食道扁平上皮癌に対する有効性を高めるためのオートファジー阻害剤（LY294002）と5-フルオロウラシル（5-FU）の組み合わせベースのナノリポソーム

背景

食道扁平上皮がん（ESCC）は、中国などの東アジアでより蔓延している一般的なタイプの食道がんの1つです[1、2]。 ESCCの5年生存率は約25％です。 ESCC治療の主な治療選択肢は手術です。しかし、補助化学療法はESCC治療に大きな影響を与えると考えられています[3、4]。単一の薬物療法に基づく化学療法治療は、癌細胞の不均一性のために治療効果が低いという結果になったことが報告されています[5]。癌細胞はしばしば単一の抗癌剤に耐性があり、自然界では効果がありません。この点で、2つ以上の薬剤の組み合わせは、異なる細胞標的を標的とすることにより相乗的に作用します[6、7]。オートファジー阻害剤は、癌細胞の多剤耐性（MDR）を克服することが報告されています。細胞の栄養と成長因子が限られている場合、オートファジーは癌環境に切望されている恒常性を提供し、その生存に貢献します[8]。オートファジーは、化学療法剤から癌細胞を保護するのにも役立ちます。この研究では、オートファジー阻害剤としてLY294002（LY）を選択しました[9]。

いくつかの研究では、オートファジー阻害剤は抗がん剤と組み合わせると最も効果的であることが報告されています。この研究では、化学療法剤として5-フルオロウラシル（5-FU）を選択しました。 5-FUは主に扁平上皮がんの治療に適応されており、乳がんやその他のがんの患者さんに使用されています[10]。 5-FUは、水素の代わりにウラシルのC-5位にフッ素原子を持っています。 5-FUの抗がん効果は、BaxやBcl-2などのさまざまな分子の調節から生じ、がん細胞のアポトーシスを誘導します[11、12]。 5-FUとLYの潜在的な細胞毒性効果にもかかわらず、両方の薬剤は水溶性と安定性の懸念が低く、血漿半減期が短く、正常細胞に望ましくない毒性作用があります[6]。さらに、両方の抗がん剤の単純なカクテル混合物は、薬物のランダムな放出とさまざまな組織での薬物の制御されていない分布のために相乗効果を誘発しません[7]。したがって、治療効果を高めるために、プログラムされ、十分に制御された方法で両方の抗がん剤を送達することが最も重要です。

ナノ粒子は、癌を標的とする用途向けのドラッグデリバリーキャリアとして広く研究されてきました[13]。難溶性薬物はナノ粒子に安定して組み込まれ、それによってその溶解性と生物学的利用能が改善される可能性があります。すべての担体の中で、リポソームは全身投与への適合性について広く研究されてきました[14、15]。以前の研究は、ドキシル、ミオセット、リポプラチナなどを含む多くの市販のリポソーム製剤が利用可能であることを示した。リポソームの体循環は、親水性シェルとしてのポリエチレングリコール（PEG）の表面結合によって改善される可能性があります[16]。 PEGのナノサイズで親水性の層は、血液循環を延長し、細網内皮系（RES）を介した血漿クリアランスを減少させます。さらに、NPは、強化された透過性および保持（EPR）効果を介して腫瘍組織に受動的に蓄積する可能性があります[17、18]。したがって、化学療法薬とオートファジー阻害剤を単一の担体に組み込むことができれば、ESCCで相乗的な抗がん効果を発揮することが期待できます。

これまでのところ、本研究の主な目的は、ESCCを治療するために5-FUとLYの組み合わせを投与することでした。この目的のために、5-FUとLYはPEG化ナノリポソームに安定して組み込まれました。オートファジー阻害剤（LY）の早期放出は癌細胞の保護メカニズムを破壊し、その後、5-FUは癌細胞でより強力に作用すると予想されています。薬物を充填したリポソームは、粒子サイズ、形状、および放出パターンの観点から特徴づけられました。細胞取り込みおよび細胞生存率アッセイは、ESCC癌細胞で実施されています。さらに、アポトーシスアッセイは、アネキシンV / PI染色およびHoechst33382染色によって実施されました。最後に、抗腫瘍効果の研究がESCC細胞を含む異種移植動物モデルで実施されました。

メソッド

資料

5-フルオロウラシルは、中国のSigma-Aldrichから購入しました。 2-（4-モルホリニル）-8-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-4-オン（LY294002、LY）は、中国の北京Huafeng United TechnologyCorporationから購入しました。 L-a-ホスファチジルコリン（卵/鶏）（EPC）、ジステロイルホスファチジルエタノールアミン-ポリエチレングリコール（2000）（DSPE-PEG）、およびコレステロールは、中国のAvanti PolarLipidsから購入しました。他のすべての化学物質は試薬グレードであり、さらなる精製に使用されました。

デュアルドラッグロードナノリポソームの調製

EPC、DSPE-PEG、コレステロールをメタノール-クロロホルム混合物（10：4：1 M比（合計10 mg））で混合し、この有機混合物に対して、5-FU（1.5 mg）とLY（1.5 mg）を混合しました。追加した。有機溶媒は、ロータリーエバポレーター（Buchi、USA）を使用して60°Cで1時間蒸発させました。脂質薄膜をPBSバッファーで1時間水和させた後、ポリカーボネートメンブレン（200 nm）を介してミニ押出機で押し出しました。薬物をロードしたナノリポソームを、MWが3500のミリポアチューブで濾過しました。薬物をロードしたリポソームを上部チャンバーから収集し、捕捉されていない薬物をHPLC法で測定しました。薬物の負荷とカプセル化は、次の方程式を使用して計算されました。

粒子サイズ分析

ナノ粒子の粒子サイズとサイズ分布は、ゼータサイザー（Nano ZS、Malvern Instruments、英国）を使用した動的光散乱（DLS）技術によって決定されました。蒸留水で適切に希釈した後、25°Cで粒子サイズを測定しました。すべての測定は3回行った。

形態解析

NPの形態は、最初に透過型電子顕微鏡（TEM; H-7600、日立、東京、日本）によって加速電圧100kVで研究されました。サンプルは、カーボンコーティングされた銅グリッドにロードされ、乾燥されました。 NP形態は、原子間力顕微鏡（AFM）でさらに観察されました。サンプルは雲母の表面に置かれました。

インビトロリリース研究

5-FUおよびLYをロードしたPEG化ナノリポソーム（FLNP）からの5-FUおよびLYのin vitro放出を、37°C​​のリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）で調べました。 NP分散液（担体に各薬物1mgを含む1ml）を透析膜（MW〜3500）に入れ、両端を密封しました。透析膜は、30mlの放出培地が入ったチューブに入れられました。透析膜を含むチューブをシェーカーバスに入れ、前提条件の時点でインキュベートしました。特定の時点で、100μlのサンプルを取り出し、等量の新しいバッファーと交換しました。緩衝液中に放出された薬物の量は、HPLC法によって研究された。 L-2200オートサンプラーとL-2420UV-Vis検出器で構成される高速液体クロマトグラフィー（HPLC）システム（Hitachi、東京、日本）を使用しました。 Inertsil C18カラム（150mm×4.6mm、粒子サイズ5 µm、Cosmosil、Nacalai Tesque Inc.、米国）を、移動相のアイソクラティック溶出下で、流速1.0 mL / min、カラム温度25°で使用しました。 C。相関係数（ r ）の両方の薬剤で、0.025〜2μg / mlの間に良好な直線性が観察されました。 ² ）約0.9995。 5-FUとLYのLOD（μg/ ml）はそれぞれ0.020と0.050でした。 5-FUとLYのLOQ（μg/ ml）はそれぞれ0.070と0.150でした。

細胞培養

食道がん細胞株EC9706は、10％FBSおよび100 units / mLペニシリン、5％CO ₂ 中の100mg / mlストレプトマイシンを含む通常のRPMI培地で培養されました。 加湿器の湿度は95％です。

細胞取り込み分析

NPの細胞取り込みは、共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM）によって観察されました。この目的のために、ローダミンBをロードしたNPを調製し、HEPESバッファーを備えたSephadexG-50カラムを使用したゲルろ過によって精製しました。細胞を12ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートしました。次に、細胞をローダミンBをロードしたNP（10μg/ ml）に曝露し、2時間インキュベートしました。細胞をPBSで3回洗浄し、2％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、PBSで再度洗浄した。次に、細胞を核染色剤としてのDAPIで染色した。細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡（Nikon TE2000-E顕微鏡）で観察しました。

細胞への取り込みは、フローサイトメーターを使用してさらに観察されました。細胞を12ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートしました。次に、細胞をローダミンBをロードしたNPに曝露し、それぞれ1時間と2時間インキュベートしました。次に、細胞を抽出し、PBSで2回洗浄した。細胞をPBSバッファーに再懸濁し、CELLQuestソフトウェア（Becton Dickinson Biosciences、San Jose、CA、USA）を備えたCalibur蛍光活性化セルソーターを使用して分析しました。

細胞毒性アッセイ

個々の製剤の細胞毒性の可能性は、3-（4,5-ジメチル-2-チアゾイル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイによって評価されました。簡単に言うと、1×10 ⁴ 細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートしました。次に、細胞をさまざまな濃度の遊離5-FU、LY、5-FU + LY、FLNPにそれぞれ曝露し、さらに24時間インキュベートしました。 MTT溶液を調製し（5 mg / ml）、10μlのMTT溶液を各ウェルに加え、4時間インキュベートしました。 DMSOを添加してホルマザン結晶を抽出し、マイクロプレートリーダー（Synergy™HTXマルチモードマイクロプレートリーダー）（570 nm）を使用して吸光度を調べました。

アポトーシスアッセイ

癌細胞のアポトーシスは、アネキシン-V / PI染色プロトコル（BD Biosciences、USA）によって決定されました。簡単に説明すると、EC 9706を12ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートしました。細胞を遊離の5-FU、LY、5-FU + LY、FLNPとそれぞれインキュベートし、さらに24時間インキュベートしました（1μgの同等の薬物濃度）。細胞を抽出し、アネキシンV-FITCとPIで室温で15分間染色した後、FACS CELLQuestソフトウェア（Becton Dickinson Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ、米国）を使用したフローサイトメトリー分析で数えました。

Hoechst33342アッセイ

癌細胞のアポトーシスは、Hoechst33342染色プロトコルによってさらに決定されました。簡単に説明すると、EC 9706を12ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートしました。細胞を遊離の5-FU、LY、5-FU + LY、FLNPとそれぞれインキュベートし、さらに24時間インキュベートしました（1μgの同等の薬物濃度）。細胞を2％PFAで固定し、Hoechst 33342（1μg/ ml）で15分間インキュベートしました。次に、細胞のアポトーシスを蛍光顕微鏡で観察しました。

ウエスタンブロッティング

EC 9706細胞を播種し、遊離の5-FU、LY、5-FU + LY、FLNPでそれぞれ処理し、さらに24時間インキュベートしました。次に細胞を溶解し、上清をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にかけ、ポリフッ化ビニリデンメンブレン（Millipore）にブロットしました。メンブレンを5％スキムミルクでブロックし、続いて特定の一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートしました。二次抗体コンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼとのインキュベーション後、シグナル検出用のECLシステム（AbClon）を使用してブロットを明らかにしました。フィルムは、コダックM35-AX-OMATプロセッサを使用して開発されました。

InVivo腫瘍増殖阻害

動物実験は、中国江蘇省のスベイ人民病院の施設内動物管理使用委員会によって有名なガイドラインに従って実施されました。 6週齢の雌ヌードマウスに1×10 ⁶ を接種した。 100μlの培地中のマウスの右側腹部にあるOE-19細胞。腫瘍は80mm ³ まで成長させました。 （10日目）。動物を５つのグループに分け、各グループに６匹のマウスを入れた。マウスに5mg / kgの固定用量でそれぞれの製剤を注射し、実験の最初の10日間に3回投与しました。腫瘍の大きさは、ノギスを使用して腫瘍の体積で測定し、式を使用して推定した大きさでした。ボリューム=（幅 ² ×長さ）/ 2。

統計分析

データは平均±標準偏差として表されました。統計的有意性は、 t を使用して決定されました テストと分散分析（ANOVA）。 P <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

癌細胞はしばしば単一の抗癌剤に耐性があり、自然界では効果がありません。この点で、2つ以上の薬剤の組み合わせは、異なる細胞標的を標的とすることにより相乗的に作用します。オートファジー阻害剤は、癌細胞の多剤耐性（MDR）を克服することが報告されています。いくつかの研究では、オートファジー阻害剤は抗がん剤と組み合わせると最も効果的であることが報告されています。この研究では、化学療法剤として5-フルオロウラシル（5-FU）を選択し、オートファジー阻害剤としてLY294002（LY）を選択しました。血漿半減期が短く、望ましくない毒性作用をもたらす遊離薬物の溶解性と安定性の懸念に対処するために、PEG化ナノリポソームに5-FUとLYを安定して組み込んでいます（図1）。

5-フルオロウラシルおよびLYをロードしたPEG化ナノリポソームの調製の概略図

5-FUおよびLYをロードしたナノリポソームの調製と特性評価

二剤を充填したリポソームは、薄膜水和法によって調製された。ブランクリポソームの平均粒子サイズは約110nmであり、優れた分散度指数であることがわかりました。デュアルドラッグロードリポソーム（FLNP）の粒子サイズは〜150 nmに増加し、良好な多分散性指数（PDI〜150）を示しました（図2a）。粒子サイズの増加は、主にリポソームへの疎水性薬物の取り込みに起因していました。粒子サイズが約200nmの場合、透過性と保持効果（EPR）が強化されるため、腫瘍組織への薬物の蓄積が促進されることが報告されています。薬物を充填したリポソームは、その表面にPEGが存在することに起因する長期保存能力を示し、これが防汚効果に寄与した。さらに、FLNPは約25 mVの平均表面電荷を示し、コロイド安定性を示しています。負の表面電荷は、体循環での相互作用を回避します。

FLNPの物理化学的特性。 a DLS法によるFLNPの粒度分布。 b FLNPのTEM画像。 c FLNPのAFM画像

FLNPの形態は、TEMを使用して最初に観察されました（図2b）。見られるように、粒子は典型的な球形であり、銅グリッドに均一に分散していた。周囲のわずかに灰色がかったシェルは、その表面にPEGが存在することに起因していました。 TEMから観察された粒子サイズは、DLSから観察されたものと比較してわずかに小さかった。 TEMからの粒子サイズは〜130 nmでしたが、DLSからの粒子サイズは〜150nmでした。 2つの手法による粒子のサイズの違いは、測定の状態に起因する可能性があります。 TEMは乾燥状態の粒子を測定し、DLSは水和状態の粒子とPEG鎖の伸びを測定します。粒子の形態は、AFMによってさらに確認されました（図2c）。粒子は円形で、雲母の表面に平らな物体として存在していました。

薬物の装填とinvitroでの薬物放出

FLNPは、両方の薬物で高い捕捉効率（5-FUで92.5％、LYで86％）を示し、有効成分の負荷は約〜16％ w でした。 / w 。 FLNPからの5-FUおよびLYのinvitro放出挙動は、リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で観察されました。 FLNPの2つの成分は、pH7.4の条件で制御された方法で放出されました。たとえば、24時間の終わりまでにリポソームから放出される5-FUの〜30％とLYの〜40％。薬物の放出は90時間まで続き、5-FUの約60％とLVの約75％が放出されました（図3）。放出速度は24時間後から90時間まで大幅に減少し、NPシステムからの薬物の拡散が遅いことを示していることに注意してください。薬物のそのような制御された放出は、癌を標的とする用途にとって有益であろう。さらに、中性状態での薬物の徐放は、正常組織への副作用が少ないことを示しています。 LYは5-FUに比べて比較的速く放出されることは注目に値します。 LYは癌細胞を5-FUに対してより敏感にし、腫瘍組織の細胞毒性効果を高めるため、これは有益な状況になります。

リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）中のFLNPからの5-FUおよびLYの放出プロファイル。放出された薬物の量は、HPLC分析によって定量化されました

セルラー内部化調査

共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）は、FLNPの細胞内パターンを決定するために実行されました。ローダミンBは、ESCCでのNPの細胞内取り込みを追跡するための蛍光プローブとして使用されました。見られるように（図4）、核の周囲の細胞質に強い赤色の蛍光シグナルが観察され、典型的なエンドサイトーシスを介した細胞の取り込みを示しています。受容体を介した細胞への取り込みにより、酸性環境での薬物の段階的な放出が可能になります。粒子のナノサイズは、NPシステムの容易な内部移行を可能にしました。結果は、薬物が単純な拡散ではなく特定の経路を介して癌細胞に侵入したことを明確に示しました。細胞への取り込みは、FACSによってさらに監視されました。見られるように、NPの顕著な取り込みは1時間のインキュベーション後に観察され、細胞の取り込みはインキュベーション時間（2時間）の増加とともに増加しました。 NPの細胞への取り込みが増えると、カプセル化された抗がん剤の細胞内濃度が高まり、ESCCの治療効果がさらに高まります。

a FLNPと2時間インキュベートした後の、HT-29がん細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像。核をDAPIで染色し、ローダミンBを蛍光プローブとして使用しました。 b さまざまな時点でのインキュベーション時のFLNPのフローサイトメーター分析

インビトロ抗がん効果

個々の製剤の細胞毒性効果は、MTTアッセイによって研究されました（図5）。示されているように、遊離薬物および組み合わせNPは、ESCCにおいて典型的な濃度依存性の細胞毒性効果を示した。 5-FUは、癌細胞においてLYと比較して比較的高い抗癌効果を示しました。 5-FUとLYの組み合わせは、個々の薬剤と比較して高い細胞毒性効果をもたらしました。最も重要なことは、FLNPは、無料のカクテルの組み合わせと比較して、癌細胞で有意に高い抗癌効果を示したことです。 5-FU、LY、5-FU + LYおよびFLNPのIC50値は、それぞれ2.68μg/ ml、5.98μg/ ml、1.54μg/ ml、および0.58μg/ mlでした。これは、LYが癌細胞のオートファジーを抑制し、5-FUへの反応性を高めることができるという事実に起因する可能性があります。制御された方法での薬物のよりプログラムされた放出のために、FLNPは無料のカクテルの組み合わせよりも効果的であったことに注意する必要があります。 FLNPからのLYのより速い放出は、オートファジー阻害につながり、5-FUに対する癌細胞の感受性を改善し、より多くの細胞死をもたらします[19]。癌細胞に入った後の5-FUは、フルオロウリジン一リン酸（FUMP）を介してフルオロウリジン三リン酸（FUTP）に変換されるか、2つの異なる経路を介してフルオロデオキシウリジン三リン酸（FdUTP）に代謝されることが報告されています。 FdUTPは、チミジル酸合成酵素（TS）の基質として機能し、ヌクレオチド合成をブロックします。 5-FU代謝物は、TSのヌクレオチド結合部位に結合し、ヌクレオチド合成を阻害します。このサイクルにより、デオキシチミジン三リン酸（dTTP）が枯渇し、DNA合成が妨げられ、癌細胞死が促進されます[20、21]。

それぞれ遊離5-FU、LY、5-FU + LYおよびFLNPとのインキュベーション時のHT-29癌細胞の細胞生存率。細胞生存率はMTTアッセイによって決定されました

アポトーシスエッセイ

製剤のアポトーシス効果は、アネキシンV / PI染色法によって評価されました（図6a、b）。これにより、個人および併用薬システムのアポトーシス効果を決定することができます。 MTTアッセイと一致して、5-FU（〜20％）はLY（〜12％）と比較して癌細胞のアポトーシスを増加させ、5-FU + LYの組み合わせはアポトーシス細胞死を増加させました（〜30％）。他のグループと比較して、FLNPは癌細胞のより大きなアポトーシス（〜48％）を誘発し、受容体を介した細胞取り込みが抗癌剤の細胞内濃度を大幅に増加させ、より高い治療効果をもたらしたことを示唆しています。 FLNPのより高い抗癌効果の重要な理由は、主に、LYが腫瘍細胞を感作し、5-FUがその強力な細胞毒性効果を誘発するカプセル化された薬物の連続放出に起因していました。抗がん療法は、周囲の正常細胞に損傷を与えることなく、がん細胞にアポトーシスを誘導することによって機能します。 FLNPのかなりのアポトーシス活性は、主に、エンドサイトーシスの取り込みと細胞内環境での薬物の連続放出を介した細胞内のナノ粒子のより高い蓄積に起因し、相乗的な治療効果をもたらしました。オートファジー阻害剤（LY）の早期放出は癌細胞の保護メカニズムを破壊し、その後、5-FUは癌細胞でより強力に作用すると予想されています。

それぞれ遊離5-FU、LY、5-FU + LYおよびFLNPとのインキュベーション時のHT-29癌細胞の細胞アポトーシスの代表的なフローサイトメトリー分析結果。左下、生細胞;右下、初期アポトーシス細胞;右上、後期アポトーシス細胞;左上の壊死細胞

ウエスタンブロット分析

製剤の作用機序は、ウエスタンブロット分析によって決定されます（図7）。それぞれの製剤への曝露によるアポトーシス促進性および抗アポトーシス性タンパク質レベルの発現を図8に示します。p53は重要な細胞周期調節因子の1つであり、そのダウンレギュレーションは癌細胞の生存率の増加に関連しています。製剤がp53の発現レベルを有意にダウンレギュレーションし、ESCC細胞への顕著な効果を示していることがわかります。 DNA損傷はカスパーゼカスケードの活性化をもたらし、細胞アポトーシスの特徴と考えられているPARP-1の切断をもたらすことが報告されています[22、23]。我々の結果は、5-FUとLYが個別にカスパーゼ-3とPARPの発現を増加させ、予想通りFLNPがこれらのタンパク質マーカーの顕著な発現を誘導し、優れた抗癌効果を示したことを明確に示しました。一貫して、FLNPは抗アポトーシスタンパク質（Bcl-2）の発現を有意にダウンレギュレーションし、ESCCの治療効果を改善する効率を示しています。

それぞれ遊離5-FU、LY、5-FU + LYおよびFLNPとのインキュベーション時のHT-29癌細胞のウエスタンブロット分析。切断されたカスパーゼ-3、PARP、Bcl-2およびp53のウエスタンブロット分析が決定されました

動物モデルでのinvivo抗腫瘍効果研究。製剤を含まない5-FU、LY、5-FU + LY、FLNPをそれぞれ腫瘍マウスに投与し、有効性を20日間研究しました

InVivo腫瘍増殖阻害分析

マウスにそれぞれの製剤をマウスに注射し、20日まで腫瘍の体積を記録しました。見られるように（図8）、対照群は18日目までのすべての時点で腫瘍体積の着実な増加を示しました。対照と比較して、遊離薬物は腫瘍の成長を制御しました。しかし、それは満足のいくものではありませんでした。 2つの薬剤のカクテル混合物は、腫瘍体積の制御において個々の薬剤よりも比較的効果的でした。重要なことに、FLNPは有意に（ p <0.05; p <0.0001）他のグループと比較して高い抗腫瘍効果。最終的な腫瘍体積は〜500 mm ³ でした 〜1400 mm ³ と比較して 未処理のマウスの場合。腫瘍モデルにおける有意に高い抗腫瘍効果は、強化された透過および保持効果のために腫瘍組織に蓄積される可能性があるナノサイズの粒子に起因した。腫瘍組織における薬物の制御放出もまた、そのより高い有効性に貢献しました[24]。

結論

結論として、5-フルオロウラシル（5-FU）およびLY294002（LY）をロードしたPEG化ナノリポソームは、食道扁平上皮癌（ESCC）を標的とするために首尾よく調製されました。 FLNPは、酸性環境での薬物の段階的な放出を可能にする受容体を介した細胞取り込みを示しました。 5-FUとLYの組み合わせは、個々の薬剤と比較して高い細胞毒性効果をもたらしました。最も重要なことは、FLNPは、無料のカクテルの組み合わせと比較して、癌細胞で有意に高い抗癌効果を示したことです。 FLNPからのLYのより速い放出は、オートファジー阻害につながり、5-FUに対する癌細胞の感受性を改善し、より多くの細胞死をもたらします。一貫して、FLNPは他のグループと比較して癌細胞のより大きなアポトーシス（〜48％）を誘発しました。ウエスタンブロット分析は、5-FUとLYが個別にカスパーゼ-3とPARPの発現を増加させることを明確に示しましたが、予想通り、FLNPはこれらのタンパク質マーカーの顕著な発現を誘導し、優れた抗癌効果を示しました。単一のナノキャリアからのオートファジー阻害剤と化学療法薬のプログラムされた放出は、ESCCにおける抗癌療法の可能性を高めると信じています。さまざまな扁平上皮癌に関するより広範な研究と、直交異方性モデルおよび患者由来異種移植片（PDX）モデルの開発は、将来の調査の対象となるでしょう。

略語

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

強化された透過性と保持効果

ESCC:

Esophageal squamous cell carcinoma

FLNP:

5-FU and LY-loaded lipid nanoparticles