高効率腫瘍標的光化学療法剤としてのアルテスナート負荷および近赤外色素結合アルブミンナノ粒子

背景

この数十年の間に、画像誘導光化学療法（IGPC）は、個別化された腫瘍治療を実現するための有望な戦略であるため、多くの研究者から大きな関心を集めました[1、2]。 IGPCは腫瘍の正確な位置を特定し、in vivoで薬剤を追跡し、効果的な治療を保証し、副作用を軽減します[3、4]。効果的にするには、IGPCは次の特性を備えている必要があります。（i）イメージング機能と治療機能の両方を備えた多機能セラノスティック剤が必要です。 （ii）セラノスティック剤は、生体適合性があり、安定しており、腫瘍に対して特異的である必要があります[5、6、7、8]。 IGPCの画像診断モダリティには、通常、磁気共鳴画像法、光音響画像法、および蛍光画像法が含まれます[9、10、11、12、13、14]。高感度、良好な時間分解能、および高い信号対バックグラウンド比により、蛍光イメージングは​​通常、基礎研究および臨床診療に適用されました[15、16]。

光化学療法の方法には、主に光熱療法（PTT）、光線力学療法（PDT）、および化学療法が含まれます。近赤外線（NIR）照射は同じであるため、PTTとPDTの機能を1つに統合することができ、レーザービームによる腫瘍の選択的かつ効率的な破壊が可能になります。しかし、光熱および光線力学（PTT-PDT）療法には、腫瘍抑制が不完全であるという制限があり、腫瘍の再発を引き起こす可能性があることが報告されています[17、18、19]。癌に対して広く使用されている治療法である化学療法は、全身投与によって腫瘍細胞を効果的に殺すことができますが、その非特異性による近くの正常細胞への毒性はその適用を制限します[20、21、22]。したがって、IGPCの組み合わせは、上記の制限を克服するための優れた戦略となる可能性があります。

ナノメディシンの開発に伴い、インドシアニングリーン（ICG）、金属ベースのナノ粒子、カーボンナノ材料、ポリマーナノ材料などのIGPCセラノスティック剤が開発されました[23、24、25、26、27]。その中で、ICGはFDAによって承認されており、臨床現場での使用は心拍出量、肝機能、血流、および眼科血管造影を検出することが報告されています[28、29]。さらに、ICGはNIR領域で高い吸収効率を持っているため、1回のNIR照射で高いPTT-PDT効果を誘発します[30]。しかし、水溶液中での不安定性、体内での急速なクリアランス、自己漂白の傾向、および標的化の欠如などの以下の欠点は、その広範な適用を著しく妨げる[31、32]。これらの制限を克服するために、遊離ICG分子は通常、ミセル、ポリマーナノ粒子、および自己組織化タンパク質ナノ構造を含む媒体によって運ばれ、ナノコンポジットを形成します[33、34]。関連する研究が利用可能ですが、生体適合性が高く、新しいICGベースのナノコンポジットがinvivoイメージングおよび光線療法に依然として求められています。

この作業では、葉酸（FA）とICGをヒト血清アルブミン（HSA）ナノ粒子と共有結合させ、抗がん剤アルテスナート（Arte）（FA-IHA NP）もカプセル化した標的IGPC剤を報告しました。 FAは、ナノ粒子を結合して、受容体を介したエンドサイトーシスを介して細胞の取り込み効率を高めることが報告されています[17]。 HSAは内因性タンパク質です。その優れた生体適合性、非毒性、および非免疫原性のために、HSAは不溶性の抗がん剤を送達するための最も刺激的な担体の1つになりました[12、17、31]。 Arte、 Artemisia annua から抽出された天然薬 は、肝臓がん、肺がん、乳がんなどのさまざまながんの治療に大きな効果があることが証明されています[35]。準備されたFA-IHANPは、これら4つの臨床的に承認された材料で構成され、優れた生体適合性と安定性を示しました。多機能セラノスティックナノコンポジットとして、ICGはそのPTT-PDT特性により、NIR蛍光イメージング剤および光線療法剤として適用されました。 ArteはNPに高度にロードされ、化学療法のためにNIR照射によって放出されました。 NIRイメージングの結果に基づいて、ターゲットとなるIGPCの組み合わせの高い効果がinvitroとinvivoの両方で実証されました。私たちの結果によると、FA-IHA NPは、制御された薬物送達および画像誘導腫瘍標的併用光化学療法において、潜在的な用途の広い治療薬である可能性があると考えています。

メソッド

資料

N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、およびアルテスナート（Arte、≥99％）は、Sigma-Aldrich（USA）から入手しました。 4 '、6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）およびCell Counting Kit-8（CCK-8）は、Aladdin（Shanghai、China）から購入しました。 NH ₂ –PEG ₂₀₀₀ –COOHおよびNH ₂ –PEG ₂₀₀₀ -FAは、Xi’an Ruixi Biological Technology Co.、Ltd。（Xi’an、China）から購入しました。 DMEM培地とリン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、Gibco BRL（NY、USA）から提供されました。 ICGのSulfo-NHS誘導体（ICG-NHS）は、同仁堂研究所（熊本県）から購入しました。

FA-IHANPの合成と特性評価

アルテスナートをDMSOに溶解し、15mLの水に加えました。上記の溶液に10mgのHSA粉末を加え、室温で3時間わずかに攪拌しました。攪拌後、150μLの0.5％グルタルアルデヒドで架橋することにより混合物を処理しました。余分な化学試薬を除去するために、混合物を蒸留水（MWカットオフ=8,000–12,000 Da）に対して1日間透析し、ArteをロードしたHSAナノコンポジット（Arte-HSA）を作成しました。

HSAのカルボキシル基を活性化するために、化学試薬EDCおよびNHSをArte-HSA溶液に添加しました。その後、混合物をNH ₂ と反応させた。 –PEG ₂₀₀₀ -4°Сで3時間FA。次に、ICG-NHSを、室温で30分間、わずかに攪拌しながら混合物に添加しました。精製されたFAおよびICG結合HSAナノ粒子（FA-ICG-HSA @ Arte、FA-IHA NP）は、脱イオン水中で24時間透析することによって得られました。ロードされたArteとICGの量は、UV-vis分光光度計によって検出されました。積載効率=W1 / W2×100％。ここで、W1はFA-IHA NPのArteまたはICGの重量を表し、W2は追加されたArteまたはICGの重量を表します。

透過型電子顕微鏡（日立、東京、日本）を使用して、サンプルの形態を検出した。ゼータサイザー（ゼータサイザー3000; Malvern Instruments、ウスターシャー、英国）を使用して、サンプルのサイズとゼータ電位を測定しました。 ＵＶ－ｖｉｓ分光光度計（ＵＶ－１６０１ＰＣ、島津、京都、日本）を適用して、吸光度スペクトルを測定した。 808 nmの単一波長連続波レーザー（Beijing Laserwave Optoelectronics Technology Co. Ltd）を適用して光熱実験を行い、温度を熱電対温度計（Fluke、USA）で検出しました。

熱およびpHでトリガーされるArteリリース

熱およびpHによって引き起こされるArte放出を決定するために、FA-IHA NP（50μg/ mL）を3つのグループに分けました：（a）pH 6.5、（b）pH 7.4、および（c）NIR照射によるpH 6.5（808 nm、1 W / cm ² 、1分パルス）36時間の選択した時点で。 Arteの放出量は、上澄みの287nmでのArteのUV-vis吸収に基づいて決定されました。

一重項酸素生成の検出

1,3-ジフェニルイソベンゾフラン（DPBF）を使用して一重項酸素を検出しました。 15μLのDPBFアセトニトリル溶液を元のICGまたはFA-IHANP溶液（1.0 mL、10μg/ mL）に加えて完全に混合した後、5分間照射しました（808 nm、1.0 W / cm ² > ）。 UV-vis吸収スペクトルはさまざまな時点で記録され、410nmでの吸収の減少率は一重項酸素の生成に比例します。

細胞培養と細胞取り込み

HepG2細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから25 cm ² で購入しました。 それぞれ、1％ペニシリン-ストレプトマイシンと10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM培地を含む細胞培養フラスコ。 HepG2細胞は、5％CO ₂ で37°Cに保たれました。 雰囲気。

細胞への取り込みを観察するために、HepG2細胞を遊離ICG、IHA NP、およびFA-IHA NP（0.05 mg / mLのICGを含む）とともに6時間培養しました。その後、PBSを使用して処理した細胞を3回洗浄しました。次に、細胞を200μLのグルタルアルデヒドで固定し、DAPIで10分間染色しました。細胞内のナノ粒子の蛍光シグナルは、共焦点レーザー走査型顕微鏡（FV300、オリンパス、日本）を使用して検出されました。

細胞への取り込みをさらに評価するために、フローサイトメーター（FCM、BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）を適用しました。上記のように、遊離のICG-、IHA NPs-、およびFA-IHA NPsで処理した細胞をPBSで3回洗浄し、トリプシン-EDTAで消化しました。浮遊細胞をFCMに直接導入して、細胞取り込み率を分析しました。

細胞内ROSの生成

HepG2細胞は、2×10 ⁵ の密度で12ウェルプレートで培養されました。 1ミリリットルあたりの細胞数を24時間インキュベートした後、（1）PBS、（2）Arte、（3）FA-HA-NP、（4）遊離ICG、（5）IHA-を含むさまざまなサンプルを1mL添加しました。 NP、および（6）FA-IHANPソリューション。さらに12時間インキュベートした後、細胞に5分間照射しました（808 nm、1.0 W / cm ² ）、続いてDCFH-DA（5μg/ mL）でさらに30分間処理します。最後に、細胞をPBSで徹底的に洗浄し、細胞内ROSの生成をサイトメーターを使用して定量的に検出し、ライカ反転蛍光顕微鏡を使用して定性的に検出しました。

インビトロ腫瘍併用写真化学療法

HepG2細胞を96ウェルプレートに播種しました（2×10 ⁴ ウェルあたりの細胞数）24時間のインキュベーション。無料のICG、Arte、IHA NP、およびFA-IHA NP（0、5、10、20、および30μg/ mLのArteを含む）をセルに追加しました。 6時間のインキュベーション後、古い培地は廃棄されました。処理された細胞は、808 nmレーザー（1.0 W / cm ² ）の有無にかかわらず照射されました。 、5分）、次の24時間培養します。細胞生存率は、プロトコルに従って古典的なCCK-8アッセイによって測定されました。

NIR処理後の生細胞と死細胞をさらに確認するために、処理した細胞をカルセイン-AM / PIで共染色しました。 HepG2細胞は、35mmプレートに1×10 ⁶ の密度で事前に播種されました。 プレートあたりの細胞数をPBS、PBS + NIR、FA-IHA NP、またはFA-IHA NP + NIRで処理しました。 6時間のインキュベーション後、細胞に808 nmレーザー（1 W / cm ² ）を5分間照射しました。 ）そして次の24時間培養します。細胞をカルセイン-AM / PIで30分間染色し、PBSで洗浄して過剰な色素溶液を除去した後、共焦点レーザー走査顕微鏡（カルセイン-AM lex =488 nm、lem =515 nm、PI lex =535 nm）を使用して画像化しました。 、lem =617 nm）。

動物モデルとinvivo蛍光イメージング

Balb / cヌードマウスは広東省の実験動物科学センターから入手し、広州医科大学によって承認されたプロトコルの下で使用されました。 HepG2皮下腫瘍を確立するために、1×10 ⁶ HepG2細胞（100μLPBS中）をBalb / cヌードマウスの背中に注入しました。

担癌マウス（ n =5）は、市販のIVIS Spectrumシステム（Caliper LifeSciences、米国）によって、無料のICG、IHA NP、およびFAの静脈内注射の前と10分後、6時間後、12時間後、24時間後、および48時間後に画像化されました。 IHANP。

InVivo腫瘍の併用写真化学療法

担癌マウスはランダムに異なるグループに分けられました（ n =5）、PBS、Arte、FA-IHA NP、ICG + NIR、IHA NPs + NIR、およびFA-IHA NPs + NIR（等しい遊離Arte用量）でそれぞれ処理されました。 5分間のNIRレーザー（808 nm、1 W / cm ² ）を使用して、これらのサンプルの静脈内注射の24時間後（0日目）と48時間後（1日目）に腫瘍領域を照射しました。照射されたマウスの熱画像と温度が記録された。治療中、腫瘍のサイズは4日ごとに記録され、次の式に従って計算されました：体積=（腫瘍の長さ）×（腫瘍の幅） ² / 2.結果は、腫瘍体積を初期腫瘍体積で割った相対腫瘍体積で示されました。治療後、PBSおよびFA-IHA NPs + NIRグループのこれらのマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓などの主要臓器を採取し、4％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、H＆Eで染色し、デジタル顕微鏡。

結果と考察

FA-IHANPの合成と特性評価

図1は、FA-IHA NPの概略的な使用法と、画像誘導腫瘍を標的とした併用光化学療法への応用を示しています。多機能セラノスティック剤FA-IHANPは、単純で生体適合性のある自己組織化法によって調製されました。共役ICGは、そのPTT-PDT特性のために、NIR蛍光イメージング剤および光線療法剤として使用されました。さらに、ロードされたアルテは化学療法効果を発揮しました。

invitroおよびinvivoでの画像誘導腫瘍標的併用光化学療法に使用されるFA-IHANPの概略図

FA-IHA NPのTEM画像は、直径が約131.2 nmの単分散球状構造を示しています（図2a）。 DLS分析によると、この流体力学的直径は、水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、および細胞培地で長さが131±2.3 nmであることが確認されました（図2b）。 131.2±2.12のゼータ電位も、これら3つの媒体で-29.2±1.13 mVとして検出されました（図2c）。さらに、FA-IHA NPの直径は、これら3つのメディアで7日間にわたって有意な変化はありませんでした（図2d）。これらの結果は、おそらくPEGおよびHSAコーティングが原因で、調製されたFA-IHANPが良好な安定性を持っていることを示しています。 FA-IHA NPのUV-vis-NIRスペクトルは、ArteとICGの両方の吸収ピークを示し（図2e）、FA-IHANPにArteとICGが存在することを示しています。アルテ負荷率は98.6±3.1％、ICG負荷率は56.9±2.4％でした。図2fは、FA-IHANPが遊離ICGと比較して同様の蛍光特性を持っていたことを示しています。

a FA-IHANPのTEM画像。 b 、 c 水、細胞培地、およびPBSにおけるFA-IHANPのサイズとゼータ電位の分布。 d FA-IHA NPのサイズは、水、細胞培地、およびPBSで変化します。 e 遊離ICG、Arte、およびFA-IHANPの吸光度スペクトル。 f 遊離ICGおよびFA-IHANPの蛍光スペクトル

FA-IHA NPの強力なNIR光学吸収に後押しされて、FA-IHANPの光熱特性が評価されました。水、遊離ICG、およびFA-IHA NP（ICG濃度が等しい）に808 nmレーザー（1 W / cm ² ）を照射しました。 ）。 FA-IHA NPと遊離ICGの温度は照射から5分以内に約36°C上昇しましたが（図3a）、水は4°C未満の温度上昇を示し、ICGを含むナノ粒子がかなりの光熱を持っていることを示しています効果があり、癌治療の可能性があります。さらに、追加ファイル1：図S1は、0.5、1、および1.5 W / cm ² の808nmレーザー照射を5分間行った場合のFA-IHANPの光熱加熱曲線を示しています。 、最適なレーザー強度が1 W / cm ² であることを示します 。 FA-IHANPおよび遊離ICGの光安定性試験を実施しました。遊離ICGは、FA-IHA NPと比較して、5サイクル後に大幅な温度低下を示しました（図3b）。図3cは、5サイクルのNIR照射（808 nm、1 W / cm ² ）前後の遊離ICGおよびFA-IHANPの吸収強度の変化を示しています。 ）。結果は、遊離ICGの808 nmでの吸光度強度が、5サイクルのNIR照射後に減少した一方で、FA-IHANPは元の吸光度強度を維持したことを示唆しました。さらに、遊離ICGとFA-IHA NPの蛍光安定性を比較しました（図3d）。 4°Cで30日間保存した後、800nmでのFA-IHANPの蛍光強度は初期強度1と比較して0.72でしたが、遊離ICGの蛍光は初期強度と比較して0.12に低下しました。これは、凝集が誘発されたためです。 -光退色[36]。これらの結果は、共有結合したICGが遊離ICGよりも安定していることを示しています。これは、HSAとPEGの自己組織化により、ICGが熱や光などの内部環境に起因する凝集から保護されているためと考えられます。したがって、これらの結果は、FA-IHANPが優れた光熱効果と光熱安定性を持っていることを示唆しています。

a 5分808nmレーザー照射（1 W / cm ² ）下での水、ICG、およびFA-IHANPの光熱加熱曲線 ）。 b 808nmレーザーを5サイクル連続して5分間照射した後のICGおよびFA-IHANPの温度変化。 c 808 nmNIRレーザーを5サイクル照射する前後の780nmでのFA-IHANPの吸収変化。 d ICGおよびFA-IHANPの蛍光は30日間で変化します

次に、ROS特異的プローブ1,3-ジフェニルイソベンゾフラン（DPBF）を使用して、NIR照射後のFA-IHANPによるROS生成を検出しました。図4aに示すように、FA-IHA NPは、遊離ICG（0.35）と比較して、NIR照射から5分以内に有意なROS量（標準吸光度で0.58）を生成しました。これは、FA-IHANP併用療法に起因する可能性があります。

a ICG、FA-IHA NP、および808 nmレーザー照射（1 W / cm ² ）下のブランクサンプルの存在下での正規化されたDPBF吸光度 ）。 b それぞれNIRレーザー照射の有無にかかわらず、pH =7.4およびpH =6.5でFA-IHANPからArteの放出速度論

NIRレーザー照射下（808 nm、1 W / cm ² ）およびpH条件、放出性能を調査しました（図4b）。対照的に、NIR照射なしでは、FA-IHANPはpH7.4およびpH6.5でそれぞれ11.61％および34.2％のアルテ放出を示しましたが、6回のNIR照射下では、FA-IHA NPは合計68.4％のアルテ放出を示しました。 pH 6.5。これは、NIR照射と酸性条件の両方が、FA-IHANPからのArte放出を大幅にトリガーする可能性があることを示唆しています。 NIR照射と酸応答性薬物放出は、HSAナノ粒子の熱による膨張に起因する可能性が高く、さらに、酸性環境ではH ⁺ ナノ粒子の親水性/疎水性バランスを変化させるHSAの表面電荷を変化させる可能性があります[37、38]。

細胞の取り込みと細胞内ROSの検出

ICG蛍光特性のおかげで、FA-IHANPの取り込みがHepG2細胞で蛍光顕微鏡を介して直接観察されました。図5aに示すように、FA-IHA NPで細胞を処理した後、細胞質は、遊離ICGおよびIHANPで処理した細胞で観察されたものよりも強い赤色ICG蛍光を示しました。さらに、FA-IHA NPの細胞取り込み率はFCMによって52.3％と定量化され、IHA NP（25.2％）および遊離ICG（3.9％）よりも高かった（図5b）。結果は、結合したFAがナノ粒子を促進して腫瘍細胞上のFA受容体を標的にし、FA-IHA NP細胞の取り込みを促進することを示しました[39、40、41]。

a 遊離ICGおよびIHANP、およびFA-IHANPとのインキュベーション後のHepG2細胞の共焦点蛍光画像。赤と青の色は、それぞれICG蛍光とDAPI染色された細胞核を表しています。 b 遊離ICGおよびIHANPおよびFA-IHANPとのインキュベーション後のHepG2細胞におけるICG蛍光強度のフローサイトメトリー測定

蛍光顕微鏡を使用して、NIR照射の有無にかかわらず、Arte、ICG、およびFA-IHANPで処理した細胞の固有の光線力学的活性を観察しました。 ROSプローブ2、7-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートを使用して、細胞のROS産生を視覚化しました。結果は、FA-IHA NPが、5分間のNIR照射後に、他のサンプルと比較して大幅に強化されたROS生成を誘発する可能性があることを示しました（図6a）。対応する蛍光値を図6bに示します。

a さまざまな薬剤で処理された癌細胞におけるROS産生の蛍光画像、および b 対応する蛍光強度：（1）PBS、（2）Arte、（3）FA-HA NP、（4）フリーICG + NIR、（5）IHA NP + NIR、および（6）FA-IHA NP + NIR

体外腫瘍の併用写真化学療法

図7aは、5分間のNIR照射（1.0 W / cm ^{2 ）。 FA-IHA NPで処理された細胞の温度は、最も高い上昇を示しました（ΔT =31°C）PBS、遊離ICG、およびIHANPで処理した細胞と比較。 Arte、IHA NP、およびFA-IHA NPをさまざまな濃度で24時間、NIR照射なしで処理した細胞の生存率は、濃度の増加とともに低下しましたが、これらの濃度の遊離ICGは細胞毒性を示しませんでした（図7b）。一方、薬剤キャリアのFA-IH NP（Arteを含まないFA-IHA NP）も、有意な細胞毒性を示しませんでした（追加ファイル1：図S2）。対照的に、NIR照射後（1.0 W / cm 2 、5分）、遊離ICG、IHA NP、およびFA-IHA NPで処理された細胞で、有意な濃度依存性の細胞死が観察されました（図7c）。この効果は、FA-IHANPで処理した細胞で特に顕著でした。優れた抗がん効果は、放出されたアルテの化学療法効果やICGのPTT-PDT治療効果など、標的とされた併用光化学療法に起因する可能性があります。さらに、NIR照射の有無にかかわらずFA-IHANPの細胞毒性をカルセイン-AM / PI二重染色によって調べた。 FA-IHA NPと照射で処理された細胞は、他の処理されたグループと比較してほぼ完全に死んでいました（図7d）。}

a 5分間のNIR照射後の、96ウェルプレートでのPBS、遊離ICG、IHA NP、およびFA-IHANPで処理された細胞の温度変化曲線。 b、c 808 nmのレーザー照射（5分、1 W / cm ² ）の有無にかかわらず、遊離ICG、Arte、IHA NP、およびFA-IHANPで処理された細胞の細胞生存率 ）、 それぞれ。 d PBS（コントロール）、PBS + NIR、FA-IHA NP、およびFA-IHA NP + NIRでそれぞれ処理した後の細胞のカルシウムAM / PI二重染色画像

InVivo蛍光イメージング

遊離ICG、IHA NP、およびFA-IHANPの注射後0.1時間の図8aおよびbに示すように、担癌マウスの全身に強い蛍光シグナルが見られました。蛍光シグナルは、時間の経過とともに腫瘍領域で増加し、注射後24時間でピークに達しました。 FA-IHA NPsグループの腫瘍蛍光シグナルは、すべてのテストポイントでICGおよびIHA NPsグループのそれと比較して最も高く（図8b）、FA-IHANPsがFAのために腫瘍領域に高度に蓄積する可能性があることを示しています誘発された腫瘍標的効果。さらに、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓などの主要組織での生体内分布は、注射後24時間のexvivo蛍光定量分析によって実施されました。テストしたすべてのグループで、肝臓組織で強い蛍光シグナルが検出され（図8c）、これらの化合物の主な代謝変換が肝経路をたどることを示しています。これらの結果は、FA-IHANPがinvivoで腫瘍に選択的に蓄積する可能性があり、おそらくFAを標的とした効果によって誘発されることを示しています[37]。

a 遊離ICG、IHA NP、およびFA-RIPNPを尾静脈注射した後の担癌マウスの代表的な蛍光画像。黒い破線の円は腫瘍領域を示します。 b 注射時間の関数としての遊離ICG、IHA NP、およびFA-IHANPで処理されたマウスの腫瘍領域における蛍光シグナルの定量的invivo分析。 c 心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓などの主要臓器の蛍光信号

InVivo腫瘍の併用写真化学療法

図9aおよびbに示すように、PBS、遊離ICG、IHA NP、およびFA-IHA NPで治療した後の、5分間のNIR照射（1 W / cm ² ）サーマルイメージャーによって記録されました。 FA-IHA NPs治療群では、腫瘍領域の約22.1°Cの上昇が検出されました。これは、他の群よりも高かったです。 2サイクルのNIR照射（0日目と2日目）の後、FA-IHA NPs + NIRグループは再発することなく有意な腫瘍成長抑制を示しました（図9c）。一方、PBS、Arte、FA-IHA NPsで治療したグループは、 PBS + NIR、ICG + NIR、およびIHA NPs + NIRは、腫瘍抑制の明確な兆候を示しませんでした。さらに、90日後、FA-IHA NPs + NIRグループのマウスは100％の生存率を示しました（図9d）。これらの結果は、NIR照射を伴うFA-IHA NPが、おそらく能動的標的化および併用光化学療法により、優れたinvivo腫瘍治療効果を示したことを示しています。

a 5分間のNIR照射（808 nm、1 W / cm ² ）下で24時間、PBS、ICG、IHA NP、およびFA-RIPNPを尾静脈注射した後の担癌マウスの腫瘍領域温度 ）。 b 5分間のNIR照射（808 nm、1 W / cm ² ）下で24時間、PBS、ICG、IHA NP、およびFA-RIPNPを尾静脈注射した後の担癌マウスの熱画像 ）。 c PBS、Arte、ICG、IHA NP、およびFA-RIPNPを5分間のNIR照射（808 nm、1 W / cm ² の有無にかかわらず静脈内注射した後のHepG2異種移植腫瘍の成長プロファイル ）。 d PBS、遊離Arte、ICG、IHA NP、およびFA-RIPNPを5分間のNIR照射（808 nm、1 W / cm ² ありまたはなし）で尾静脈注射した後の担癌マウスの生存率 ）

最後に、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を使用して、FA-IHANPの毒性を評価しました。断面画像は、PBS治療群と比較して有意な組織学的病変を示さず（図10）、FA-IHA NPの毒性は無視できることを示しています。これは、FA-IHA NPの成分の安全性が原因である可能性が高いため、臨床診療におけるそれらの将来の使用。

PBSおよびFA-IHANPで処理したマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓などの主要臓器のH＆E染色組織切片

結論

結論として、多機能セラノスティック剤が調製され、FAとICGを共有結合し、invitroおよびinvivoでの画像誘導腫瘍標的併用光化学療法のためにArteをカプセル化しました。調製されたFA-IHANPは、優れたコロイドおよび熱安定性と蛍光特性を示しました。 NIR照射下では、FA-IHA NPは大きな光熱効果を示し、光線力学的性能を示した遊離ICGよりもNIR照射後にArte放出を引き起こし、はるかに多くのROSを生成する可能性があります。コンジュゲートされたFAは、invitroおよびinvivoで非常に効率的な細胞取り込みと腫瘍蓄積を促進しました。さらに、FA-IHA NPの非常に効果的な抗がん効果は、invitroおよびinvivoで実証されたPTT-PDT療法などのアクティブターゲティング熱薬物化学療法を組み合わせたものです。全体として、得られた結果は、FA-IHANPが将来のナノメディシンアプリケーションに適した有望な腫瘍標的システムである可能性があることを示しています。

略語

アルテ：

アルテスナート

FA：

葉酸

HSA：

ヒト血清アルブミン

ICG：

インドシアニングリーン

NIR：

近赤外線

PDT：

光線力学療法

PEG：

ポリエチレングリコール

PTT：

光熱療法