細胞イメージング用の近赤外発光Cr3 + / Eu3 +共ドープ亜鉛ガロゲルマネート持続性発光ナノ粒子

背景

持続性の発光物質は、励起が停止してから数時間まで長時間発光する可能性があります[1]。主に研究への関心が高いため、リン光物質は、セキュリティ標識、緊急ルート標識、識別マーカー、医療診断などの幅広い用途向けに、夜間または暗環境の視覚材料として商品化されています[2]。典型的な長期持続性リン光物質は、赤色のY ₂ などの市販の一次カラーエミッターです。 O ₂ S：Eu ³⁺ 、Mg ²⁺ 、Ti ⁴⁺ またはCaS：Eu ²⁺ 、Tm ³⁺ 、Ce ³⁺ [3、4]、緑色のSrAl ₂ O ₄ ：Eu ²⁺ 、Dy ³⁺ またはMgAl ₂ O ₄ ：Mn ²⁺ [5、6]、および青いCaAl ₂ O ₄ ：Eu ²⁺ 、nd ³⁺ またはSrMgSi ₂ O ₆ ：Eu ²⁺ 、Dy ³⁺ [7、8]リン光物質。可視の持続性リン光物質で多くの成功が収められていますが、近赤外（NIR）領域（〜700–2500 nm）での持続性リン光物質の調査と開発は不十分です。近年、赤色またはNIR発光を示す持続性リン光物質の潜在的な用途は、暗視セキュリティ標識からin vivoイメージングシステムに拡大しています[1、9、10]。

インビボ薬剤として光増感剤が付着した持続性発光材料は、光線力学療法のために陳と張によって最初に試みられた[11]。次に、Scherman etal。 Ca _0.2 のNIR発光リン光物質を使用したinvivoバイオイメージングに関する画期的な研究を報告しました Zn _0.9 Mg _0.9 Si ₂ O ₆ ：Eu ²⁺ 、Mn ²⁺ 、Dy ³⁺ [12]。その後まもなく、CaMgSi ₂ の2つの新しいNIR発光リン光物質 O ₆ ：Eu ²⁺ 、Mn ²⁺ 、Pr ³⁺ およびCa ₂ Si ₅ N ₈ ：Eu ²⁺ 、Tm ³⁺ パフォーマンスが向上したものが同じグループによって開発されました[13、14]。最近、Cr ³⁺ スピネルZnGa ₂ を含む、NIR発光と長い残光を伴うドープされたガレート持続性リン光物質 O ₄ ：Cr ³⁺ およびそれらのバリアント（Zn ₃ など） Ga ₂ Ge ₂ O ₁₀ ：Cr ³⁺ 、Zn ₃ Ga ₂ GeO ₈ ：Cr ³⁺ 、Yb ³⁺ 、Er ³⁺ 、およびZnGa _{2 − x} （Ge / Sn） _x O ₄ ：Cr ³⁺ 、固体法[1、9、10、15、16、17、18、19、20、21]によって調製されました。セラミックディスクサンプルは、NIR領域で最大360時間の残光時間を示しましたが、かさばる材料はinvivoバイオイメージングには適していません。 ZnGa ₂ のNIR発光長持続性発光ナノ粒子 O ₄ ：Cr ³⁺ [22、23]、ZnGa ₂ O ₄ ：Cr ³⁺ 、Sn ⁴⁺ [19,20,21]、およびZn _2.94 Ga _1.96 Ge ₂ O ₁₀ ：Cr ³⁺ 、Pr ³⁺ [9]は、その後の還元性雰囲気のない煆焼と組み合わせたゾルゲル法によって合成されました。ナノ粒子粉末の持続的な発光は、生物学的透明性ウィンドウ内で非常に長い残光時間で明るいNIR発光を示します。 PEG化は、ナノ粒子の生体適合性と水溶性を大幅に改善します。これにより、insitu励起を必要とせずに、高いSNRを備えた長期のinvivoバイオイメージングアプリケーションに大きな可能性があります。アルカリ土類イオン、ランタニドイオン、Li ⁺ からなるグループから選択されたイオンと考えられています。 Cr ³⁺ との共ドーピング 没食子酸亜鉛および没食子酸亜鉛では、顕著なNIR持続発光が得られます[1]。 Eu ³⁺ 酸化物ホストでは、 ⁵ から生じる〜700nmで常に赤色の発光を示します。 D ₀ - ⁷ F ₄ イントラ-4 f 250 nmの電荷移動（CT）バンドへの短いUV励起による電子遷移[24]。一方、Cr ³⁺ は、スピン禁制 ² による狭帯域放射（通常は700 nm）のため、固体の好ましい発光中心です。 E- ⁴ A ₂ 遷移、またはスピン許容 ⁴ による広帯域発光（650〜1600 nm） T ₂ - ⁴ A ₂ 遷移[1、20]。これらを考慮して、Cr ³⁺ / Eu ³⁺ 共ドープされた亜鉛ガレートと亜鉛ガロゲルマネートは、O ^2- の電荷移動バンド（CTB）により、強いNIR持続発光を生成します。 -Eu ³⁺ O ^2- のCTBとオーバーラップします -Ga ³⁺ 、および ⁵ からの〜700nmでの発光 D ₀ - ⁷ F ₄ Eu ³⁺ の遷移 ² のものと重複しています E- ⁴ A ₂ Cr ³⁺ の遷移 。さらに、Eu ³⁺ Ga ³⁺ の代わりとなるイオン 歪んだ八面体サイトのイオンは、Cr ³⁺ の周りに適切なホスト結晶場強度をもたらす可能性があります イオン、したがってNIR放出に影響を与えます。この作品では、Zn ₃ Ga ₂ Ge ₂ O ₁₀ ：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ （ZGGO：Cr ³⁺ と呼ばれます 、Eu ³⁺ ）ナノ粒子は、将来のバイオイメージングのための有望なナノプローブとして使用される、その後の還元性雰囲気のない煆焼と組み合わせたゾルゲル法によって合成されました。サンプルは、X線回折法（XRD）、透過型電子顕微鏡（TEM）、STEM、選択領域電子回折（SAED）、フォトルミネッセンス励起（PLE）/フォトルミネッセンス（PL）分光法、および温度の組み合わせ技術による詳細な特性評価によって調査されました。依存性PL分析。次のセクションでは、ZGGO：Cr ³⁺ の合成、特性評価、およびアプリケーションについて報告します。 、Eu ³⁺ ナノ粒子。

実験的

合成

出発金属源はZn（NO ₃ ） ₂ ・6H ₂ O、Cr（NO ₃ ） ₃ ・9H ₂ O、Ga ₂ O ₃ 、Eu ₂ O ₃ 、およびGeO ₂ すべてSinopharm（上海、中国）から購入した99.99％の純粋な製品でした。他の試薬は分析グレードであり、瀋陽化学試薬工場（瀋陽、中国）から購入しました。 Zn（NO ₃ ） ₂ ・6H ₂ OおよびCr（NO ₃ ） ₃ ・9H ₂ Oを脱イオン水に溶解した。 Ga ₂ O ₃ およびEu ₂ O ₃ 硝酸溶液に溶解しました。 GeO ₂ エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を希水酸化アンモニウムに溶解しました。混合溶液に、沈殿することなくEDTA溶液をゆっくりと加え、EDTAに対する全金属イオンのモル比を1：2に維持した。 Zn：Ga：Ge：Cr：Euの原子モル比は3：1.984：2：0.01：0.006に固定されました。最終的な溶液を室温で1時間激しく撹拌し、次に85°Cのオーブンで加熱して、溶液が最終的にゲルになるゾルになるまで水のゆっくりと蒸発させました。得られたゲルを200℃で3時間加熱して、黒色の多孔質材料を形成しました。最後に、多孔質材料は、流れるO ₂ の下で粉砕され、アニールされました。 選択した温度で2時間ガス（200 mL / min）。

表面機能化

ZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 粉末を30分間粉砕した後、得られたサンプル150mgを0.1mol / LNaOH溶液50mLに加えました。 1時間超音波処理した後、懸濁液を室温で24時間激しく攪拌しました。得られたコロイド溶液を1000rpmで10分間遠心分離して大きなサイズの粒子を除去し、上澄みを10,000rpmで10分間遠心分離して沈殿物を収集しました。得られたままのZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ -OHナノ粒子を脱イオン水で3回洗浄しました。

10ミリグラムのZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ -OHナノ粒子を4mLのジメチルホルムアミド（DMF）に分散させ、10分間の超音波処理を行いました。次に、40μlの3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）を、室温で24時間激しく攪拌しながら添加しました。得られたままのZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ -NH ₂ 10,000 rpmで10分間遠心分離してナノ粒子を収集し、DMFで3回洗浄して、未反応のAPTESを除去しました。

細胞イメージング

Hek293T細胞を10％FBSを含むDMEMで培養し、35mm培養皿にCO ₂ で2時間播種しました。 インキュベータ。得られたままのZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ -NH ₂ ナノ粒子を細胞培地（50 mg / mL）に分散させ、254 nmのUVランプで10分間励起した後、1時間処理した培養皿に移しました。細胞培地を除去した後、0.1 mLの1％ホルムアルデヒド-PBSを添加し、細胞を0.5 mLDAPI色素で暗所で10分間染色しました。最後に、細胞をPBSで数回洗浄して、さらに特性を評価しました。

動物に関するすべての研究は、大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。

特性評価手法

相の同定は、ニッケルでろ過されたCuKα放射線と6.0°2 θのスキャン速度を使用して40kV / 40 mAで動作するXRD（モデルSmartLab;リガク、東京、日本）によって実行されました。 /分。製品の形態は、TEM（モデルJEM-2000FX; JEOL、東京）を介して観察されました。リン光物質のフォトルミネッセンスは、FP-8600蛍光分光光度計（JASCO、東京）で分析されました。持続発光シグナルは、Horiba JYFL3-21を使用して取得しました。残光減衰画像は、Kodak In-Vivo Imaging System FXProを使用して暗い部屋で記録されました。細胞イメージングは​​、レーザー走査型共焦点顕微鏡（LEICA TCS SP2、ドイツ）によって実施されました。

動物に関するすべての研究は、大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。

結果と考察

サンプルの相純度は、最初にXRDによって調査されました。図1（上）は、準備されたままのZGGO：Cr ³⁺ のXRDパターンを示しています。 およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 1000°Cで煆焼され、スピネル構造のZn ₃ とともに同定されました。 Ga ₂ Ge ₂ O ₁₀ [1、9]。 Zn ₃ の結晶構造 Ga ₂ Ge ₂ O ₁₀ ZnGa ₂ と同じです O ₄ （JCPDS No. 38-1240）、これはZnGa ₂ の固溶体です。 O ₄ およびZn ₂ GeO ₄ 。 Zn ₃ の構造 Ga ₂ Ge ₂ O ₁₀ 、GeはGaの置換の役割を果たし、トラップの形成を促進しますが、ZnGa ₂ O ₄ 支配的な結晶構造です[1]。 1ユニットのセルには2種類の陽イオンがあります。 Zn ²⁺ およびGa ³⁺ 四面体と八面体をそれぞれ形成する4つと6つの酸素陰イオンに囲まれています（下の図1）。 ZGGO：Cr ³⁺ のセル定数を生成する回折データからの計算 a です = b =〜0.8335 nm、スピネルZnGa ₂ のそれに近い O ₄ （ a = b =〜0.8335 nm、JCPDS No. 38-1240）。 Eu ³⁺ のイオン半径が大きいため （6重調整の場合、\（{r} _ {{\ mathrm {Eu}} ^ {3+}} \）=0.0947 nmおよび\（{r} _ {{\ mathrm {Ga}} ^ {3+} } \）=0.062 nm）[25]、 a の値が大きい = b =〜0.8336 nmがZGGO：Cr ³⁺ で観察されました 、Eu ³⁺ 。 （311）ブラッグ反射のプロファイル拡大分析は、ZGGO：Cr ³⁺ の平均結晶子サイズ83±6nmに対してシェラー方程式を適用することによって実施されました。 およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ サンプル。図1（上）では、900°Cで焼成された生成物がスピネル相（JCPDS No. 38-1240）と菱面体晶相（JCPDS No. 11-0687）の混合物であり、焼成温度を示していることもわかります。スピネルZn ₃ を生成するには、1000°C以上が必要です。 Ga ₂ Ge ₂ O ₁₀ 純粋な形で。

調製したままのZGGO：Cr ³⁺ のXRDパターン およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ スピネルZnGa ₂ の結晶構造 O ₄

図2（左）は、ZGGO：Cr ³⁺ のTEM形態を示しています。 、Eu ³⁺ 粒子。横方向のサイズが約80〜100nmの立方体の粒子で完全に構成されていることを明確に示しています。鋭い角とよく解像された格子縞は、それらの優れた結晶化度を示唆していますが、〜0.29 nmの間隔は、スピネル構造のZnGa ₂ の（220）プレーンによく対応しています。 O ₄ （ d （220）=〜0.29 nm、JCPDS No. 38-1240）（図2の挿入図）。粒子サイズはXRDデータから計算された平均結晶子サイズに近いため、得られたサンプルは単結晶である可能性があります。 SAED分析（図2（右））により、分析中のナノ粒子が単結晶であることがさらに確認されました。ここで調査したナノ粒子は、機械的な混合物ではなく、直接的な固体溶液です。 Zn、Ga、Ge、Cr、およびEuの元素マッピングは、ZGGO：Cr ³⁺ の図3に示されているように、この固溶体の証拠を提供します。 、Eu ³⁺ 。各粒子にはZn、Ga、Ge、Cr、Euが含まれているだけでなく、すべての元素が粒子間に均等に分布しています。

ZGGO：Cr ³⁺ のTEM、HR-TEM（左）画像、およびSAEDパターン（右） 、Eu ³⁺ ナノ粒子

STEM粒子の形態（明視野画像、最初の画像）とZGGO：Cr ³⁺ の元素マッピング 、Eu ³⁺ ナノ粒子

図4は、ZGGO：Cr ³⁺ の励起スペクトルを示しています。 およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 室温で粉末。 697 nmで監視される励起スペクトルは、非常に広いスペクトル領域（200〜650 nm）をカバーし、それぞれ273、328、410、および569nmでピークに達する4つの主要な励起バンドで構成されます。 273 nmの励起バンドは、O ^2- の電荷移動バンドに起因します。 -Ga ³⁺ ZnGa ₂ O ₄ ホスト、後のバンドはCr ³⁺ の内部遷移に由来します 、 ⁴ から発生する328nmバンドを含む A ₂ → ⁴ T ₁ （ te ² ）遷移、 ⁴ から発生する410nmバンド A ₂ → ⁴ T ₁ （ t ² e ）、および ⁴ から発生する569nmバンド A ₂ → ⁴ T ₂ （ t ² e ）[19、20]。 Eu ³⁺ の組み込み PLEバンドの位置はそれほど変化しませんでしたが、Cr ³⁺ の内部遷移の強度が大幅に増加しました。 、 I ₄₁₀ / 私 ₂₇₃ 0.18から0.56に増加します。上記の結果は、Eu ³⁺ 取り込みは、可視光の励起を助長します。ただし、273 nmで最も強い励起バンドは、O ^2- の電荷移動バンドも明らかにしました。 -Ga ³⁺ 最も効果的な励起波長です。 ² により、273 nmで粉末を励起すると、697 nmにNIR発光バンドが得られました（図5）。 E→ ⁴ A ₂ 歪んだCr ³⁺ の遷移 Eu ³⁺ がない場合の、ガロゲルマネート中のイオン 放出。

ZGGO：Cr ³⁺ のフォトルミネッセンス励起（PLE）スペクトル およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ パウダー

ZGGO：Cr ³⁺ のフォトルミネッセンス（PL）スペクトル 、Eu ³⁺ パウダー

ZGGO：Cr ³⁺ のNIR持続発光減衰曲線 およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 図6に示すように、ナノ粒子は、254 nmのUV光照射（光源としてキセノンランプ）後、室温で5分間697 nmで監視されました。この結果は、ZGGO：Cr ^{3のNIR持続発光を示しています。 +} サンプルは7200秒より長く続く可能性があり、それでもかなりの強度を保持します。 ZGGO：Cr ³⁺ の持続的な発光強度 、Eu ³⁺ Eu ³⁺ を組み込むと増加します イオン。ランタニドイオンはCr ³⁺ と共ドーピングすると考えられています ガロゲルマン酸亜鉛では、Cr ³⁺ の持続発光の原因となるアンチサイト欠陥の量を増やす上で重要な役割を果たしているため、顕著なNIR持続発光が得られます。 ガロゲルマン酸亜鉛ホスト[1]。一方、ZGGO：Cr ³⁺ のNIR持続発光 、Eu ³⁺ サンプルはZGGO：Cr ³⁺ よりも長持ちする可能性があります 、Eu ³⁺ 組み込むと、残光時間が長くなる可能性があります。図7は、ZGGO：Cr ³⁺ のNIR残光減衰画像を示しています。 、Eu ³⁺ Kodak In-Vivo Imaging System FX Proによって、UV照射を停止した後のさまざまな時間に得られた粉末。さらに、残光が120分以上持続し、強いNIR発光強度を維持できることを確認しました。

ZGGO：Cr ³⁺ のNIR持続発光減衰曲線 およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 254nmのUV光を5分間照射した後697nmで監視された粉末

ZGGO：Cr ³⁺ のNIR残光減衰画像 、Eu ³⁺ Kodak In-Vivo Imaging System FXProによってUV照射を停止した後のさまざまな時間に得られた粉末

リン光アプリケーションの性能を評価するために、特に高出力アプリケーションの場合、熱安定性は重要なパラメータです。この作業でのリン光物質の熱消光挙動を評価するために、PLスペクトルを298〜573 Kの範囲の温度で分析しました（図8）。すべてのサンプルで、温度を上げると697nmでの発光強度が低下しました。熱消光挙動のより包括的な画像を取得し、その活性化エネルギーの値を推定する（ E _a ）、アレニウスの式（式（1））は次のように使用されました[26,27,28]：

ここで私 ₀ および私 _T それぞれ、初期温度と最終温度の強度です。 c は速度定数です。 E _a 活性化エネルギーです。および k はボルツマン定数（8.629×10 ^-5 eV K ^-1 ）。図8は、In（ I ₀ / 私 _T − 1）vs 10,000 / T ZGGO：Cr ³⁺ の697nmを中心とする発光バンドの関係線 およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 。同様の活性化エネルギーが計算されました： E _a =0.23 eV for ZGGO：Cr ³⁺ および E _a =ZGGOの場合は0.25eV：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 。単位時間あたりに非放射遷移が発生する確率（α ）は、式に従って定義できます。 （2）次のように[29]：

ここで s は頻度因子（s ^-1 ）、 k はボルツマン定数であり、 T は温度です。より低い活性化エネルギー（ E _a ）確率が高くなります（α ）非放射遷移の。同様の活性化エネルギーのため、ZGGO：Cr ³⁺ およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 閉じた熱安定性を示し、Eu ³⁺ を示しています 組み込みは熱安定性に大きな影響を与えませんでした。ただし、670 nmを中心とする関連するフォノン側波帯（PSB）は、高温で支配的になるため、発光ピークが強化されます。

a の発光バンドの熱消光の活性化エネルギー ZGGO：Cr ³⁺ および b ZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ 粉末。挿入図は、298〜573KのPLスペクトルの対応する温度依存性を示しています

また、ZGGO：Cr ³⁺ の水性分散液のPL励起および発光スペクトルを調査しました。 、Eu ³⁺ （図9）。 ZGGO：Cr ³⁺ との比較 、Eu ³⁺ 粉末の場合、水性分散液は、300および600 nmでの比較的弱い励起強度を除いて、PL励起および発光曲線とほぼ同じプロファイルを示しました。強度が弱まっているのは、おそらく水のO–H振動の消光効果によるものです。

ZGGO：Cr ³⁺ の励起および発光スペクトル 、Eu ³⁺ 室温での水溶液。挿入図は、ZGGO：Cr ³⁺ のデジタル写真を示しています。 、Eu ³⁺ 254nmのUV光を照射した水溶液

ここでは、Hek293T細胞をinvitroイメージングテストに使用しました。得られたままのZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ -NH ₂ ナノ粒子を細胞培地（50 mg / mL）に分散させ、254 nmのUVランプで10分間励起した後、1時間処理した培養皿に移しました。図10（左、赤色）は、励起がない状態でレーザー走査型共焦点顕微鏡で収集された細胞発光イメージングを示しています。 Hek293T細胞の残光発光信号は、1時間後も正確に測定できるほど強力でしたが、残光発光信号は時間の経過とともに徐々に減少しました。比較のために、細胞発光イメージングは​​、レーザー走査型共焦点顕微鏡で、0.5 mLのDAPI色素で染色された同じ細胞から別のモードで収集されました（図10の右側、同時励起）。同様のイメージング信号は、ZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ -NH ₂ ナノ粒子は、invitroでの細胞に対する優れたイメージング能力を備えていました。

ZGGO：Cr ³⁺ とインキュベートしたHek293T細胞のLSCM画像（左、赤色） 、Eu ³⁺ -NH ₂ ナノ粒子を1時間。右の画像（青色）は、0.5mLのDAPI色素で染色された同じ細胞の外観です。スケールバー=25μm

結論

この作品では、スピネル構造のZGGO：Cr ³⁺ およびZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ ナノ粒子は、その後の還元性雰囲気のない煆焼と組み合わせたゾルゲル法によって合成された。サンプルは、XRD、TEM、STEM、SAED、PLE / PL分光法、および温度依存PL分析の組み合わせ技術による詳細な特性評価によって調査されました。均一な立方体の形状と横方向のサイズが約80〜100 nmのナノ粒子は、単結晶で均質な固溶体です。 ² により、273 nmで粉末を励起すると、697nmにNIR発光バンドが得られました。 E→ ⁴ A ₂ 歪んだCr ³⁺ の遷移 Eu ³⁺ がない場合の、ガロゲルマネート中のイオン 放出。 ZGGO：Cr ³⁺ のNIR持続発光 、Eu ³⁺ 7200秒より長く続くことができ、それでも強烈な強度を保持します。 ZGGO：Cr ³⁺ の持続的な発光強度 また、Eu ³⁺ を組み込むと、残光時間が長くなります。 イオン。ただし、Eu ³⁺ 組み込みは熱安定性に大きな影響を与えませんでした。最後に、取得したままのZGGO：Cr ³⁺ 、Eu ³⁺ -NH ₂ ナノ粒子は、invitroでの細胞に対する優れたイメージング能力を備えていました。