制御された薬物放出および強化された化学光熱療法のためのレドックス不安定ポリマーシェルを備えたポリドーパミンベースの複合ナノ粒子

はじめに

非侵襲的な局所癌治療である光熱療法（PTT）は、その高い選択性と最小限の副作用のために癌治療で大きな注目を集めています[1]。 PTTでは、投与された近赤外線（NIR）レーザー照射は、光熱変換（PTC）剤によって吸収され、局所温熱療法に変換されて腫瘍の切除につながります[2、3、4]。金ナノ構造[5,6,7]、炭素ベースのナノ材料[8,9,10,11,12]、Fe ₃ など、さまざまなナノ材料がPTC効果を明らかにしています。 O ₄ ナノクラスター[13、14、15]、CuSナノクリスタル[16]、および天然メラニン[17]は、すべてNIR組織の光学ウィンドウで強い吸光度を示します。これらのPTC剤の中で、ムール貝に見られる接着タンパク質の模倣物であるポリドーパミン（PDA）は、強力なNIR吸収、高いPTC効率（40％）、優れた生体適合性、および生分解性を示します。 18、19]。しかし、PTTの単回使用は、周囲の正常組織に損傷を与えることなく、標的領域での熱送達が不十分であるため、限られた臨床効果を示します[20]。この問題に対処するために、温熱療法と化学療法剤の組み合わせによる化学光熱療法は、腫瘍への薬物送達の促進と温熱療法による薬物毒性の増加に起因する相乗効果のために多くの研究者によって利用されてきました[21、22]。

最適化された治療効果を達成するために、現在の作業は、高性能の光熱変換、優れた薬物負荷能力、および制御された薬物放出挙動を備えた新しい治療用ナノ粒子の開発に専念しています。 「スマート」ポリマー層がシステムに導入されました。これは、切断可能なリンカーによって架橋され、トリガーされた方法でキャリアの分解性と制御された薬物放出を可能にします。遊離チオールによる切断が可能なジスルフィド結合は、酸化還元状態に対する敏感な応答、血液循環の高い安定性、および優れた生体適合性により、切断可能なリンカーとして有望な候補です[23]。ジスルフィド結合を組み込んだ薬物担体は、腫瘍細胞に入ると選択的に分解される可能性があり、還元型グルタチオン（GSH）濃度（約2〜10 mM）は細胞外液よりもはるかに高くなります[24、25、26]。ここでは、コアとしてのPDA球と、シェルとしてのジスルフィド結合架橋ポリ（メタクリル酸）（PMAA）で構成される新しいタイプの複合ナノ粒子を調製しました。これはPDA @ PMAAと呼ばれ、PDAコアとポリマーシェルのレドックス不安定性。 PDA @ PMAA複合ナノ粒子の構造、特性、および薬物放出挙動が研究され、化学光熱治療効果がMTTアッセイによってさらに実証されました。

メソッド/実験

資料

塩酸ドーパミン（DA-HCl）と塩化メタクリロイルおよびグルタチオン（GSH）は、中国の上海にあるAladdin ReagentCorporationから入手しました。メタクリル酸（MAA）と N、N ’ -ビス（アクリロイル）シスタミン（BAC）はSigma-Aldrichから購入しました。 2,2-アゾビスイソブチロニトリル（AIBN）は、Sinopharm Chemical Reagent Companyから入手し、エタノールから再結晶しました。アンモニア水溶液（NH ₃ •h ₂ O、30％）、アセトニトリル、および無水エタノールは、Shanghai Lingfeng Chemical ReagentCompanyから購入しました。塩酸塩の形のドキソルビシン（DOX）は、Beijing Huafeng United TechnologyCompanyから入手しました。 MTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイおよびその他の生物学的試薬はInvitrogenCorp。から購入しました。カルセイン-AMはBojinBiotech、Inc。（Xi'an）から購入しました。 。すべての化学試薬は分析グレード以上であり、上記の場合を除いて、さらに精製することなく使用されました。

特性評価

透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、Tecnai G2 20 TWIN透過型電子顕微鏡（FEI、米国）で観察されました。粒子の流体力学的直径およびゼータ電位は、90°の散乱角で動的光散乱（DLS）粒子サイズ分析器（Malvern Nano-ZS90）によって実施された。 UV-visスペクトルは、Perkin-Elmer Lambda750分光光度計によって室温で実行されました。フーリエ変換赤外（FT-IR）スペクトルは、Nicolet 6700FTIR分光法でKBrプレスプレートを使用して記録されました。 PDAおよびPDA @ PMAAナノ粒子のNIR加熱効果は、808 nmの連続波NIRレーザー（Changchun New Industries Optoelectronics Technology、Changchun、China;スポットサイズ：6mm×7mm）を使用し、出力でレーザー照射することで特性評価されました。密度5W cm ⁻² 300秒間。照明前と照明後の温度は、0.1 ^° の精度で熱電対によって測定されました。 C.細胞画像は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM、Leica TCS SP8 STED 3X）で取得しました。

PDA @PMAA複合ナノ粒子

PDA球の合成は、脱イオン水（90 mL）、エタノール（40 mL）、およびNH ₃ の混合溶液で実行されました。 •h ₂ O（3 mL）、0.5gの塩酸ドーパミンを加える。溶液を30 ^° で撹拌した。 ２４時間Ｃにし、生成物を遠心分離して洗浄した。 PMAAシェルは、以前の研究を参考にした蒸留沈殿重合によって合成されました。 MAA（100 mg）、BAC（10 mg）、およびAIBN（3 mg）を25 mLのアセトニトリルに溶解した後、50mgの調製したままのPDA球を添加しました。次に、混合物を100 ^° に加熱した。 Cを2時間撹拌し、生成物を遠心分離して洗浄した。 PMAAシェルの厚さを調整するためにPDAとMAAの質量比を0.5から6まで変化させ、レシピの詳細を表1に示しました。

PDA @PMAAの光熱効果

PDA @ PMAAの水性分散液（50μgmL ^-1 ）96ウェルセルプレート（ウェルあたり100μL）に配置し、808 nm NIRレーザー（5 W cm ^-2 ）で照射しました。 ）、および照明前と照明後の温度を測定しました。

薬物のロードとリリース

DOXは、PDAまたはPDA @PMAAナノ粒子の薬物負荷と制御放出性能を調査するためのモデル薬物として選択されました。特定の手順は、以前の作業[27、28]を参照しています。簡単に説明すると、10mgのPDAまたはPDA @ PMAA-1ナノ粒子を1mLのDOX水溶液（1 mg mL ^-1 ）に分散させました。 ）、これは事前にpH8.0に調整されています。室温で24時間穏やかに攪拌した後、分散液を遠心分離してDOXをロードしたPDA @ PMAAナノ粒子を収集し（12,000 rpm、10分）、脱イオン水で2回洗浄して、アンロードしたDOXを除去しました。上澄みのUV吸光度スペクトルを測定し、480nmでの強度を使用してDOXの負荷と放出を分析しました。薬物負荷量（LC）およびカプセル化効率（EE）は、次の式に従って表されました。LC（％）=（負荷された薬物の重量）/（ナノ粒子の総重量）。 EE（％）=（ロードされた薬剤の重量）/（最初に追加された薬剤の重量）

GSHの有無にかかわらず、リン酸緩衝液（pH7.4および5.5）中で37°Cでinvitro放出試験を実施しました。通常、対応するバッファーに分散したDOXをロードしたPDA @ PMAAナノ粒子を透析バッグ（分子量カットオフ14,000 Da）に入れ、100mLの放出媒体に浸しました。サンプルは37 ^° に保たれました 連続振とう下のC。さまざまな時点で、UV-visスペクトル分析のために2 mLの外部バッファーを取り出し、等量の新鮮な培地を補充しました。すべてのDOX放出データは、3回の測定で平均化され、放出含有量は次の式で計算されました。放出含有量（％）=（放出媒体中の薬物の量）/（ナノ粒子にロードされた薬物の量）×100。薬物放出pH7.4リン酸緩衝液中でのレーザー照射によるDOX負荷PDA @ PMAAナノ粒子の挙動は、同様の手順に従って実行されました。 NIRライトを1時間に5分間適用しました。

インビトロ細胞アッセイ

HEK-293T細胞（ヒト胎児腎臓細胞、正常細胞）およびA549細胞（ヒト肺腺癌上皮細胞、癌細胞）を、10％FBS（ウシ胎児血清）、ペニシリン（100）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養しました。 U mL ^-1 ）およびストレプトマイシン（100 mg mL ^-1 ）5％CO ₂ の加湿雰囲気 37°Cで。

細胞への取り込みを観察するために、A549細胞（1×10 ⁴ ウェルあたりの細胞数）を1.5mLの培地で6ウェルプレートに播種しました。培地は、24時間後にDOXをロードしたPDA @PMAAナノ粒子を含む培地と交換されました。 1時間または4時間後、蛍光観察の前に、細胞によって内在化されていない遊離ナノ粒子を洗い流すために、新鮮なDMEMおよびPBSを添加しました。ナノ粒子の細胞内分布はCLSMによって観察されました。蛍光はλで画像化されました _EX （488 nm）DOXの場合、偽色は人為的に赤に設定されました。

A549細胞に対するDOXをロードしたブランクのPDA @ PMAAナノ粒子の細胞毒性は、標準的なMTTアッセイによって評価されました。セル（密度10 ⁴ ウェルあたりの細胞）を96ウェルプレートで24時間インキュベートして、細胞を付着させました。次に、DOXをロードしたブランクのPDA @ PMAAナノ粒子と、さまざまな濃度の遊離DOXをそれぞれセルに追加しました。 NIRレーザーグループの場合、レーザー（λ =808 nm）を適用して、5 W cm ^-2 の電力密度で細胞を照射しました。 1時間のインキュベーション後300秒間。次に、37 ^° で24時間のインキュベーション時間の後 C、20μLのMTT溶液（5 mg mL ^-1 リン酸緩衝液中）をMTT（5 mg mL ^-1 を含む新しいDMEM）に交換しました ）、そして細胞をさらに4時間インキュベートした。次に、上澄みを除去し、150μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を各ウェルに加えてホルマザンを溶解した。 10分間のインキュベーション後、分光光度計を使用して570nmで吸光度をモニターした。各データポイントは、5つのウェルのデータを平均することによって収集され、未処理の細胞がコントロールとして使用されました。細胞生存率は、対照細胞の吸光度を処理細胞の吸光度と比較することによって計算されました。 HEK-293T細胞に対するブランク複合ナノ粒子の細胞毒性の同じプロセスが上記のように実行されました。

PDA @PMAAナノ粒子およびDOXをロードしたPDA @ PMAAナノ粒子の抗腫瘍効果を視覚化するために、NIRレーザー照射の有無にかかわらず、細胞を3×10 ⁴ の密度で6ウェルプレートに播種しました。 ウェルあたりの細胞。細胞は、PDA @ PMAA-1ナノ粒子、DOXをロードしたPDA @ PMAA-1ナノ粒子、または100μgmL ^-1 のナノ粒子濃度で24時間遊離DOXに曝露されました。 または同等のDOX濃度5μgmL ^-1 。 NIRレーザーグループの場合、レーザー（λ =808 nm）を適用して、5 W cm ^-2 の電力密度で細胞を照射しました。 1時間のインキュベーション後300秒間。続いて、細胞をカルセイン-AMで30分間インキュベートし、PBSを使用して3回洗浄し、λでCLSMを使用して観察しました。 _EX （490 nm）。

結果と考察

PDA @PMAAナノ粒子の調製と特性評価

PDA球は、経由の基本的な条件下で準備さ​​れます 溶液酸化法。ジスルフィド架橋ポリマー層によるPDA球の化学的コーティングは、MAAとBACをそれぞれモノマーと架橋剤として使用する蒸留沈殿重合法によって達成されました（図1）。この多機能複合ナノ粒子は、3つの側面で他の治療用ナノ粒子に比べて多くの利点を提供します。まず、PDAコアはNIR照射下で優れた光熱性能を示します。第二に、ジスルフィド結合の組み込みは、ポリマーシェルの選択的分解、ならびに癌細胞に入る際の制御された薬物放出を提供します。第三に、PMAAシェルはナノ粒子に優れたコロイド安定性を提供します。 PMAA層の厚さは、MAA球とPDA球の質量比を調整することで制御できます。得られたPDA球とPDA @ PMAAナノ粒子のTEM画像を図2に示します。 PDAとPDA @ PMAAナノ粒子の両方が単分散で、形状が球形であることは明らかです。 PDA球の平均直径は約100nmで、PDA @ PMAAハイブリッドナノ粒子のサイズは120±5〜200±10 nmの範囲で、PDAとMAAの質量比は0.5〜6の範囲でした。流体力学的サイズ（D _h ）およびPDAおよびPDA @ PMAAナノ粒子のサイズ分布も、表2に示すように、動的光散乱（DLS）によって特徴付けられました。PDA@ PMAAナノ粒子のサイズ分布は狭く、通常はPI値が0.09〜0.14でした。 D _h 一連のPDA @ PMAAナノ粒子は、TEDAとMAAの質量比を変化させることにより、176〜349 nmの範囲でした。これは、TEM観察によるサイズ成長の傾向と一致していました。特に、D _h 複合ナノ粒子のサイズはTEMで測定されたサイズよりも大きく、複合ナノ粒子が水性媒体中で高度に膨潤していることを示唆しています[29]。 PDAナノ粒子のζ電位は、PDAの表面にカテコール基があるため、-26.8mVでした。 PDA @ PMAAナノ粒子のζ電位は-30.2から33.2に変化し、カルボキシル基の存在がPMAAシェルに由来することを示しています。

PDA @ PMAAナノ粒子の合成、光熱効果、薬物負荷、および刺激応答性薬物放出の概略図

PDA @ PMAAナノ粒子のTEM画像（スケールバー、200 nm）。 a PDA。 b [email protected]。 c PDA @ PMAA-1。 d PDA @ PMAA-2。 e PDA @ PMAA-4。 f PDA @ PMAA-6

MAAはpH応答性であるため、PDA @PMAAナノスフェアもpH感受性を持っていると推測できます。図3に示すように、PDA @ PMAA-1ナノ粒子を例として取り上げ、PMAAコーティングされたナノ粒子の流体力学的サイズのpH依存性を調査しました。 pH8.5のリン酸緩衝液では、PDA @ PMAA-1ナノ粒子の流体力学的直径は約240nmであることがわかります。 pH 3.0の酸性環境では、流体力学的サイズは約1に大幅に縮小しました。 150nm。 PMAAポリマー鎖は高pHで高度にイオン化され、ポリマー鎖間の強い静電反発力により流体力学的サイズが拡大し、低pHではPMAA鎖のイオン化度が低いためサイズが縮小します[30]。 pH応答性PDA @ PMAAナノ粒子は、スポンジ状のポリマー層の崩壊が薬物放出を促進する可能性があるため、腫瘍細胞（6.5未満のpH）での薬物放出の制御に大きな可能性を示します。 PDA @ PMAAナノ粒子の化学構造は、フーリエ変換赤外（FTIR）分光法によって特徴づけられました（図4）。 BACおよびPDA @ PMAAナノ粒子のスペクトルでは、1650および1550 cm ^-1 に現れるバンド 、BACの典型的なアミドIおよびIIバンドに起因するものは、架橋剤BACが複合ナノ粒子にうまく導入されたことを示しています[25]。 1706 cm ^-1 のピーク PMAAのC =O基の伸縮振動に属する、は、PDAナノ粒子以外のPDA @ PMAAナノ粒子ではっきりと見ることができ、PMAA層のコーティングが成功したことを示唆しています。

さまざまなpHでのリン酸緩衝液中のPDA @ PMAA-1ナノ粒子の流体力学的直径

BAC架橋剤、PDAナノ粒子、およびPDA @ PMAAナノ粒子のFTIRスペクトル（上から下へ）

PDA @PMAAナノ粒子の光熱効果

NIR領域の吸光度は、PTC剤のPTC能力を決定する主な要因です。 PDA @ PMAAナノ粒子の光吸収能力を調べるために、それらのUV-visスペクトルを図5aに要約します。各サンプルは、600〜1000nmのNIR領域で明らかな吸収を示していることがわかります。 PDA @ PMAAと比較して、PDAは同等の質量濃度で808nmで最も高い吸収を示します。 PDA @ PMAAナノ粒子の吸光度は、PMAAシェルの厚さが減少するにつれて増加しました（PDA @ PMAA-6からPDA @ PMAA-0.5へ）。 NIR領域での強い光吸収により、PDA @PMAAの光熱効果をさらに調査することができました。図5bに示すように、PDAおよびPDA @PMAA水性分散液の光熱効果を100μgmL ^-1 の濃度で測定しました。 5 W cm ^-2 で808nmレーザーを照射 300秒間。ネガティブコントロールとして純水を使用しました。 PDA分散液の温度は41 ^° 上昇しました CおよびすべてのPDA @ PMAAサンプルよりも高く、808nmでの最大吸収と一致していました。 PDA @PMAA分散によって上昇した温度は17から33 ^° に達する可能性があります Cは、PMAAシェルの厚さが減少し（PDA @ PMAA-6からPDA @ PMAA-0.5に）、純水制御によって引き起こされる厚さよりもはるかに高くなります（3.5 ^° に達するだけです）。 C）。以前の研究では、55 ^° を超える温度での温熱療法が示唆されていました Cは固形腫瘍の熱焼灼において大きな利点を示した[31]。一連のPDA @ PMAAナノ粒子の最大温度上昇を比較すると、PDA @ PMAA-0.5（58 ^° のみ） C）およびPDA @ PMAA-1（56 ^° C）最大55 ^° に達する可能性があります C. PMAAシェルは、その薬物負荷容量を確保するために特定の厚さを持つ必要があることを考慮して、PDA @ PMAA-1が次の実験の代表として選択されました。

a 100μgmL ^-1 の濃度でのPDAおよびPDA @ PMAA水性分散液のUV-visスペクトル 。 b 100μgmL ^-1 の濃度でのPDAおよびPDA @ PMAA水性分散液の光熱効果 レーザー照射により測定された（λ =808 nm、5 W cm ⁻² ）

インビトロ薬物放出

ドキソルビシン（DOX）は、PDA @ PMAA-1複合ナノ粒子が還元条件下でカプセル化された薬物を放出する潜在的な能力を確認するために、モデル薬物として選択されました。複合ナノ粒子へのDOXのローディングは、9.1 wt％の理論的な薬物ローディング含有量と10 mg mL ^-1 のポリマー濃度で実行されました。 、および最終的な薬物負荷量およびカプセル化効率は、それぞれ5.1％および53.7％でした。これは、DOXをポリマーネットワークに効率的にロードできることを示しています。比較のために、DOXをロードしたPDAナノ粒子も準備しました。DOXをロードした含有量は3.7％でした。 PDA @ PMAA-1ナノ粒子のより高い薬物負荷容量は、DOX分子のアミノ基とPMAA鎖のカルボキシル基の間の強い静電相互作用に起因する可能性があります[25]。それを考慮して、PMAAシェルはレドックス切断可能なジスルフィド結合を持っており、プレロードされた薬物は、還元状態でプレロードされた薬物を効率的に放出するようにトリガーされます。わずかに酸性の腫瘍微小環境と、細胞内（1〜10 mM）と血漿（20〜40μM）の間のGSH濃度の大きな違いを考慮して、pH7.4および5.5のリン酸緩衝液を使用してinvitro薬物放出実験を設計および実施しました。腫瘍細胞および血流環境を模倣するための10mMGSHの有無[23、32、33]。図6に示すように、薬物の放出量は24時間でわずか10.8％であり、生理学的条件に分散したときにDOXがPDA @ PMAA-1ナノ粒子に安定して保持されたことを示しています。 10 mM GSHの存在下で、薬物の著しく迅速な放出が検出されました。還元環境でのジスルフィド結合PMAAシェルの分解により、DOXの累積放出は24時間以内に約72.8％でした。それでも、PDAコアの構造は、レドックス応答性の劣化後も完全性を維持します（追加ファイル1：図S2）。さらに、PMAAのカルボキシル基が酸性条件下でプロトン化され、ポリマーの崩壊をさらに引き起こしたため、10 mM GSHを含むpH5.5のリン酸緩衝液でDOXのバースト放出（24時間以内に約87％）が観察されました。ネットワーク。これらの放出プロファイルは、血漿中の薬物の漏出が少ないナノ粒子として、制御された薬物放出のためのPDA @ PMAAナノ粒子の有望な機能を意味しますが、腫瘍細胞に入ると薬物を速く放出します。さらに、pH7.4のリン酸緩衝液中のNIR照射によるDOX負荷PDA @ PMAAナノ粒子の薬物の徐放（24時間以内に約13％）が検出され、PDA @PMAAナノ粒子が照射時に構造的完全性を維持していることを示しています。 10 mM GSHの存在下でのPDAナノ粒子の放出挙動は、PDA @ PMAA-1ナノ粒子と比較して薬物の顕著な低放出（24時間で約30％）を示しました（追加ファイル1：図S1）。 PDAとPDA @ PMAAナノ粒子の放出挙動の大きな違いは、ジスルフィド結合によって架橋された分解性ポリマーシェルの導入が、レドックスによって引き起こされる薬物の効果的な放出を引き起こすことを示唆しました。

37 ^° でのPDA @ PMAA-1ナノ粒子のDOX放出プロファイル C 7.4リン酸緩衝液（○）、NIRレーザー照射による7.4リン酸緩衝液（□、10 mM GSHを含む7.4リン酸緩衝液（赤丸）、または10 mM GSHを含む5.5リン酸緩衝液（緑丸）

細胞アッセイ

DOXをロードしたPDA @ PMAAナノ粒子の細胞取り込みと細胞内薬物放出の調査は、A549細胞株に対してさらに実施されました。図7に示すように、DOXの赤色蛍光は、1時間のインキュベーション後に細胞質で観察でき、腫瘍細胞に対するナノ粒子の迅速な内在化を示しています。 4時間のインキュベーション後、細胞質および核全体に強い赤色蛍光が観察されました。より多くのナノ粒子が細胞によってエンドサイトーシスされ、腫瘍細胞の還元環境でのポリマーシェルの分解を通じて効率的にDOXを放出することが示唆されました。

（ a 用のDOXをロードしたPDA @ PMAAナノ粒子で培養されたA549細胞のCLSM画像 ）1時間および（ b ）4時間。各行には、微分干渉コントラスト顕微鏡画像、蛍光画像、オーバーレイ画像がそれぞれ左から右に表示されています。 （スケールバー、50μm）

PDA @ PMAAの生体適合性を評価するために、MTTアッセイによる細胞生存率テストに典型的な正常細胞（HEK-293T細胞）を選択しました。図8に示すように、0.1〜100μgmL ^-1 の広い濃度範囲では、ブランクPDA @ PMAA-1ナノ粒子の明らかな細胞毒性は検出されませんでした。 、PDA @ PMAA-1ナノ粒子の優れた生体適合性を示しており、生物医学分野での応用が保証されています。次に、ブランクまたはDOXをロードしたPDA @ PMAA-1ナノ粒子のインキュベーション濃度の関数としてのA549細胞（腫瘍細胞）に対する細胞生存率を測定し、各グループをNIRレーザー照射の有無にかかわらずグループに細分しました（図9 ）。レーザーを使用しないブランクPDA @ PMAA-1グループでは、細胞生存率への影響はほとんど観察されませんでした。これは、ブランク複合ナノ粒子に細胞毒性がないことを示しています。 5 W cm ⁻² 後 300秒間のNIRレーザー照射では、ブランクPDA @ PMAA-1グループの細胞生存率が明らかに低下し、100μgmL ^-1 の濃度で細胞の約54.3％が死滅しました。 。結果は、これらのPDA @ PMAA-1ナノ粒子が、温熱療法を誘発するNIR照射によってA549細胞に対して細胞毒性を示したことを示唆しています。 DOXをロードしたグループに関しては、DOXをロードしたPDA @ PMAA-1ナノ粒子は、用量応答的に細胞生存率の低下を示します。これは、遊離DOXと同様の効果があり、ジスルフィド結合で架橋したPMAAからの薬物の完全な放出を示します。シェル。 DOXをロードしたPDA @ PMAA-1ナノ粒子でNIRレーザーを照射して処理した細胞の場合、特に高線量の場合、細胞の生存率は非照射群と比較して大幅に低下します。たとえば、細胞を100μgmL ^-1 で処理した場合 DOXをロードしたPDA @ PMAA-1（5μgmL ^-1 を含む DOX）、細胞生存率は約15.7％に低下しました。これは、同じ用量のナノ粒子の下での光熱（〜54.3％）または化学療法（〜38.1％）単独の治療よりもはるかに低かったです。特に、50％の細胞阻害（IC ₅₀ ）短期間のNIRレーザー照射によるDOX負荷PDA @ PMAA-1の値は、2μgmL ^-1 と決定されました。 、これは遊離DOXのそれ（6.3μgmL ^-1 ）よりもはるかに低かった ）。これは、DOXをロードしたPDA @ PMAAナノ粒子の化学光熱療法が相乗効果を示したことを示唆しており、これは高温でのDOXの細胞毒性の増強に起因する可能性があります[34、35]。対照的に、NIRレーザーグループを使用した無料のDOXは、NIRレーザー照射によって引き起こされる局所的な温熱療法がないため、同様の相乗効果を示しません。処理後のカルセイン-AM（緑色、生細胞）染色細胞の蛍光画像は、NIRレーザー照射時にDOXをロードしたPDA @ PMAAナノ粒子で処理された生細胞の数が他のグループよりも大幅に少ないことを示しており、相乗的な抗腫瘍がさらに確認されましたNIR光照射によるDOX負荷PDA @ PMAAナノ粒子の効果（図10）。化学光熱併用治療の正の相乗効果の恩恵を受けて、それはより低い細胞毒性薬物投与量が同じ腫瘍殺傷効果を達成することを可能にし、したがって高薬物投与量での正常組織への重篤な副作用を回避します。まとめると、上記のデータは、これらのPDA @ PMAAナノ粒子が細胞内還元条件下で効率的に薬物を放出し、化学光熱併用療法に対して相乗的な腫瘍細胞殺傷効果を示し、癌治療の大きな可能性を示したことを示唆しています。

ブランクのPDA @ PMAA-1ナノ粒子に24時間曝露されたHEK-293細胞の細胞生存率

遊離DOX、PDA @ PMAA-1ナノ粒子、およびNIRレーザー照射（λ）の有無にかかわらずさまざまな濃度のDOXをロードしたPDA @ PMAA-1ナノ粒子で処理されたA549細胞の細胞生存率 =808 nm、5 W cm ⁻² ）300秒間

PBS、PDA @ PMAA-1ナノ粒子、DOXをロードしたPDA @ PMAA-1ナノ粒子、およびNIRレーザー照射の有無にかかわらず遊離DOXで処理された生A549細胞の共焦点蛍光画像（λ =808 nm、5 W cm ⁻² ）300秒間。生細胞をカルセイン-AM（緑色）で染色しました。スケールバーは50μmです

結論

多機能コアシェルPDA @ PMAA複合ナノ粒子は、蒸留沈殿重合によってPDAナノ粒子上にジスルフィド架橋PMAA層をコーティングすることによって合成されました。複合ナノ粒子は、PMAA層の優れた光熱変換効果と酸化還元に不安定な分解を示しました。典型的なサンプルPDA @ PDA @ PMAA-1の場合、PDA @PMAA分散液の温度は31 ^° 上昇しました。 100μgmL ^-1 の濃度のC 5 W cm ^-2 で808nmレーザーを照射 for 300 s. The DOX-loaded PDA@PMAA-1 nanoparticles were stable under the physiological environment with low leakage of DOX (10.8% in 24 h), while a rapid and full release of DOX was triggered in the reducing and weakening acidic condition (pH5.5 + 10 mM GSH). The cell viability of A549 cells treated with PDA@PMAA-1 nanoparticles under NIR irradiation was reduced significantly to about 15.7% at relatively low equivalent drug concentration (5 μg mL ⁻¹ ), which was much lower than photothermal (~ 54.3%) or chemotherapy (~ 38.1%) treatment alone under the same dose of nanoparticles and drugs. So the DOX-loaded composite nanoparticles realized a synergistic inhibition effect against cancer cells by the combination of photothermal therapy and traditional chemotherapy. This work demonstrated the feasibility of such composite nanoparticles to be a powerful platform for controlled drug delivery and could be exploited as combined chemo-photothermal therapy with improved therapeutic efficacy.

データと資料の可用性

The datasets generated during and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on request.

略語

AIBN:

2,2-Azobisisobutyronitrile

BAC:

N,N' -bis(acryloyl)cystamine

DA-HCl:

Dopamine hydrochloride

DLS：

動的光散乱

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

DMSO：

ジメチルスルホキシド

DOX：

ドキソルビシン

FBS：

ウシ胎児血清

FT-IR：

フーリエ変換赤外

GSH:

Glutathione

MAA:

Methacrylic acid

NIR：

近赤外線

PDA：

ポリドーパミン

PMAA:

Poly(methacrylic acid)

PTC:

Photothermal conversion agents

PTT：

光熱療法

TEM：

透過型電子顕微鏡