLS）分析によって決定されました。 ALAは、フルオレセアミン誘導体化アプローチによって決定され、詳細は追加ファイル1に示されています。限外ろ過法によって決定されたALAの捕捉効率（EE）は、追加ファイル1に示されています。最後に、UV-VisスペクトルがVarian Cary 50 UV-Vis分光光度計（Perkin Elmer、米国）。

フランツ拡散セルによるinvitro浸透性研究

A / A-ESの透過性研究は、2.8 cm ² のフランツ拡散セルを使用して実施されました。 効果的な浸透領域。ドナーおよび受容体コンパートメントを含む受容体細胞は、循環水浴によって37℃に維持されました。 HS組織は、上海第9人民病院で情報に基づく同意を得て収集され、1975年のヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインが上海第9人民病院によって承認されました。脂肪組織のない新鮮なHS組織（切除後24時間以内）を、角質層がドナーコンパートメントの上方にある受容体コンパートメントにマウントしました。 1ミリリットルのA / A-ESをドナーコンパートメントに加え、蒸発を防ぐためにドナーコンパートメントをパラフィルムで覆った。異なる時間で浸透させた後、HS組織を迅速に洗浄してHS表面に残っているA / A-ESを除去しました。 HS内のALAとAuNPの保持量を蓄積するために、HS組織を細かく切断し、HS組織内のALAをPBSで24時間透析して抽出しました。抽出液をHS組織中のALAの保持量について分析しました。透析バッグに保持されたHS組織は、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）によってAuNPの保持量についても分析されました。 ALA-ESを2時間浸透させた後、HS組織を洗浄し、接頭辞を付け、脱水し、浸透させ、後固定しました。エポキシ樹脂に埋め込んだ後、超断面（厚さ50 nm、表皮に垂直）として切断し、加速電圧120kVでTEMを使用して観察しました。

HSFのinvitroPDT / PTT

細胞培養

HSFは、次の一般的な方法で分離および培養されました。新鮮なHS組織片（1 mm ³ 、切除後6時間以内）、コラゲナーゼI型（Invitrogen、USA）を使用して消化し、単細胞懸濁液を達成しました。 HSFは、37°C​​および5％CO ₂ で10％ウシ胎児血清（FBS、Gibco、USA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Invitrogen、USA）で増殖しました。 。培地は3日ごとに交換する必要があり、80％がコンフルエントになったときに細胞を継代しました。以下の実験では、継代した2細胞と3細胞を使用しました。

生体適合性アッセイ

A / A-ESの生体適合性の評価では、HSFを96ウェルプレートに2×10 ³ で播種しました。 細胞/ウェル。培地をFBSを含まない培地に交換し、新たに調製したALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESをそれぞれ異なる濃度で使用しました。 12時間後、細胞生存率をセルカウントキット-8（CCK-8、Dojindo、日本）を使用して、製造元の指示に従って測定しました。

PDT / PTT手順

HSFは4×10 ⁴ で12ウェルプレートに播種されました 細胞/ウェル。 12時間後、それぞれ、新たに調製したALA-ES、Au-ES、およびA / A-ESを含む培地（14％、 v / v ）、6時間FBSフリーの培地に交換しました。処理後、HSFをPBSで洗浄し、培地で1時間インキュベートしました。次に、He-Neレーザー（波長632 nm、40 mW / cm ² ）を照射しました。 、上海レーザー技術研究所、中国）、20分。次に、その後の実験に備えて、培地を10％FBSを含む新しいDMEMにさらに24時間交換しました。さらに、A / A-ESと照射で処理されたHSFは、TEM検査用の超切片を準備するために、接頭辞が付けられ、脱水され、埋め込まれました。

細胞内PpIXおよびROS生成アッセイ

HSFにおける細胞内PpIX蓄積とROS生成は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM、Leica TCS SP5、ドイツ）を使用して検出されました。 ROS生成アッセイは、DCFH-DAを使用して実行され、製造元の指示に従いました。細胞を含むカバーガラスをスライドガラスにマウントし、PpIXでは405nm励起/ 635 nm発光、ROSでは488nm励起/ 560nm発光で観察しました。すべてのデータはLASAFソフトウェアによって分析されました。

アポトーシスおよび壊死アッセイ

HSFのアポトーシスと壊死は、アネキシンV-FITCとヨウ化プロピジウム（PI）の二重染色後のフローサイトメトリーによって分析されました。アネキシンV-FITC / PIアポトーシス検出キットのプロトコルに従ってサンプルを調製し、BD FACSCalibur（BD Biosciences、Mountain View、USA）で分析しました。データ分析はFlowJo7.6ソフトウェアを使用して実行されました。

統計分析

特に明記しない限り、データは平均±SDとして表されました。統計的有意性は、両側スチューデントの検定（ P ）を使用して決定されました。 <0.05）特に明記しない限り。

略語

A / A-ES：

5-アミノレブリン酸/ Auナノ粒子をロードしたエトソームベシクル

ALA：

5-アミノレブリン酸

ALA-ES：

ALAをロードしたES

ALA-PDT：

ALAベースのPDT

Au-ES：

AuNPをロードしたES

AuNPs：

金ナノ粒子

CLSM：

共焦点レーザー走査顕微鏡

DLS：

動的光散乱

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

EE：

閉じ込め効率

ES：

エトソーム小胞

FBS：

ウシ胎児血清

HS：

肥厚性瘢痕

HSF：

肥厚性瘢痕線維芽細胞

ICP-MS：

誘導結合プラズマ質量分析

LSPR：

局在表面プラズモン共鳴

PDT：

光線力学療法

PDT / PTT：

光線力学/光熱療法

PpIX：

プロトポルフィリンIX

PTT：

光熱療法

ROS：

活性酸素種

SEM：

走査型電子顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡