低強度集束超音波で活性化する標的型クルクミンナノ粒子：卵巣がんにおけるpH応答性サーノスティクス

概要

pH感受性フェリチンナノケージを用い、抗がん剤クルクミン（Cur）と液体フルオロカーボンのパーフルオロヘキサン（PFH）を内部に共封入し、腫瘍標的分子である葉酸（FA）を外殻に結合した多機能ナノプラットフォーム（FA-FCP）を開発しました。合成されたFA-FCPの平均粒径は47 nmで、様々な媒質中で安定な物理化学的特性を示し、高い生体適合性と生体安全性を有しています。低強度集束超音波（LIFU）照射下かつpH 5.0条件下で、24時間で薬物の53.2%が放出されました。7 WのLIFUを4分間照射後、pH 5.0においてFA-FCPは造影超音波イメージング能を発揮しました。FA受容体媒介性エンドサイトーシスにより、FA-FCPは効率的に細胞内に取り込まれ、さらにリソソームへ移行します。FA-FCP注射18時間後に腫瘍部位へLIFU照射を行うと、造影超音波像が得られました。in vitroおよびin vivo実験で、FA-FCPとLIFUの併用が有意な腫瘍治療効果を示しました。これらの結果から、FA-FCPは外因性LIFUと内因性酸性環境の双方に応答し、強力なサーノスティクス（診断・治療一体化）機能を発揮し、非侵襲的で統合された腫瘍サーノスティクスの新たな選択肢となり得ることが結論付けられました。

はじめに

卵巣がんは高転移性・高致死率の疾患です。早期臨床症状が不明瞭なため、診断時には多くの患者で腫瘍細胞が高度に転移しています。標準治療は細胞減少手術と化学療法の併用ですが、進行期の5年生存率は極めて低く、新たな治療・診断戦略の開発が急務です。近年、標的治療とイメージング診断機能を融合したナノプラットフォームが、腫瘍治療の代替戦略として注目されています。

音響応答性ナノプラットフォーム（ARN）は腫瘍治療・診断研究で広く用いられています。ARNは通常、マイクロバブル（MB）またはナノ粒子（NP）モデルで設計されます。NPはMBに比べ粒径が小さく、透過性が高く、薬物動態サイクルが長く、安定性に優れ、表面修飾が容易です。パーフルオロペンタン（PFP）、パーフルオロヘキサン（PFH）、パーフルオロオクチルブロミド（PFOB）などの相転移性液体フルオロカーボンが、音響応答性付与に一般的に使用されます。これらは外部集束超音波刺激下で気液相転移（ADV効果）により気泡を生成・破裂させ、超音波造影能を付与します。PFPは沸点が低く（29.2℃）体内で気化しやすくガス塞栓リスクがあり、PFOBは沸点が高く（144℃）超高強度超音波が必要です。一方、PFHは沸点56℃で理想的な相転移材料とされています。しかしPFHは疎水性のため、ナノ粒子内部に封入して水溶性化する必要があります。リポソーム、PLGA、有機メソポーラス、有機ポリマーなど様々なキャリアが液体フルオロカーボン封入に報告されており、同時に抗がん剤を搭載することで化学療法機能と音響制御薬物放出能を付与できます。これらの音響応答性ナノプラットフォームは優れた腫瘍診療一体化能を示しますが、ナノキャリアの生体適合性が臨床応用の懸念となっています。近年、鉄フリーフェリチンナノケージが内因性タンパク質で高いpH感受性を持つため、薬物送達担体として広く用いられています。酸性環境で分解し、アルカリ環境で再組立てする特性により、高い生体適合性と制御された薬物封入・放出能を有します。

本研究では、フェリチンを担体としてPFHとクルクミン（Cur）を共封入し、腫瘍標的分子FAをタンパク質表面に修飾した多機能ナノプラットフォーム（FA-FCP）を作製しました。クルクミンはウコン由来の天然ポリフェノールで優れた抗がん作用が報告されていますが、水溶性が低いという課題があります。FA-FCPはPFHとCurの水溶性を向上させ、様々な媒質で高い生理的安定性を示し、in vivoおよびin vitroで良好な生体適合性と生体安全性を有します。LIFU照射下かつpH 5.0条件で24時間に53.2%の薬物放出、7 W・4分のLIFU照射でpH 5.0において造影超音波イメージング能を発揮します。FA受容体媒介性エンドサイトーシスにより細胞内へ効率的に取り込まれリソソームへ移行。FA-FCP注射18時間後に腫瘍部位へLIFU照射で造影超音波像が得られました。in vivoおよびin vitro実験でFA-FCPの有意な腫瘍治療効果が確認されました。非侵襲性、リガンド/受容体媒介標的化、LIFU誘発相転移・破裂、精密な薬物放出という利点を併せ持つFA-FCPは、有望な腫瘍サーノスティクスナノプラットフォームとなり得ます。

材料と方法

材料

フェリチン（FRT）、葉酸（FA）、パーフルオロヘキサン（PFH）はSigma（米国ミズーリ州セントルイス）製。クルクミン（Cur）はアラジン産業株式会社（中国上海）製。NH₂-PEG₂₀₀₀-FAおよびNH₂-PEG₂₀₀₀-COOHは西安瑞希生物技術有限公司（中国）製。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）はサーモフィッシャーサイエンティフィック（米国マサチューセッツ州ウォルサム）製。Cell Counting Kit-8（CCK-8）は同仁化学（日本熊本）製。Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、ペニシリン-ストレプトマイシン、トリプシン-EDTA、胎児牛血清（FBS）はGibco（米国ニューヨーク州グランドアイランド）製。

FA-FCPの調製

FA-FCP調製手順：まず、10 mg FRTを10 mL水に溶解。10 mg Curを0.3 mL DMSOに溶解。これらと1 mL PFHをpH 5.0条件下、氷冷超音波処理30分で混合。その後pHを7.4に調整し、CurとPFHを封入したFRT（FCP）を得ました。次に、カルボジイミド法で標的分子FAをFCPと共有結合させました。NH₂-PEG₂₀₀₀-FA 5 mgを上記FCP溶液に、EDC（5 mg/mL）とNHS（20 mg/mL）存在下で添加。室温で3時間軽攪拌反応後、透析（MWカットオフ12 kDa、蒸留水、24時間）で精製し、FA共役FCP（FA-FCP）を得ました。Cur封入率はUV-Vis分光光度計（426 nm）で測定し、（Aa−Ab）/Acで算出しました。Aa、Ab、AcはそれぞれFA-FCP、FA-FP、FA-FPの重量を表します。

キャラクタリゼーション

ナノ粒子の粒径とゼータ電位はZeta Sizer（Malvern、NanoZS、英国）で測定。形態は透過型電子顕微鏡（TEM、日立、日本）と原子間力顕微鏡（AFM、Agilent Technologies 5500LS、米国アリゾナ州チャンドラー）で観察。細胞取り込みは共焦点レーザー走査顕微鏡（LEXT OLS4100、オリンパス、日本）とフローサイトメトリー（BD、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）で検出。吸収スペクトルはUV-Vis分光光度計（UV1800、島津製作所、日本）で取得。

細胞培養と動物モデル

ヒト卵巣がん細胞株SK-OV-3は中国科学院上海細胞生物学研究所提供。DMEM培地（10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、5% CO₂、37℃）で培養。BALB/cヌードマウス（雌、約5週齢）はVital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.（中国北京）提供。SK-OV-3腫瘍モデル構築のため、1×10⁶細胞をマウス右背部に皮下接種。すべての実験手順は四川医学アカデミーの実験動物飼育・使用ガイドラインに準拠し、同アカデミー倫理委員会の承認を得て実施。

pH/LIFU応答性Cur放出

FA-FCP水溶液を4等分し、透析バッグ（MW 5000）に入れ、pH 5.0および7.4のPBS溶液10 mLに対して透析。3時間後、LIFU（7 W、5分、50%デューティサイクル、パルス波モード）照射有無で処理。特定時点で透析液1 mLを採取し、同体積・同pHのブランク溶液を補充。透析液をUV-Vis分光光度計で測定し、Cur濃度を算出。

FA-FCPのADV特性とUSイメージング機能

pH 5.0および7.4条件下のFA-FCPを、異なる出力（5、6、7 W）と照射時間（3、4、5分）のLIFUでアガロースゲルモデル中で照射し、超音波装置（Esaote Mylab 90、イタリア、周波数5–12 MHz、メカニカルインデックス0.06）でUS像を観察。US像の関心領域の強度をImageJソフトウェアで解析。

FA-FCPの標的能

in vitro標的能検証のため、FITCでナノ粒子を標識。1 mg FITCを1 mL DMSOに溶解し、FCPおよびFA-FCPと混合、30分間穏やかに撹拌。透析（脱イオン水、一晩）で遊離FITCとDMSOを除去し、FITC標識ナノ粒子を得ました。細胞を24時間培養後、FITC標識ナノ粒子を添加し3時間インキュベーション。PBSで3回洗浄後、DAPIで5分、LysoTracker Redで10分染色、4%パラホルムアルデヒドで15分固定。共焦点レーザー走査顕微鏡で観察。細胞内蛍光シグナルをフローサイトメトリーで測定・解析。

FA-FCPの血中動態と腫瘍集積

フリーCurとFA-FCP（同Cur濃度）を正常マウスに静脈投与。様々な時間点で眼窩静脈叢から採血し、溶解液で溶解。各血液サンプルのCur吸収スペクトルをUV-Vis分光光度計で測定し、投与量あたりの組織グラム当り百分率（ID%/g）として血中Cur濃度を算出。

腫瘍内FA-FCP含量は腫瘍保有マウスで測定。FA-FCP静脈投与後0、1、6、12、18、24時間で腫瘍組織を採取、秤量、王水で24時間消化。各腫瘍組織のCur吸収スペクトルをUV-Vis分光光度計で測定し、ID%/gとして算出。

in vitroおよびin vivo抗がん効果

in vitro抗がん効果：細胞をPBS、Cur、FA-FCP、FCP+LIFU、FA-FCP+LIFU（同Cur用量5 mg/kg）で3時間処理後、LIFU照射（5分、7 W）。さらに21時間培養し、CCK-8アッセイで細胞生存率を測定。

in vivo抗がん効果：腫瘍保有ヌードマウスを5群（n=6）に無作為割付し、生理食塩水（対照）、フリーCur、FA-FCP、FCP+LIFU、FA-FCP+LIFUを静脈投与。24日間、3日ごとに腫瘍体積と体重をモニタリング。腫瘍サイズはノギスで測定し、腫瘍体積＝長径×短径²/2。相対腫瘍体積（V/V₀、V₀は初期腫瘍体積）で腫瘍増殖変化を表示。

生体安全性評価

SK-OV-3細胞を96ウェルプレート（1×10⁴細胞/ウェル）に播種、24時間接着後、FA-FRT-PFHを様々な濃度（0、20、40、100、200、500 μg/mL）で24時間培養。10% CCK-8含有DMEM培地で20分インキュベート後、マルチモードプレートリーダー（Thermo Scientific）で450 nm吸光度を測定し細胞生存率を評価。さらに、FA-FCP静脈投与25日後の健常マウス主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）を採取、ヘマトキシリン-エオシン染色（HE染色）し、光学顕微鏡で観察。

統計解析

すべてのデータを平均±標準偏差で表示。SPSS 22.0ソフトウェアで統計処理。Studentのt検定で群間有意差を判定。p<0.05を有意差とする。

結果と考察

FA-FCPの調製とキャラクタリゼーション

スキーム1にFA-FCPの合成プロセスと腫瘍超音波（US）イメージングおよび併用超音波化学療法への応用を示します。多機能サーノスティクス剤FA-FCPは、シンプルで生体適合性の高い自己組立法で調製されました。FA-FCPのTEMとAFM像は球状構造を示します（図1aインセット、追加ファイル1：図S1）。DLS解析で水中での平均粒径約47 nm、平均ゼータ電位−37 mV（図1a、b）。水、PBS、生理食塩水、FBS中で4週間保存後も粒径安定（図1c）、PEGコーティングとFRTの特性による優れた生理的安定性が示唆されます。FA-FCPのUV-Vis-NIRスペクトルにCurの吸収ピークが見られ、Cur封入が確認されました。Cur封入率は125.8±2.1%。

図2は異なるpH条件下、LIFU照射有無でのFA-FCPからのCur放出プロファイルを示します。LIFU非照射では、pH 5.0での24時間Cur放出は約30%で、pH 7.4（5.3%）より有意に高い値。LIFU照射（7 W、4分）下では、pH 5.0と7.4の両方でCur放出が急増しますが、pH 5.0（50%）の方がpH 7.4より明確に高い放出量を示しました。この特性によりFA-FCPは腫瘍微小環境で有用です。優れた薬物放出は、(1) 酸性条件下でFRTが分解・ナノケージを開口して封入Curを放出、(2) LIFU誘発の瞬時相転移により、拡張した多孔質シェルからCurが持続的に放出されること、に起因します。

FA-FCPのin vitro ADV効果

FA-FCPをpH 7.4または5.0で、出力5、6、7 W、照射時間3–5分のLIFUに曝露し、最適なLIFU出力・時間・pH条件を評価。US強度がADV効果を表します。US像（図3a、b）とUS像の平均グレースケール値（図3c、d）によると、pH 7.4ではADV効果は時間/出力依存的で、7 W・5分でピーク。一方、pH 5.0では7 W・4分でピーク。5 W・3分未満ではUS像最適化に十分な気泡が生成されず、7 W・4分を超えると生成気泡の大部分が崩壊・消失。以上より、FA-FCPのADV効果を喚起するには一定の刺激が必要で、pH 5.0での7 W・4分が最適条件であることが示されました。

FA-FCPの標的能

古典的低分子蛍光色素FITCでナノ粒子を標識。追加ファイル1：図S2に示す通り、同濃度のFITC標識FCPとFA-FCPの蛍光強度に有意差はなく、標識FITC量の差が細胞取り込み実験に影響しないことが確認されました。蛍光像とFCM解析で、FCPは19.5%の取り込み率で細胞内に取り込まれました（図4a、b）、これは細胞表面のフェリチン受容体による可能性があります。FA結合後、FA-FCPは44.3%の高い取り込み率を示し、遊離FAで前処理すると取り込み率が13.8%に低下しました（図4a、b）。以上より、FA結合がFA受容体媒介性エンドサイトーシスによりFA-FCPの取り込み率を大幅に向上させることが示されました。

さらに、リソソーム特異的染色色素（LysoTracker Red）でFA-FCPのオルガネラ局在を調査。図4cに示す通り、FA-FCPとLysoTracker Red処理細胞では細胞質に強い緑色と赤色蛍光が観察され、緑と赤の合成で強い黄色蛍光が細胞質に見られ、FA-FCPがリソソーム（pH≈5.0）へ移行することを示唆します。これは細胞内での薬物放出トリガーに有利です。

FA-FCPの血中動態と腫瘍集積

図5aに示す通り、FA-FCPの半減期は約7.31時間（フリーCurの約8倍）で、PEGコーティングとFRT封入によるものと考えられます。この血中長期滞留は全身循環での薬物保持改善に有利で、腫瘍部位への薬物集積を促進します。図5bは投与後0–24時間でのフリーCurとFA-FCPの腫瘍内動態集積を示します。FA-FCPは18時間で最高集積を示し、フリーCurは投与後約1時間で最高集積。これらの結果は、FA-FCPがフリーCurに比べ有意に高い腫瘍組織集積能を有し、これはEPR効果（浸透・保持効果）とFA受容体媒介性能動的標的化効果によるものと考えられます。

in vivo USイメージング

4群（ブランク対照+LIFU、FCP+LIFU、FA-FCP+LIFU、FA-FCP非LIFU）のヌードマウス腫瘍を、LIFU照射（7 W、4分）有無で観察し、FA-FCPのin vivo ADV可能性を検証。図6aに示す通り、対照群ではLIFU照射下で腫瘍内に明確なUS信号は観察されませんでした。投与18時間後、FA-FCP+LIFU群でFCP+LIFU群およびFA-FCP非LIFU群と比較して有意に強いUS信号が腫瘍内で観察されました（図6a、b）。以上より、FA-FCP+LIFUは腫瘍のUSイメージングコントラストを向上させることが実証されました。

in vitroおよびin vivo抗がん療法

CCK-8アッセイでFA-FCPのin vitro細胞毒性を検証。図7aに示す通り、全群でCur濃度依存的な細胞生存率パターンを示しました。LIFU非照射では、フリーCurと比較しFA-FCPが全濃度で高い細胞生存率抑制を示し、これはFA標的効果による可能性があります。しかし、FA-FCP+LIFU群の細胞生存率抑制はFP+LIFU、FCP+LIFU、FA-FCP非LIFU群より有意に高く、FA-FCPとLIFU照射の併用がより優れた抗腫瘍効率を示すことがわかりました。これはリソソームの酸性環境とLIFUの双方が薬物放出と空化効果を誘発し、FA媒介腫瘍細胞標的効果が作用したためです。

FA-FCPのin vivo抗がん効果を腫瘍保有ヌードマウスでさらに検証。FA-FCPの腫瘍集積結果に基づき、静脈投与18時間後にLIFU照射を2日ごと、計3回実施（1日目から）。図7b、cに示す通り、24日間治療後、FA-FCP+LIFU群の相対腫瘍体積は対照、Cur、FA-FCP、FP+LIFU、FCP+LIFU群と比較して有意に減少しました。腫瘍重量はFA-FCP群とFCP+LIFU群で対照およびCur群より有意に軽く、FA-FCP+LIFU群でさらに抑制されました。治療期間中、いずれの群でも体重有意減少は認められませんでした（図7d）。FA-FCP+LIFUの優れた抗腫瘍効果は、腫瘍部位へのFA-FCP標的集積と音響/pH応答性薬物放出能、さらに血中長期滞留による腫瘍部位でのナノ粒子遅延クリアランスに起因すると考えられます。

in vitroおよびin vivo生体適合性

CCK-8アッセイとHE染色解析でFA-FCPの生体適合性を評価。図8a、bに示す通り、薬物担持FA-FPと0–8 WのLIFU出力での細胞生存率はすべて90%以上で、本研究で使用したFA-FPとLIFU出力にin vitro有意な細胞毒性はありません。図8cはFA-FCP+LIFU処理マウス主要臓器のHE染色像で、対照群と比較して組織学的変化は認められませんでした。以上より、FA-FCPはin vitroおよびin vivoで高い生体適合性を有することが実証されました。

結論

本研究では、フェリチンナノケージを用い、抗がん剤Curと腫瘍標的分子FAを搭載した多機能FA-FCPを調製し、造影USイメージング能と化学療法における精密標的化を実現しました。新規合成FA-FCPは高いin vitroおよびin vivo生体適合性を示しました。また、優れた腫瘍標的能、音響/pH応答性Cur放出、LIFUによる音響応答性相転移を示しました。これらのユニークな特性により、FA-FCPは全身毒性を伴わない有意な腫瘍抑制因子として機能し得ます。このような新規かつ生体適合性に優れたサーノスティクスナノプラットフォームが、超音波イメージングと改善された治療効果を統合し、がん治療の有望なパラダイムを提供することが期待されます。