体内の銀ナノ粒子の分布を明らかにするためのsp-ICP-MSの前処理方法の最適化と評価

要約

人工ナノ粒子（ENP）の普及により、これらの粒子への曝露が増加しています。現在利用可能な分析技術では、生体組織内のENPの物理的特性を同時に定量化および分析することはできません。したがって、ENPへの暴露条件を評価するには新しい方法が必要です。単一粒子誘導結合プラズマ質量分析（sp-ICP-MS）は、ENPの定量的および定性的分析を実行できる魅力的なアプローチです。ただし、生物学的組織からENPを効果的に回収するための前処理方法がないため、生物学的サンプルへのこのアプローチの適用は制限されています。この研究では、さまざまな前処理方法を評価し、銀ナノ粒子（nAg）をモデルとして使用して、生体組織中のENPのsp-ICP-MS分析に最適な前処理条件を特定しました。前処理溶媒として5つの試薬（水酸化ナトリウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、硝酸、塩酸、プロテイナーゼK）をスクリーニングしました。我々の結果は、水酸化ナトリウムによる治療がマウス肝臓のnAgを検出するのに最適であることを示した。さらに、この前処理方法は、心臓、肺、脾臓、腎臓などの他の臓器にも適用できます。最後に、nAgまたは銀イオンの静脈内投与後のマウスの血液および肝臓中の銀の量と物理的特性を分析することにより、この方法の適用性を評価しました。私たちのsp-ICP-MSメソッドは、血液に投与されたnAgが部分的にイオン化され、肝臓では粒子の形（約80％）で、血液ではイオンの形（約95％）で分布する傾向があることを明らかにしました。結論として、生体組織中のENPのsp-ICP-MS評価のための前処理戦略を最適化し、肝臓と血液中のnAgの物理的特性の変化を評価することによってその適用性を実証しました。また、nAgの粒子形態からイオン形態への部分的な変化が、マウスに投与した場合の動態と分布に影響を与えることも示しました。

はじめに

ナノテクノロジーの最近の進歩により、100 nm未満の人工ナノ粒子（ENP）の開発が加速しています。 ENPは、他のマイクロサイズまたはより大きなサイズの材料と比較して組織透過性や表面反応が向上するなどの有益な特性があるため、化粧品、食品、医薬品などのさまざまな製品で広く使用されています[1、2]。たとえば、最も一般的なENPの1つである銀ナノ粒子（nAg）は、Ag ⁺ が安定して放出されるため、抗生物質に使用されます。。さらに、それらはプリンテッドエレクトロニクス技術の導電性材料として利用されています[3]。対照的に、nAgの小さな粒子サイズに関連する独特の物理化学的特性は危険な場合があります。これらの粒子は血液脳関門を破壊し、炎症を引き起こす可能性があることが知られています[4]。日常使用製品でのENPの使用の増加により、人間はさまざまなタイプのENPにさらされています。それらの継続的な使用は、それらの安全性を判断するために評価されるべきです[2、3]。

安全を確保するためには、「ハザード」（潜在毒性）と「暴露条件」の統合概念であるENPの「リスク」を理解することが不可欠です。 ENPの危険性は世界中で分析されていますが、ENPへの暴露状況を調査した研究はほとんどありません[5]。さらに、最近、培養細胞に取り込まれたnAgの細胞内分布がAg ⁺ とは異なることが報告されました。 [6]そしてそのAg ⁺ マウス組織中の粒子[7]。したがって、粒子サイズなどの物理的特性を評価し、体内の粒子とイオンを区別する必要があります[3、6、7、8]。

現在利用可能な分析技術を使用して、体内のENPの物理的特性を定量的に分析することは困難です。誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）は、定量分析には適していますが、イオンや粒子などのすべてのターゲットを定量中に区別できないため、物理的特性分析には適していません。対照的に、透過型電子顕微鏡（TEM）は、組織の一部のみが観察されるため、物理的特性の分析には適していますが、ENPの定量には適していません。したがって、ENPの生体内変化を研究するために、ENPの物理的特性分析と定量分析を同時に行うための新しい方法が必要です。

単一粒子-ICP-MS（sp-ICP-MS）は、ICP-MSに基づいており、滞留時間ごとに1つの粒子をアナライザーに導入するか、まったく粒子を導入しません。これは、分析によってピーク強度と粒子濃度を分析することにより、粒子サイズを決定するための魅力的な方法です。ピークレート。粒子とイオンは、ピークシグナルとバックグラウンドシグナルを分析することで区別できます[9]。以前のいくつかの研究では、ENPの定量および物理的特性分析にsp-ICP-MSを使用することが報告されています[10、11]。

ただし、これらの研究のほとんどは、環境水またはENPを含む市販製品を分析するためにsp-ICP-MSを使用し[10、11]、いくつかの研究は生体組織にsp-ICP-MSを採用しました。さらに、これらの研究では、プロテイナーゼK消化またはテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（TMAH）を使用して組織を前処理し、タンパク質と脂質のマトリックスを可溶化しました。試薬が異なれば可溶化特性も異なるため、前処理方法の違いが組織に分布するENPの回収率に影響を与える可能性があります。さらに、前処理方法がENPのサイズやイオン特性に影響を与えず、組織に分布しているENPを効率的に回収することが重要です。

この研究では、生物学的サンプル中のsp-ICP-MSのさまざまな前処理方法を評価および最適化して、モデルENPとしてnAgを使用して体内のENPの量と物理的特性を決定しました。

材料と方法

ENP

30、70、および100 nmの「Biopure」nAg（nAg30、nAg70、およびnAg100）は、nanoComposix（San Diego、CA、USA）から入手しました。 RM8013は、輸送効率を計算するための標準として使用され、米国国立標準技術研究所（Gaithersburg、MD、USA）から入手しました。各タイプのENPは、使用前に10分間超音波処理されました。

試薬

0.1 mol / L水酸化ナトリウム（NaOH）、25％TMAH、30％塩酸（HCl）、およびプロテイナーゼKの溶液は、和光（大阪、日本）から入手しました。 70％硝酸の溶液（HNO ₃ ）は関東化学（東京、日本）から入手しました。

動物

BALB / cマウス（雌、6週間）はJapan SLC（静岡、日本）から購入しました。マウスは、12時間の明/暗サイクル（8:00に点灯し、20：00に消灯）のある部屋に収容されました。食料と水は自由に与えられた。実験プロトコルは、日本の大阪大学の倫理ガイドラインに準拠していました。

動的光散乱による粒子サイズ分布の測定

nAgをmilliQ水で希釈して、最終的な銀（Ag）濃度を10μg/ mLにしました。次に、サイズとゼータキャピラリーセル（Malvern Instruments、Malvern、UK）に1 mLの溶液を充填し、Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments）で粒子分布と平均直径を測定しました。

Agの総質量の測定

サンプル中の総Ag濃度を測定するために、Agilent 7700x（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用しました。分析条件は、RF電力1550 W、キャリアガス1.05 L / min Ar、滞留時間100msでした。 MSモードで測定を3回繰り返した。内部標準法を使用し、Agの内部標準としてロジウムを使用しました。 ICP-MS分析のターゲット要素は¹⁰³ でした Rhと¹⁰⁷ Ag。銀とロジウムの標準溶液は和光（大阪、日本）から入手しました。

sp-ICP-MSの分析とその計算

sp-ICP-MS分析には、総Agの分析と同様のAgilent 7700x（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用しました。分析条件は次のとおりです。RF電力1550W、キャリアガス1.05 L / min Ar、滞留時間10 ms、分析時間30s。粒子サイズを計算するために、RIKILTによって公開された単一粒子計算ツールが使用されました[12]。

sp-ICP-MSの重要な粒子濃度

ストックnAg溶液濃度は1.0mg / mLで、2000、800、700、および600 pg / mL溶液の調製に使用されました。次に、これらの各溶液を10倍に段階希釈して、40種類のnAg溶液を得ました。 sp-ICP-MSにより、これら40サンプルの粒子濃度を測定しました。

マウス肝臓の前処理方法の最適化

マウスから採取した肝臓をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と混合しました（ w / v 1:10の比率）そして均質化。ホモジネートを100ng / mLのnAg溶液と混合しました。次に、混合物を次の試薬の1つで v で処理しました。 / v 1：1〜0.1 mol / LのNaOH溶液、25％TMAH、30％HCl、またはプロテイナーゼK溶液（10 U / mLプロテイナーゼK、0.01 M Tris-HCl、0.01 M EDTA、および0.5％SDS）の比率。サンプルを37°Cで3時間インキュベートし、残留物を収集して秤量しました。上清を500倍に希釈し、sp-ICP-MSで分析しました。

さまざまな臓器でのNaOH前処理の多様性評価

マウスから採取した心臓、肺、脾臓、腎臓をPBSと混合しました（ w / v 1:10の比率）、均質化され、100 nm / mLのnAgと混合されます。次に、 v の1mol / LNaOH溶液 / v 1：1の比率を加え、37℃で3時間インキュベートしました。インキュベーション後、残留物を収集して秤量した。上清を500倍に希釈し、sp-ICP-MSで分析しました。

nAg100とAgの量と物理的特性の評価⁺ 単回静脈内投与後のマウス

静脈内投与の場合、nAg100およびAgNO ₃ 0.25 mg / mLに希釈しました（Ag ⁺ として））5％ブドウ糖溶液で。 BALB / cマウスにnAg100（1.5または0.75 mg / kg）、AgNO ₃を静脈内投与しました。（Ag ⁺ として1.5または0.75mg / kg ）、または5％グルコース溶液（コントロール）。 24時間後、犠牲にしたマウスの血液と肝臓を採取しました。肝臓をPBSと混合しました（ w / v 1:10の比率）および均質化。血液と肝臓のホモジネートをTMAH溶液と混合しました（ v / v 1：1の比率）およびNaOH溶液（ v / v それぞれ1：1の比率）。これらのサンプルをICP-MSで分析してAg濃度を測定し、sp-ICP-MSで分析して粒子サイズや粒子とイオンの区別などの物理的特性を評価しました。

結果と考察

sp-ICP-MSによる粒子検出の最適化

sp-ICP-MS分析では、滞留時間ごとに検出器に粒子を1つまたはまったく導入しないことが重要です。滞留時間中に複数の粒子が検出器に導入された場合、複数の粒子の総質量は単一の粒子の質量と見なされます[13]。したがって、サンプルはsp-ICP-MS分析のために十分に希釈する必要があります。対照的に、ENPの濃度が非常に低いサンプルのsp-ICP-MS分析では、粒子の分布とサイズのデータが不正確になります。

nAg100の濃度と検出された粒子の数との関係を決定するために、sp-ICP-MSによる評価のためにnAg100ストック溶液を段階希釈しました。結果は、検出された粒子の数が、比較的低いAg濃度領域で理論的かつ直線的に増加したことを示した。対照的に、比較的高いAg濃度では、検出された粒子の数は理論値よりも少なかった（図1a）。このデータは、Ag濃度が高くなると、各滞留時間中に複数の粒子が検出器に導入される傾向があり、その結果、粒子サイズが過大評価されることを示しています。したがって、粒子サイズを正確に評価するには、理論値と異ならない検出粒子の最大数を決定する必要があります。次に、検出された粒子の数を理論値から差し引き、その差を縦軸としてプロットしました。結果は、検出された粒子の数が> 500の場合にサイズ推定の不一致が発生したことを示しました。これは、分析時間中に≤500の粒子を検出する必要があることを示しています（図1b）。これらのデータは1回の試行で取得されましたが、実験を繰り返しても同じ結果が示されました（データは表示されていません）。

分析条件を検証するために、さまざまな直径（nAg30、nAg70、nAg100）でnAgを希釈し、分析時間あたり500未満の粒子を検出し、それらの直径を評価しました。 sp-ICP-MS分析では、nAg30、nAg70、およびnAg100の一次直径がそれぞれ30.0±1.2、65.1±0.6、および97.4±0.6であることが示されました。さらに、動的光散乱（DLS）によって決定された流体力学的直径はそれぞれ36.4±1.6、70.6±1.7、および101±1.0であり、これらの値はsp-ICP-MSによって推定された値と類似しています。これらの発見は、sp-ICP-MS条件がさまざまなサイズのナノ粒子の直径を測定するのに適切であることを示唆しています。

マウス肝臓組織のnAgを検出するための前処理方法の最適化

体内のENPの物理的特性を定量化および決定するには、組織を完全に溶解する必要があります。さらに、粒子に物理的または化学的変化を引き起こすことなく、体内に分布する粒子とイオンを効率的に回収することが不可欠です。 5つの可溶化試薬、NaOH、TMAH、HNO ₃をテストしました、HCl、またはプロテイナーゼK、およびsp-ICP-MSによって量と物理的特性を分析し、肝臓をモデルとして使用して前処理戦略を最適化しました[14、15、16、17、18]。

肝臓ホモジネートをnAg100と混合して100ng / mLの最終Ag濃度を得た後、37°Cで各可溶化試薬で処理しました。まず、組織溶解度の指標として組織残留物の量を評価しました。組織の90％以上が、NaOH、TMAH、およびプロテイナーゼKでの処理によって溶解しましたが、組織の75％のみがHNO ₃によって溶解しました。およびHCl処理（図2a）。組織の80％近くが水で構成されていることを考えると[19]、HNO ₃ 、HCl、およびPBS処理は、不溶性組織マトリックスを溶解するには非効率的でした。対照的に、NaOH、TMAH、およびプロテイナーゼKによる処理は、組織の不溶性マトリックスを効率的に溶解し、組織内のnAgを正確に定量するためのそれらの適合性を示しています。次に、各粒子とイオンの回収率を分析し、処理ごとの物性の変化を評価しました。 Sp-ICP-MS分析では、酸性試薬（HNO ₃）で処理することにより、nAg100がほぼ完全にイオン化されることが示されました。これは、酸性試薬とプロテイナーゼKが粒子を溶解し、それらをイオンに変換したことを示唆しています。対照的に、組織をアルカリ試薬（NaOHおよびTMAH）で処理すると、最初に添加された量に対応する100 ng / mLのAgが粒子として検出されました。アルカリ処理後のイオンはほとんど検出されませんでした（図2b）。これは、NaOHとTMAHがnAgの物理的特性を維持していることを示しています。最後に、物性を詳細に分析するために、さまざまな試薬で処理した組織の粒子径分布を評価しました。 TMAH処理後の平均粒子径は100nmから120に変化しました（図2c）。さらに、TMAH処理後の粒子はより広くなり（図2d）、粒子の凝集を示しています。対照的に、組織をNaOHで処理した場合、平均粒子径は100 nmに近く、初期の粒子サイズに対応していました。これは、NaOHによる前処理がマウス肝臓組織でnAg100を検出するための最適な条件であることを示唆しています。

TMAH前処理は、さまざまな研究でsp-ICP-MS分析に広く使用されています。 TMAHは、粘度やpHなどのさまざまな物理的特性に基づいてnAg100の凝集を誘発する可能性があります。さらに、誘電率は凝集に関係している可能性があります。 3時間のTMAH処理は、TMAHのトリメチルアミン（TMA）とメタノールへの分解によって引き起こされる誘電率を増加させる可能性があります[20]。誘電率の増加により、誘電率に反比例するnAg100のゼータ電位がほぼゼロになり、nAg間の静電反発力が失われ、凝集が誘発されます。 nAg100をTMAHで短時間（1分）処理すると、平均粒子サイズは約100 nmになりました（データは示していません）。

さまざまな臓器でのNaOH前処理の多様性の評価

nAgを検出するためのNaOH前処理の多様性を評価するために、さまざまなマウス臓器（心臓、肺、腎臓、脾臓）をNaOHで処理し、粒子検出のためにsp-ICP-MSを実施しました。まず、組織溶解度の指標として組織残留物の量を評価しました。組織の95％以上の可溶化は、NaOH処理によって達成されました（図3a）。また、添加量に対応するAgが粒子として検出されました（図3b）。一部の回収率は100％を超えましたが、米国食品医薬品局の基準では、80〜120％の回収率は十分に信頼できるとされています[21]。したがって、私たちの分析は信頼できます。さらに、任意の臓器で検出されたnAgの平均粒子径は100 nmに近く、追加されたnAgの粒子サイズに対応していました（図3c、d）。これらの研究は、NaOH前処理が、マウスの肝臓だけでなく、マウスの心臓、肺、腎臓、脾臓でもnAgを検出するのに理想的であることを示唆しています。

まとめると、私たちの結果は、NaOH前処理がsp-ICP-MSによる動物組織中のnAgの定量および物理的特性分析に最適な前処理戦略であることを示しています。

nAgおよびAgの定量的および物理的特性分析のためのsp-ICP-MSの評価⁺ 生体組織で

nAgは体内またはそのAg ⁺ でイオン化しますこのプロセスの詳細は不明ですが、マウス組織の粒子。したがって、nAg100またはAg ⁺ の単回静脈内投与後のマウスの血液および肝臓におけるAgの量と物理的特性の両方を分析することにより、sp-ICP-MSの実用化を評価しました。。 ICP-MS分析は、Agが両方のAg ⁺ の血液で検出されたことを示しました。 -およびnAg100で処理したマウス（図4a）。さらに、Agは両方のグループの肝臓で検出されました（図4b）。次に、各サンプルのAgの物性を分析しました。両方のAg ⁺ の血液中に少量のnAgが検出されたため -およびnAg100で処理されたマウスでは、検出されたAgのほとんどがイオン型でした（図4c）。肝臓サンプルでは、Agの約80％がnAg100処理マウスで粒子として検出されましたが、少量のnAgがAg ⁺ で検出されました。処理されたマウス（図4d）。最後に、nAg100で処理したマウスの肝臓の粒子サイズをsp-ICP-MSで評価したところ、粒子サイズは約80 nmでした（図4e）。これらのデータは、Ag ⁺ 血中に投与すると粒子にほとんど変化せず、Ag ⁺ の物性血中および肝臓中の変化はありませんでした。対照的に、血液に投与されたnAg100は部分的にイオン化されていました。肝臓のAgの20％と血液中のほとんどのAgはイオンの形でした。部分的なイオン化の結果、肝臓組織のnAgの平均直径は、最初に投与された粒子の平均直径よりも小さかった（80対100 nm）。その結果、生物学的サンプルに適用可能なsp-ICP-MS戦略により、血液に投与されたnAg100は、肝臓では粒子（約80％）として、血液ではイオン（約95％）として分布し、ICP-MSメソッドではAgの量のみを評価し、粒子の物理的または化学的変化は評価しません。

結論

生体組織中のnAgのsp-ICP-MS分析に最適な前処理条件を特定し、動物組織中のENPの同時定量と物理的特性分析を可能にしました。また、生体試料の評価に適したsp-ICP-MS法を開発し、肝臓や血液中のnAg100の物性の変化を評価することでその適用性を実証しました。また、マウスに投与されたnAg100の粒子形態からイオン形態への部分的な変化がそれらの動態と分布に影響を与えることも示しました。この手法は、ENP曝露条件を評価し、ENPに対する生物学的反応を解明し、反応の根底にあるメカニズムを特定することにより、ENPのリスク分析に適用できます。