プルランベースのナノ粒子-表面電荷の影響を受けたHSA複合体形成と薬物放出

背景

小分子抗腫瘍薬を搭載したナノ粒子（NP）などのナノドラッグデリバリーシステムは、薬物放出特性とターゲティング効果を維持および制御しています。 NPを用いた標的療法は、薬剤の副作用を大幅に軽減し、薬剤の有効性を向上させることができるため、腫瘍の治療に焦点が当てられています[1,2,3]。

薬物をロードしたNPは、標的部位に到達するために3つの経路、すなわち、血液循環、組織から細胞への経路、および細胞内移動を通過する必要があります[4、5、6]。彼らはまた、標的組織に到達するために血管バリアを克服し、次に標的細胞に到達するために細胞膜バリアを克服する必要があります[7、8]。タンパク質の吸着と交換は、すべてのNPの経路に関与しています。最後に、タンパク質に吸着されたNPが標的細胞に到達し、薬物を放出します[1、9]。

ヒト血清アルブミン（HSA）、リポタンパク質、グロブリンなどの豊富なタンパク質は、通常、薬物をロードしたNPの表面に吸着されるため、NPのinvivo放出挙動と標的部位が変化します[10]。吸着されたタンパク質の数と種類は、血漿中のタンパク質の濃度とNPの親和性に密接に関連しています[11]。血漿タンパク質濃度が高いほど、NPの表面吸着が大きくなります[12]。親和性の高いタンパク質は、親和性の低いタンパク質を置き換えることができます[13]。したがって、NPの表面は高濃度で強い親和性を持つタンパク質で占められ、ナノタンパク質のクラウンを形成します[14]。ナノプロテインクラウンは、NPのinvivo機能に不可欠です[15]。たとえば、表面がポリソルベートで修飾されている場合、NPは血液脳関門を介して脳組織に薬物を送達できます[16]。疎水性修飾多糖ナノ材料は、体内のHSAと相互作用し、それによって薬物放出の制御を強化することができます[17]。

細胞によるNPの取り込みは、NPの物理的および化学的特性、ナノ薬物濃度、タンパク質吸着、細胞接着などのさまざまな要因の影響を受けます[18]。タンパク質吸着の種類と量は、薬物放出制御やターゲティングなど、NPの機能に影響を与えます。同様に、粒子サイズ、電荷、表面の疎水性などのNPの物理的および化学的特性は、タンパク質の吸着に影響を与えます[19]。 NPの性質は、invivoプロセス中にその運命を決定します[20]。疎水性修飾多糖ポリマーなどの両親媒性高分子材料は、ナノサイズの粒子に自己組織化することができます。 NPのサイズは、ターゲティングと薬物放出制御の機能において重要な役割を果たします[21]。ポリマーの疎水性基は、NPの核構造を形成するための推進力です。疎水性基の置換度が高いほど、NPは小さくなります[22]。カルボキシル基、アミノ基、およびそれらの誘導体を持つ高分子材料は、NPの自己組織化に関与するため、NPのサイズに影響を与え、反対の電荷を持つタンパク質に容易に付着するための表面電荷を提供します[23]。表面電荷が異なるNPは、タンパク質吸着能力と生物学的機能が異なります[24]。したがって、NPとタンパク質のさまざまな表面成分間の相互作用を調査する必要があります。

HSAは血液中に最も豊富なタンパク質です。それは、異物および内因性物質の輸送、分布、および代謝に不可欠です。多くの小分子薬が体内に入り、血液輸送中にHSA-薬吸着剤を形成します。これにより、薬の薬理学的効果が変化します[25]。薬物をロードしたNPは、体内に入った後にHSAと組み合わされます。 NPの構造は複雑であるため、吸着の特性は小分子HSAの組み合わせとは異なります[26]。たとえば、HSA分子への小分子薬の吸着は急速です。ただし、NPへのHSAの吸着は遅く、複雑です[27]。

薬物担体としてのCHPナノ粒子は長い間研究されており、薬物送達に優れたナノ材料を示してきました[28、29]。以前の実験では、コレステロール置換の程度が異なるプルランNP、コレステリック疎水性（CH）修飾プルラン（CHP）との相互作用を研究し、主に2つのプロセスを発見しました：HSAはNP表面に急速に付着し、その後ゆっくりと挿入されますNPの疎水性コア[30]。疎水性相互作用は、CHP-HSA複合体の形成に主要な役割を果たしました[31]。粒子の疎水性とシェルコア構造は、主にNPとHSAの相互作用中のアルブミンコンフォメーションの変化の原因でした[30]。

この研究では、CHP、CH修飾アニメーションプルラン（CHAP）、およびCH修飾カルボキシル化プルラン（CHSP）の3つのNPを製造しました。それらの構造と特性はフーリエ変換赤外（FTIR）とNMRで特徴づけられ、それらのサイズと電位は動的光散乱（DLS）によって決定されました。等温滴定カロリメトリー（ITC）と蛍光分光法を使用して、NP-HSA複合体の相互作用特性と、HSA構造に対する3種類のNPの影響を調査しました。ドラッグデリバリーシステムの将来の応用に不可欠なNP-HSA複合体の特性により、薬物放出への影響を明らかにします。

メソッド

資料

HSAは、Sigma Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 N 、 N -イミダゾールは上海ストックソリューションバイオテクノロジー（上海）からのものでした。エチレンジアミン、無水コハク酸は、Tianjin Star Chemical Reagent（Tianjin）から提供されました。他のすべての化学試薬は分析グレードであり、Changsha Huicheng Co.（Changsha、China）からのものでした。

CHP、CHSP、およびCHAPの合成

CHPの合成

コハク酸コレステロール（CHS）は以前に記載されたように合成されました[32]。ある量の2gのプルラン多糖類を10mLの脱水ジメチルスルホキシド（DMSO）溶液に溶解しました。次に、1.06 gのCHS、0.505 gのEDC•HCl、および0.268gのDMAPを適切な量のDMSO溶液に溶解しました。上記の2つのグループの試薬を混合し、室温で1時間活性化した後、50°Cの加熱油浴で48時間インキュベートしました。反応を停止し、室温まで冷却した後、適量の無水エタノールを加え、撹拌により白色の固体を沈殿させ、吸引濾過を繰り返すことにより得た。生成物を適量の無水エタノール、エチルエーテル、およびテトラヒドロフランで洗浄した後、50°Cのブラストドライヤーで乾燥させて白色の固体にしました（図1）。

CHP、CHSP、およびCHAPポリマーの合成

CHAPの合成

1.80 gCHPおよび1.00g N の量 、 N -ジイミダゾールを100mLのDMSOに溶解した。 50℃の油浴で4時間加熱および撹拌した後、3.60gのエチレンジアミンを添加し、続いてさらに24時間加熱および撹拌した。反応液が室温まで冷えたら、4000回遮断の透析バッグで再蒸留水で1日間透析し、凍結乾燥して、疎水的に修飾されたアニメーションプルランの生成物である淡黄色の固体を得ました。

CHSPの合成

1.80gのCHPを100mLの脱水DMSOに溶解し、次に0.5gの無水コハク酸と0.05gの4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）を10mLのDMSOに1時間溶解しました。 50℃の油浴で20時間加熱撹拌した後、反応を停止させた。反応液を室温まで冷却したら、適量の無水エタノールに入れて攪拌し、白色の固体を沈殿させた。白色の固体を適量の無水エタノール、ジエチルエーテル、およびテトラヒドロフランで数回洗浄し、50℃のブラストドライヤーで乾燥させた。得られた生成物は、疎水的に修飾されたカルボキシル化プルラン多糖類であった。

FTIRおよびNMR分光法

CHP、CHSP、およびCHAPのFTIRスペクトルは、FTIR分光法用のKBrペレットとして取得されました（Nicolet NEXUS 470-ESP、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）。 CHP、CHSP、およびCHAPの化学構造は、500 MHz ¹ で確認されました。 溶媒としてDMSO-d6を用いたH-NMR。 CHPポリマーのコレステロールの置換度は、アルファ-1,4およびアルファ-1,6グリコシド結合とメチレンピーク面積によって決定されました。

NPの準備と特性評価

CHP、CHSP、およびCHAP NPは、透析法によって調製されました[33]。簡単に説明すると、CHP、CHSP、およびCHAPを10 mLDMSOに溶解しました。 ＮＰを形成するために、混合溶液を透析バッグに２４時間注入して、ＤＭＳＯを除去した。 CHP、CHSP、およびCHAP NPの溶液をメンブレンフィルター（孔径0.45 m、ミリポア、ボストン、マサチューセッツ州、米国）でスクリーニングして、より大きな凝集したCHP、CHSP、およびCHAPNPを除去しました。得られた粒子のサイズ分布とゼータ電位は、DLS（Zetasizer 3000 HS、Malvern Instruments、Malvern、UK）によって11.4 V / cm、13.0mAで測定されました。

ITC

特定の濃度のHSA溶液をCHP、CHSP、およびCHAP NP溶液に滴下し、熱の変化をITC（VP-ITC、Microcal、マサチューセッツ州ノーサンプトン、米国）で測定しました。量0.9mMHSAを0.01mM CHP、CHSP、およびCHAP NP滴定セルに注入し、20回滴定しました。最初の液滴は2μLで、反応時間は180秒でした。残りの液滴は1滴あたり10μLで、反応時間は210秒で、温度は25°Cに設定しました。熱力学的パラメータと接続曲線は、28回の滴定で得られました。

蛍光分光法

HSAとCHPNPをHSAとCHPの分子比3.6：1で混合して、CHP-HSA、CHSP-HSA、およびCHAP-HSA混合物を調製しました。得られた混合物を2mL EPチューブに入れ、20 rpm、25°Cで24時間振とうしました。遊離HSAおよびNP結合HSAの蛍光スペクトルおよび蛍光強度（FI）を、蛍光分光光度法（島津RF-4500、日本）によって記録した。 HSA分子のトリプトファン発色団は280nmで励起され、発光スペクトルは290〜450nmで記録されました。励起および発光スリット幅は5および12nmでした。

異なる濃度の7つのNP溶液をHSA溶液と混合しました。混合溶液を2mL EPチューブに移し、9時間反応させました。得られたサンプルを収集して、波長290〜450nmの蛍光スペクトルを測定しました。純粋なHSA溶液の蛍光スペクトルを参照として使用し、シュテルン-フォルマー分析に従って結合定数を決定しました。蛍光消光データは、改良されたシュテルン-フォルマー方程式[34]を使用して分析されました：

ここで K _q はシュテルン-フォルマーの消光定数、 F ₀ および F は、消光剤の非存在下および存在下での342 nmでの蛍光強度、および[ Q ]はクエンチャーの濃度です。

円二色性分析

CHP-HSA複合体は、2つの異なる方法で調製されました。最初のもの（複合体I）は、HSAとCHPの溶液を単に混合することによって準備されました。 2番目（複合体II）は2 mL EPチューブに保存し、25°Cで12時間20rpmの振とう台にセットしました。タンパク質に添加された遊離HSAおよびNPの円二色性（CD）スペクトルは、0.1 cmキュベットセルを備えた37°CでCD分光計（JASCO J-810、日本）を使用して、波長200〜250nmで記録されました。 HSAの濃度はすべてのサンプルで1.0mg / mLでした。 HSAの相対的なα-ヘリックス含有量は次のように計算されました[35]：

ここで、θ ₂₀₈ は平均残基楕円率（deg cm ^-2 dmol ^-1 ）208 nmで、θ は楕円率、 M HSAの分子量、 C はHSAの濃度（mg / mL）、 L はキュベットセルの長さ（cm）であり、 N _r はHSA分子内のアミノ酸の数です。

インビトロでの薬物放出

ミトキサントロン（MTO）をロードしたNPは、透析法によって調製されました[36]。ミトキサントロンの標準曲線は、UV分光光度法によって取得されました。薬物負荷およびカプセル化効率は、記載されているように計算された[33]。 MTO放出は、リン酸緩衝生理食塩水での透析によってinvitroで研究されました。簡単に説明すると、MTOをロードしたNP（2 mg / mL）の溶液をビスキング透析チューブに入れ、50rpmのエアバスシェーカーで37°Cの放出媒体に対して透析しました。事前定義された時間に、リリースメディアが収集され、新しいリリースメディアが追加されました。 MTOの放出量は、608 nmでのUV分光光度法（UV-384 plus、Molecular Devices、USA）によって決定されました。累積放出率（ Q ％）は以前に説明されたように計算されました[37]。一定量のHSA溶液（0.1 mg / mL）を透析チューブに追加して、3種類のNPの薬物放出を測定しました。

結果

CHP、CHSP、およびCHAPポリマーの特性評価

FTIRスペクトル

図2は、CHP、CHSP、およびCHAPのFTIRスペクトルを示しています。 CHPスペクトルのデータは1731cm ^-1 でした。 （–C =O伸縮振動ピーク）および1161 cm ^-1 （–C =O伸縮振動ピーク）。この結果は、プルラン上でのエステル結合の形成を示しており、CHPが正常に合成されたことを示しています。

CHP（a）、CHAP（b）、およびCHSP（c）のFTIRスペクトル

CHPスペクトルと比較すると、CHAPスペクトルのデータは1648 cm ^-1 でした。 （–C =O振動吸収ピーク）、1734 cm ^-1 （–C =O振動吸収ピーク）、1539 cm ^-1 （–N–H曲げ振動ピーク）、および3742 cm ^-1 （–NH ₂ 伸縮振動ピーク）。これらの特徴的なピークによると、CHPにはアミド結合があり、エステル化反応によりCHAPの合成に成功しました。

CHPスペクトルと比較すると、CHSPスペクトルのデータは1710 cm ^-1 でした。 （–C =O伸縮振動ピーク）、1158 cm ^-1 （–C =O伸縮振動ピーク）、1560 cm ^-1 （ダブル–C =Oカップリング振動ピーク）、および1421 cm ^-1 （–O–H曲げ振動ピーク）。これは、CHPにカルボキシル基があり、その一部が塩になったことを示しています。

¹ H NMR

図3は、 ¹ を示しています。 CHP、CHSP、およびCHAPのHNMRスペクトル。合計0〜2.40 ppmはコレステロールの水素信号に属し、CHPの合成が成功したことを示しています。 DMSO-d 6 の特徴的なピーク およびメチレン（–CH ₂ CH ₂ –）はそれぞれ2.49および2.53ppmでシグナルを示しました。 CHPと比較して、CHAPは8〜9 ppmでシグナルを示しました。これはアミノ基に属し、エチレンジアミンがCHPにグラフトされていることを証明しました。 CHPの100グルコース単位あたりのコレステロールの置換度は、次の式を使用して、メチレンプロトンと糖プロトンの比率で計算できます[38]：

¹ CHP（a）、CHSP（b）、およびCHAP（c）NPのHNMRスペクトル

ここで A _δ2.53 はメチレン（水素）の特徴的な吸収ピークの下のスペクトル面積であり、 A _δ4.74 および A _δ5.01 は、それぞれalpha-1,6およびalpha-1,4グリコシド結合の特徴的な吸収ピークの下のスペクトル領域です。

¹ から CHPのHNMRスペクトル、コハク酸コレステロール（CHS）の置換度は4.50％でした。 CHSP NPの場合、メチレン基（–CH ₂ CH ₂ –）無水コハク酸とCHSの2つの側面が含まれています。メチレン基の置換度は12.34％でした（–CH ₂ CH ₂ –）およびカルボキシル基の7.84％。 CHAP NPの場合、メチレン基（–CH ₂ CH ₂ –）エチレンジアミンとCHSの2つの側面が含まれています。メチレン基の置換度は18.6％でした（–CH ₂ CH ₂ –）およびアミノ基の14.1％。

CHP、CHSP、およびCHAPNPのプロパティ

両親媒性ポリマーは、透析によって自己組織化され、親水性シェルと疎水性コアを備えたコアシェルNPを形成します。これには、抗がん剤をロードして、薬物をロードしたNPを形成できます。表面電荷やサイズなどのNP特性は、薬物担体としての治療効果に大きな影響を及ぼしました[39、40]。 DLSによって測定されたCHP、CHSP、およびCHAP NPのサイズ分布とゼータ電位を図4に示します。NPの平均サイズは、CHP、CHAP、およびCHSPでそれぞれ73.1、116.9、および156.9nmでした。ゼータ電位は、それぞれ-0.698、+ 12.9、および-15.4 mVでした（表1）。

ゼータ電位（ a ）およびサイズ分布（ b ）CHP NP（ ）、CHAP NP（ ）、およびCHSP NP（ ）

同じ疎水性基を持つプルランNPの場合、サイズは負に帯電したCHSPと正に帯電したCHAPの方が中性のCHPNPよりも大きかった。したがって、荷電基はNPの自己組織化挙動を妨害し、水溶液中で緩い構造を持つより大きなサイズのNPを形成します。 CHP NP、CHAP、およびCHSP NPのゼータ電位は、それぞれ-0.698 mV、+ 12.9 mV、および-15.4mVでした。したがって、ポリマーのアミノ基とカルボキシル基は、異なる表面電荷を持つNPを作成し、表面特性を変化させる可能性があります。

熱力学的解析

熱力学的分析は、CHP、CHSP、およびCHAPNPソリューションへのHSA滴定を伴うITCを使用して実行されました。電荷の異なるプルランNP溶液へのHSA滴定として、熱の変化を測定し、3種類の材料の接続特性、接続、分子の接続数を調べました。等温滴定温度計の元のスペクトルは、熱の変化を反映しています。上向きのピークは熱放出反応を示し、下向きのピークは熱吸収反応を示します[41、42]。 CHP、CHAP、およびCHSP NPをHSAで滴定すると、組み合わせから放出される熱は時間の経過とともに徐々に減少しました（図5）。全体として、26滴のHSA溶液をCHP NP溶液に滴定し、スペクトルのピークは上向きであり、反応の発熱性を示しています。 HSA溶液をCHSPNP溶液に滴定した場合にも、同じ現象が観察されました。ただし、HSA溶液をCHAP NP溶液に滴定すると、最初の4滴のスペクトルのピークは上向きになり、5番目の滴からはピークが下向きになり、吸熱反応を示しました。 CHPおよびCHSPNPのHSA吸収は発熱性であったため、反応は自発的でした。 CHAP NPのHSA吸収は、部分的に吸熱性であり、部分的に発熱性でした。これは、CHAPの正電荷に関連している可能性があります。

a へのHSA滴定の等温滴定熱量測定データ CHP、 b CHSP、および c 25°CでのCHAPNPセル内のNP濃度（250μL）は12μMであり、シリンジ内のタンパク質濃度は230μMでした。上のグラフは生データを示し、下のグラフは統合された熱を示しています

エンタルピー値は、HSAとNPの組み合わせによって放出される熱を反映しています。 HSAによるCHP、CHSP、およびCHAP NPのエンタルピー変化は、それぞれ42.827、80.3712、および22.3951 KJ / molでした（表2）。エンタルピー変化、発熱反応、両親媒性NPの化学構造、およびHSAの負電荷と組み合わせて、疎水性相互作用は主にHSAとCHPおよびCHSPNPとの相互作用を促進する可能性があります。注目すべきことに、CHAPのHSA滴定では、熱に負の値が含まれていました。 HSA分子には、NPの疎水性中心と組み合わせることができる疎水性ポケットが含まれているため[43]、HSAとCHAPの最初の4滴によって引き起こされる相互作用は主に疎水性の力によって駆動されます。 HSAは負に帯電し、CHAPは正に帯電しますが、5番目の液滴から始まりますが、反応の吸熱性のため、HSAとCHAPの間にも帯電力があります。

エントロピー変化の値は、HSAとNP間の反応の難しさを反映している可能性があります。 HSAおよびCHP、CHSP、およびCHAP NPのエントロピーはそれぞれ0.251、2.775、および0.201 KJ / mol Kであったため（表2）、CHPおよびCHAP NPはHSAに結合しやすく、CHSPNPはより困難です。 HSAにバインドします。

HSAおよびCHP、CHSP、およびCHAP NPのカバレッジは、それぞれ1.17、0.404、および0.845でした。 NPの濃度は、粒子の数ではなく、ポリマーの濃度に基づいて計算されます。単一のNPを含む単一のポリマー粒子の数がわからないため、各NPのどれだけがHSAに吸着されるかを正確に判断することはできませんが、カバレッジの値に基づいて、CHPNPがHSAの吸着が最も高いと結論付けることができます。

以前の実験では、親和性の値 K _A 、NPとHSA間の結合力の強さを反映しています[32]。 CHP NPの疎水性が強いほど、親和性も強くなります[44]。 HSAとCHPの結合定数は27.7×10 ⁴ でした。 M ^-1 、HSAとCHSPのそれは1.41×10 ⁴ でした M ^-1 、HSAとCHAPのそれは412×10 ⁴ でした M ^-1 。したがって、HSAと正に帯電したCHAPの組み合わせが最も強く、次に中性に帯電したCHPと負に帯電したCHSPが続きました。 HSAとCHAPの最も強力な組み合わせは、疎水性の力、電荷力の相互引力、およびおそらくHSAとCHSP間の相互に排他的な電荷に起因する可能性があります。

蛍光分光法

蛍光スペクトルを使用して、HSAと異なる表面電荷を持つ3つのNP間の相互作用を研究しました。 HSAには585アミノ酸残基が含まれており、214（Trp214）にTrp残基が1つだけあり、その蛍光スペクトルがUV領域で優勢です。他の分子がHSAと相互作用する場合、HSAと他の分子との相互作用に応じて、Trpの蛍光スペクトルが変化する可能性があります。 3つのNPをHSAと混合した場合、HSA蛍光スペクトルの最大発光ピークは化学シフトを受けませんでした。強度のみがある程度弱まりました（図6A）。 HSAの最大発光ピークは、HSAをCHAPNPと組み合わせたときに観察されました。

A HSAの蛍光スペクトル（1.5×10 ^{− 5} mol / L）（a）なしおよび（b）CHSPあり、（c）CHPおよび（d）同じ濃度のCHAP NP（4.2×10 ^{− 6} mol / L）。 B 時間の経過に伴う343nmでのCHSP、CHP、およびCHAPNPのHSA発光強度

実験的研究は、HSAとプルランNPの組み合わせが複雑なプロセスを示すことを示しました[45]。 3つのNPをHSA溶液に添加したところ、3つのNP-HSA複合体の蛍光強度が徐々に低下することがわかりました（図6B）。平衡は、12時間後の556.3 nmでのHSA-CHSP、10時間後の534.3 nmでのCHP-HSA、および8時間後の512.3nmでのCHAP-HSAで達成されました。さまざまなNP-HSA複合体の蛍光強度のバランスが取れている場合に必要な時間は、NPによって運ばれる電荷に関連しています。平衡に達するのに必要な最長時間は、負に帯電したCHSP–HSAで観察され、次に非帯電のCHP–HSAで観察されました。

3つのNP-HSA複合体（図6Aに示されている）の初期蛍光強度の急速な低下は、NPとHSAの急速な吸着によるものです。 NPとHSAの相互作用は結合の遅いプロセスであるため、その後の蛍光強度は一定の状態へのゆっくりとした減少を示します。一定の蛍光強度は、複合体形成の飽和状態を反映しています。 3つの異なる電荷を持つNPとHSAの間の相互作用は、初期の急速な再結合プロセスとその後の遅い再結合プロセスを経ました。負に帯電したHSAと負に帯電したCHSPの組み合わせは、帯電していないCHPと比較して、複雑な飽和を達成するためにより長い時間を必要としました。負に帯電したHSAと正に帯電したCHAPを組み合わせると、複雑な飽和状態に達するまでに最短の時間が必要でした。

図7A–Cは、さまざまな濃度のCHSP、CHP、およびCHAP NPと組み合わせてNP–HSA複合体を形成するHSAのスペクトルを示しています。 NPの濃度が高くなると、NP-HSA複合体の最大吸収ピークが減少し、逆相関を示します。

HSAの蛍光スペクトル（1.5×10 ^{− 5} mol / L）とCHSP（ A ）、CHP（ B ）、およびCHAP（ C ）さまざまな濃度で（a）0、（b）2.07×10 ^-7 、（c）3.31×10 ⁻⁷ 、（d）4.14×10 ⁻⁷ 、（e）8.28×10 ⁻⁷ 、（f）20.7×10 ⁻⁷ 、（g）33.1×10 ⁻⁷ 、および（h）41.4×10 ⁻⁷ mol / L。 D プロット（ n =7） F の場合 ₀ /（ F ₀ − f）vs 1 / [ Q ]、 Q は、それぞれCHSP（–◆–）、CHP（–■–）、およびCHAP（–▲–）の濃度です

正に帯電したCHAP-HSAは、平衡に達するまでの最短時間を示しました。

修正されたシュテルン-フォルマー方程式を使用して、蛍光消光データを分析しました。

ここで f _a は、蛍光物質とクエンチャー K との接触率です。 _q はシュテルン-フォルマー消光定数、 F ₀ は、消光剤を使用しない場合の342nmでの蛍光強度 F は、クエンチャーを使用した342 nmでの蛍光強度、および[ Q ]はクエンチャーの濃度です。

F の機能画像から ₀ /（ F ₀ − F ）ペア1 / [ Q ]、 f の値を取得できます _a および K _q 斜面と切片から（図7D）。観察された蛍光強度が主にNPとHSAの間の相互作用によって変化すると仮定すると、消光定数は複合体形成の結合定数と見なすことができます。 HSAおよびCHSP、CHP、およびCHAP分子の結合定数は、2.02、2.99、4.72×10 ⁵ でした。 M ^-1 、 それぞれ。以前の研究では、異なる疎水性置換を持つHSAとCHPNP間の相互作用について説明しました[30]。 HSA分子とCHPコレステロール間の疎水性相互作用は、CHP-HSAの形成に重要な役割を果たしました。 CHPの疎水性置換が大きいほど、CHPとHSAの結合定数が大きくなります。

本研究では、結合定数の値（ K _b ）はNPの電気的特性に関連しています。 CHAPなどの正電荷を持つ表面は、最大の K を持ちます。 _b 、およびCHPなどの電荷のない表面は、2番目に大きい K _b 。 K _b CHSPの場合、負の電荷が最も低くなりました。したがって、NPとHSAの間の疎水性相互作用に加えて、それらの間の静電相互作用もNP-HSA複合体の形成に重要な役割を果たします。

さらに、 f _a CHSP、CHP、およびCHAP NPの値はそれぞれ0.269、0.288、0.38であったため、Trp残基の一部がこの反応に関与していました。さらに、特定のNP / HSA濃度ではHSAの量が多すぎるため、反応系に遊離のHSA分子が存在しました。

CDスペクトル分析

図8Aは、25°Cの溶液中のCDスペクトル（a）遊離HSA、（b）CHSP–HSA、（c）CHAP–HSA、および（d）CHP–HSAを示しています。サンプルは複雑なIでした。HSAスペクトルのUV領域の208nmと222nmに2つの負のバンドがあり、これらはαの特徴的なピークです。 -らせん構造。 α -無料のHSAのらせん含有量は55％でした。複合体の開始時に、HSAとCHSP、CHAP、およびCHP NPの再結合により、α -HSAのらせん含有量はそれぞれ52.0％、48.57％、48.0％に減少しました。

A （a）遊離HSA、（b）CHSP–HSA、（c）CHAP–HSA、および（d）25°Cの溶液中のCHP–HSAのCDスペクトル。サンプルは複雑なIでした。 B （a）遊離HSA、（b）CHSP–HSA、（c）CHAP–HSA、および（d）25°Cの溶液中のCHP–HSAのCDスペクトル。サンプルは複雑なIIでした。 C 時間の経過とともにCHSP（–▲–）、CHAP（–●–）、およびCHP（–■–）と相互作用するHSAの208nmでの楕円率

図8Cは、208nmでの3つのサンプルの楕円率が時間の経過とともに変化することを示しています。 CHAPおよびCHPNPと組み合わせたHSAの楕円率は0から12時間に増加し、12時間で横ばいになりましたが、CHSP NPを組み合わせたHSAの楕円率はより速く増加しました。つまり、楕円率は0から9時間に増加し、9時間で横ばいになりました。したがって、3つのサンプルの楕円率は時間の経過とともに徐々に増加し、α-ヘリックス含有量は徐々に減少しました。楕円率が一定に保たれると、サンプルとHSAの再結合が完了しました。

図8Cは、CHSPとHSAの組み合わせで最速の表面吸収率が示されたことを示しています。 NPのサイズ、電荷、および疎水性は、NPの中心へのHSAの移動速度に影響を与える可能性があります。 CHPの表面は帯電しておらず、CHSPの表面は負に帯電しており、CHAPの表面は正に帯電しています。 CHSPとHSAの間に負電荷の相互排除が存在するため、HSAがCHSPNPセンターに移動する抵抗が大きくなります。 HSA上のNPの牽引力は、疎水性相互作用力によって駆動されます。 HSA上の3つのNPの牽引力は同じであるため、NPの中心に移動するHSAの最低速度は、HSAとCHSPNPの組み合わせで観察されました。粒子サイズはCHSP> CHAP> CHPの順であるため、粒子密度は逆の順序、つまりCHSP

ITCの結果は、CHSP NPの中心に向かって移動するHSAの量が最小ですが、他のタイプのNPと比較して最も速い速度であることを示しています。表3は、CHPNPの中心に向かって移動するHSAのα-ヘリックス含有量が最も低かったことを示しています。 HSAの二次構造が損傷するほど、HSAは中心に向かってより速く移動します。最速の速度は、CHSP NPの中心に移動するHSAで観察されました（図8C）。

図8Bは、（a）遊離HSA、（b）CHSP–HSA、（c）CHAP–HSA、および（d）25°Cの溶液中のCHP–HSAのCDスペクトルを示しています。サンプルは複雑なIIでした。複合体形成が完了した後、α -CHSP、CHAP、およびCHPと再結合したHSAのらせん含有量は、それぞれ46.27％、44.55％、および42.91％に減少しました（表3）。相互作用時間の増加に伴い、HSAの二次構造が変化し、α -ヘリックス含有量は、NPとの複合体形成の過程で減少しました。

薬物放出

3種類の薬物負荷NPと薬物負荷NP-HSA複合体を用いてMTOの薬物放出速度を測定しました。遊離MTOの薬物放出は4時間で約99.8％でした（図9）。 CHP、CHAP、およびCHSP NPの48時間での放出率は、それぞれ53.68％、58.54％、および63.24％でした。すべてのNPからの薬物放出は、バースト放出プロセスである最初の8時間で速く、持続放出プロセスである12時間後も薬物放出は安定したままでした。 NPからのinvitro薬物放出は、胃腸のpHと酵素の影響を受けず、ナノマテリアルの溶解はほとんど薬物放出をもたらしません。放出は主に溶解と拡散によって決定されます[46]。 48時間の薬物放出速度は、NPのサイズに対応して、CHSP> CHAP> CHPの順でした。最速の放出速度は、最大サイズで負に帯電したCHSPで見つかりました。 CHSPよりも小さいサイズで正に帯電した2番目の速い薬物放出速度が見られました。 CHPは電気的に中性であり、その薬物放出速度は最小限でした。したがって、NPの形成に関与するポリマー表面基は、NPのサイズに影響を与え、最終的にはNPの薬物放出に影響を与えます。

invitroで37°Cのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のプルランNPのミトキサントロン（MTO）放出（□：遊離ミトキサントロン、○：CHP、△：CHAP、▽：CHSP、◁：CHAP–HSA、◇：CHP– HSA、▷：CHSP–HSA）

48時間でのHSAとCHAP、CHP、およびCHSPの組み合わせからの薬物放出率は、それぞれ32.45％、33.86％、および35.76％でした。 NPとHSAの組み合わせ後、48時間での薬物放出は、HSAを含まないNPと比較して大幅に減少しました。これは、主にHSAの抵抗効果と吸着効果に起因していました。 48時間後、化合物の薬物放出はCHSP–HSA> CHP–HSA> CHAP–HSAの順でしたが、HSAフリーNPの薬物放出はCHSP> CHAP> CHPの順でした。 NP-HSA化合物は著しく遅い薬物放出を示しましたが、CHP-HSAの総放出は48時間で21.23％減少しましたが、CHAP-HSAの総放出は25.68％減少し、CHSP-HSAの総放出は28.48％減少しました。 ＮＰの薬物放出は、ＮＰのサイズおよびＮＰ表面上のポリマー疎水性基に関連している。 HSAの吸着は、薬物放出の大幅な減速につながる可能性があります。これは、NPの疎水性およびNPの表面電荷に関連しています[46]。 HSAの吸着は、NPのサイズと、自己組織化プロセス中のポリマーの疎水性基の置換度に密接に関連しています。それにもかかわらず、NPの薬物放出は、最終的にはNP自体の特性によって決定されます。

ディスカッション

図10に示すように、NP-HSA複合体の形成は、粒子コアのコレステロール基とHSAの疎水性ドメインの芳香族アミノ酸との間の疎水性力によって促進されます。混合後、HSAは表面コレステロールユニットと相互作用し、NP表面に急速に吸着されます。次に、粒子コアのコレステリックユニットに由来する疎水性の力により、NP表面に吸着されたHSAが処理されます。 NPシェルの多糖鎖の立体障害を克服すると、吸着されたHSAは徐々にコアに移動します。親水性多糖鎖の疎水性相互作用と耐性のバランスが取れた後、HSA分子は粒子コアに入り、コレステロール基に疎水的に結合してNP-HSA複合体を形成します。

NPへのHSAの吸着

CHAPおよびCHSPNPの場合、HSAの再結合は複雑なプロセスであり、疎水性の駆動力の牽引下でHSAとの電荷相互作用も受けます。疎水性置換が同じで表面電荷が異なる3種類のNPの結合定数は、CHAP> CHP> CHSPの順でした。電気的特性もNP–HSAの形成に大きな役割を果たします。このプロセスでは、CHSP-HSA複合体の形成は、NPシェルの構造と負電荷間の反発力によってブロックされ、接続が緩くなりました。急速な吸着と遅い再結合の間、HSAのスパイラルの程度はCHSPNPの方がCHPNPやCHAPNPよりも低くなります。したがって、NPの表面電荷は、粒子自体の性質を変えるだけでなく、タンパク質複合体にも影響を及ぼします。

現在の研究では、NPとタンパク質間の相互作用に対するNP表面電荷の影響を調査しました（図10）。 HSA吸着を伴うプルランNPの3つの異なる電荷は、依然として急速な吸着と遅い再結合を示しました。正に帯電したCHAP複合体を持つHSA分子の数が最も多く、疎水性の力によるNP-HSAの急速な吸着、中心へのHSA分子の移動、電荷作用によるNPの表面へのHSA分子の吸着などがあります。 CHPおよびCHSPに吸着されたHSA分子は、主にNPの疎水性中心に分布し、CHSPはより少ないHSA分子を吸着しました。吸着されたHSA分子の数は、NPの疎水性に関係しています。疎水性の置換度が高いほど、より多くのHSAが吸着されます[41]。 3つのNPのコレステロール置換は同じであり、正に帯電したNPによって吸着されるHSA分子の数が最も多かったため、NPとHSAの吸着は、NPの疎水性と表面電荷に関連していました。

NPとHSAの間の表面吸着容量は、NPの疎水性と電荷にも関係しています。 HSAとNPの間の結合力は、NPの疎水性、表面電荷、サイズ、および構造によって決まります。 αヘリシティは、吸着の開始時と完全なCHP-HSA複合体で最も減少しました。 CHP NPは、最小のサイズと最大の密度を備えています。 CHP NPは、疎水性の牽引力によって中心に向かって移動しました。 CHP NPシェルの糖鎖は、中心への移動を阻害するために大きくなりました。 HSAのペプチド鎖の延長はより大きく、α -ヘリックスが最も減少しました。 CHAP NPには疎水性と電荷力がありますが、サイズが比較的大きく、構造が緩く、周辺部の抵抗が小さく、ペプチド鎖の延長が小さく、αの含有量が少ないです。 -ヘリックス。一部のHSAは、吸着の電荷力とαによってNPの表面に残りました。 -ヘリカルコンテンツもHSAのこの部分では小さくなっています。 α -CHAPのヘリックス含有量はCHPのそれよりも減少しませんでした。これは主に、α-ヘリックス含有量の減少につながるペプチド鎖伸長によって誘発された中央の引っ張り力によるものです。 CHSPとHSAの複合体形成の過程で、中央の引っ張り力の役割は帯電力とは逆方向になり、その結果、移動力の中心が弱まります。 CHSPNPはCHAPNPよりも大きく、CHAPNPの構造は緩いです。 CHAPのHSAの吸着数はCHSPの吸着数よりも多いため、αの減少 -CHSPのヘリシティはCHAPNPのヘリシティよりも低くなります。したがって、NPとHSAの間の相互作用、およびαの減少 -ヘリシティはすべて、サイズ、密度、置換の疎水性、NPの表面電荷、およびHSA接続の数に関連しています。

NPが血液に入った後、タンパク質の吸着はNPの機能に影響を与えます。たとえば、薬物の放出が遅く制御され、血液循環から血管バリアを通過し、組織を標的とし、細胞に入るなどです。 NPは体内のHSAと相互作用し、NPのinvivoでの動作に影響を与えます。吸着されたタンパク質の数は、NPの特性と密接に関連しています。 HSAはNPを吸着します。これは、臓器内の分布とNPの除去に影響を与え、それによって体内の薬物の濃度と薬物の有効性を変化させます。

最後に、サイズ、疎水性、表面電荷などのNPの特性は、invivoでのNPの薬物放出に影響を与えます。特定のタンパク質吸着で特定の機能を実行する特定の材料を設計できます。

結論

この研究では、CHP、CHSP、CHAPの3種類のナノ薬物担体を構築しました。サイズ、電荷、NPの薬物負荷特性、NPとHSA間の相互作用、および薬物放出はすべて、ナノ材料の電荷量と電荷タイプに密接に関連していました。疎水性の置換度が同程度の場合、アミノ置換が大きいCHAP NPが最大で、CHSP NPが2番目に大きく、CHPNPが最小でした。 NPのサイズと表面電荷は、HSAの適用範囲、結合定数、および薬物放出の遅延に不可欠でした。正に帯電したCHAP結合定数が最も強く、薬物放出が最も速く、CHPNPが最も高いカバレッジを示しました。 HSAの組み合わせは、NPの薬物放出をさらに遅らせました。 HSAに吸着されたCHAPNPは、薬物放出速度が最も遅かった。

略語

CH：

コレステリック液晶

CHAP：

CH修正されたアニメーションプルラン

CHP：

コレステリック疎水性（CH）修飾プルラン

CHSP：

CH修飾カルボキシル化プルラン

DMSO：

脱水ジメチルスルホキシド

HSA：

ヒト血清アルブミン

K _b ：

結合定数

MTO：

ミトキサントロン

NP：

ナノ粒子