銀ナノ粒子との複合材料中の酸化グラフェンは、抗菌ナノプラットフォームの線維芽細胞および内皮細胞の細胞毒性を低減します

はじめに

抗菌性の表面を備えた材料は、医学および生物医学産業での使用のために広く探求されてきました[1]。ナノマテリアルは、抗生物質や化学薬品の代わりに使用できる効果的な代替抗菌剤と見なされています[2]。銀ナノ粒子（AgNP）は、その抗菌特性のために最も頻繁に使用されます[3]。ただし、特に高濃度でAgNPを含む抗菌活性を示すナノ粒子は、ヒト細胞に毒性を示し、ヒトの健康に影響を与える可能性があります[4、5]。したがって、生物医学産業では、表面がナノ材料でコーティングされた材料を適用すると、その安全性と毒性について疑問が生じます。

ナノマテリアルの潜在的な毒性を最小限に抑えるための可能な方法の1つは、抗菌特性を変更せずに移動性を制限することです。抗菌表面に使用され、材料から分離しないしっかりと付着したナノ材料は、ヒト細胞に対する毒性を低減します[6]。ナノ粒子で表面をコーティングする効果的な方法の1つは、超音波技術です[7]。超音波はナノ材料の構造変化を引き起こし、ナノ材料に応じて解凝集または凝集を引き起こします[8]。超音波技術は、金属イオンやナノ粒子など、さまざまな材料からのナノコンポジットの合成にも使用できます[9、10、11]。超音波処理は、AgNPやその他のナノ粒子による酸化グラフェン（GO）フレークの装飾など、さまざまなナノ材料の組み立てに使用されてきました[12]。

ナノ粒子の抗菌活性のメカニズムは、ナノ粒子の種類によって異なります。ただし、ナノ粒子の抗菌特性に関与する主なプロセスは次のとおりです。細胞成分との直接相互作用、および細胞成分の酸化や酸化還元プロセスの破壊を含む間接プロセス[3]。 AgNP抗菌活性は、AgNPと放出されたAg +イオンによる細菌細胞膜の直接破壊、活性酸素種（ROS）の合成の誘導、および細胞膜電位の崩壊に起因し、細胞内ATPの枯渇につながります[13 、14、15]。 GOは、GOおよびGOナノコンポジットの高い吸着能力によって引き起こされるROS合成およびGO表面への直接的な細胞固定化[16、17]により、細菌細胞に対して細胞毒性を示す可能性があります[18、19]。

しかし、ナノ粒子の毒性は細菌細胞で観察されただけではありません。一般に、ヒト細胞は、スケールが大きく、効果的な修復および防御メカニズムがあるため、バクテリアよりもナノ粒子に対する脆弱性が低くなりますが、特に高濃度で細胞毒性が観察されています。インビトロ研究におけるAgNP毒性は、同様のオーダーの濃度で発生しますが、より複雑な異なる生物学的システムまたは生物によって大幅に異なる可能性があります[20]。多細胞生物に対するAgNPの毒性は、上皮細胞を含む特殊な細胞組織などの構造的および生理学的差異のために、しばしば低くなります[21]。ヒト細胞のGO生体適合性は、濃度とシートの形態に依存します。より高い濃度では、GOは原形質膜への浸透とROSの合成の増加につながる可能性があります[22、23、24]。

以前の研究では、AgNPとGO（Ag-GO）ナノコンポジットで構成されるナノプラットフォームが、細菌（ Escherichia coli ）に対して高い抗菌効率を示すことを示しました。 、黄色ブドウ球菌 および表皮ブドウ球菌 ）および病原性酵母（カンジダアルビカンス ）、これはROS合成と原形質膜穿孔の増加に関連していた[25]。 Ag-GOは、両方のナノ材料の複合活性により、AgNPまたはGOナノプラットフォームよりも高い抗菌活性を示しました。ここでは、Ag-GOナノコンポジットでコーティングされたポリウレタンフォイルは、AgNPのみでコーティングされたフォイルよりも、線維芽細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、および代替のin vivoモデル（ニワトリ胚絨毛尿膜）に対する毒性が低いと仮定しました。

結果

AgNPとGOは親水コロイドでナノコンポジットを形成しました

透過型電子顕微鏡（TEM）分析を使用して、ナノ材料の形態とAg-GO複合材料内でのそれらの相互作用を評価しました（図1）。 AgNPは、平均サイズが約55nmの球状ナノ粒子でした。さらに、TEM画像は、銀ナノ粒子のGOへの付着を示しました（図1e）。これらの観察結果は、ゼータ電位分析でさらに確認されました。 Ag-GOのゼータ電位は、親水コロイドが超音波処理直後は不安定であったが、24時間後には安定したことを示しました（ゼータ電位：それぞれ-15.68および-27.7 mV;表1）。対照的に、AgNPハイドロコロイドは超音波処理直後と24時間後の両方で不安定でしたが、GOハイドロコロイドは非常に安定しており、24時間後には有意に変化しませんでした（ゼータ電位：それぞれ-31.11mVと-28.42mV）。さらに、動的光散乱（DLS）分析により、 Z -AgNPの平均サイズは93.1nm、GOは1485.0 nm、Ag-GOは1157.0nmでした。 AgNPサイズ分布は凝集体形成に関連する3つのピークを示し、GOおよびAg-GOサイズ分布は1つのピークを示しました（図1b、d、f）。

ナノ粒子の形態とサイズ分布。 a の透過型電子顕微鏡画像 銀ナノ粒子、 c 酸化グラフェンと e 銀ナノ粒子と酸化グラフェン複合材料。 b のサイズ分布 銀ナノ粒子、 d 酸化グラフェンと f 銀ナノ粒子と酸化グラフェン複合材料

ラマンスペクトルとフーリエ変換赤外分光法（FT-IR）を使用して、GOの構造的特徴を特徴付けました（図2）。図2aは、GOのD、G、およびD ’のデコンボリューションを示しています。 Dバンドの位置は1347cm ^{− 1} です。 とGバンド1578cm ^{− 1} ; ID / IG比は1.34です。 FT-IR分析により、〜3500 cm ^{− 1} で観察された幅広いピークが明らかになりました。 、それは主に水とヒドロキシル基に割り当てられています。 1600 cm ^{− 1} 付近のピーク グラファイト状炭素に存在するC =C結合に割り当てられます。 FT-IRスペクトルで観察された他のピークは、GOがC =O結合を含むグループ（主にカルボキシル基）に富んでおり、1720 cm ^{− 1} 付近にピークがあることを示しています。 および915cm ^{− 1} 、エポキシ（C–O–C）、1200 cm ^{− 1} 付近にピークが見える 、およびC–H結合（ピークは約2800 cm ^{− 1} 。

酸化グラフェンの構造的特徴分析。 a D、G、D ’のデコンボリューションが提案されている酸化グラフェンのラマンスペクトル。 b 官能基の割り当てによる酸化グラフェンのフーリエ変換赤外分光法（ATR、減衰全反射）スペクトル

AgNP-、GO-、およびAg-GOでコーティングされた箔の減少 Salmonella enteritidis 成長

GO、AgNP、およびAg-GOナノプラットフォームの抗菌活性を Sでテストしました。 enteritidis 。ナノマテリアルでコーティングされたホイル上で37°Cで24時間バクテリアを培養すると、増殖が低下しました（図3）。最強の S。 enteritidis Ag-GOナノプラットフォームで成長阻害が観察されました。ただし、AgNPとGOの両方のナノプラットフォームでも Sが減少しました。 enteritidis 成長。 Ａｇ－ＧＯナノプラットフォーム上でインキュベートされた細菌の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を対照群と比較すると、Ｓの数が減少していることが示された。 enteritidis 細胞。さらに、バクテリアはナノプラットフォームに付着し、形態学的変化を示し、細胞膜の破壊を示しています。

銀ナノ粒子と酸化グラフェンでコーティングされたナノプラットフォームは、 Sの生存率を低下させました。 enteritidis。 a の走査型電子顕微鏡画像 コントロール S。 enteritidis バクテリアと b S。 enteritidis 37°Cで24時間インキュベートした後、銀ナノ粒子および酸化グラフェンでコーティングされたナノプラットフォーム上でインキュベートしました。 c Sの実行可能性。 enteritidis ナノプラットフォーム上で24時間インキュベートした後、PrestoBlueアッセイで評価しました。値は平均±標準偏差（ n ）として表されます =3、各実験は3回行います）。統計的有意性は、さまざまな上付き文字で示されます（一元配置分散分析、 P <0.05）。略語：C、対照群（ナノ粒子を含まないホイル）; AgNP、銀ナノ粒子でコーティングされたナノプラットフォーム。 GO、酸化グラフェンでコーティングされたナノプラットフォーム。 Ag-GO、酸化グラフェンと銀ナノ粒子の複合材料でコーティングされたナノプラットフォーム。 RU、相対単位

AgNPの毒性は、Ag-GO複合材でコーティングされたナノプラットフォームのGOによって阻害されます

ナノプラットフォームの毒性は、線維芽細胞とHUVECをナノプラットフォームとコーティングされていないホイル上で24時間直接インキュベートすることによって調査されました（図4）。異なるナノプラットフォーム（ P ）での線維芽細胞とHUVECの両方の生存率には有意差がありました。 =0.0003および P =0.0156、したがって）。 GOナノプラットフォームは、コーティングされていないホイル上で培養された細胞の生存率と比較して、線維芽細胞の生存率を変化させませんでした。同様に、HUVECの生存率に対するGOの有意な影響はありませんでした。ただし、AgNPでコーティングすると、線維芽細胞とHUVECの両方の生存率が40〜50％低下しました。線維芽細胞とHUVECの細胞生存率は、Ag-GOナノコンポジットでコーティングされたナノプラットフォーム上でインキュベートしても変化せず、AgNP毒性の阻害を示しています。コーティングされていないホイルの細胞形態は、2D培養条件で成長した線維芽細胞の典型的な形態を示しました（図4a）。 AgNPでコーティングされたホイル上でインキュベートされた細胞は、細胞の集中的な凝集を示した。 GOおよびAg-GOでコーティングされたナノプラットフォームの細胞形態は、凝集傾向と細胞拡散の減少を示しました。

酸化グラフェンでコーティングされたナノプラットフォームは、銀ナノ粒子の細胞毒性を低下させました。 a で培養された線維芽細胞の形態 コーティングされていないナノプラットフォーム、 b 銀ナノ粒子でコーティングされたナノプラットフォーム、 c 酸化グラフェンでコーティングされたナノプラットフォーム、 d 銀ナノ粒子と酸化グラフェン複合材料でコーティングされたナノプラットフォーム。形態は、倍率×200の位相差を使用した光学顕微鏡によって評価されました。線維芽細胞（ e ）およびHUVEC（ f ）ナノプラットフォームでの24時間のインキュベーション後の生存率は、PrestoBlueアッセイを使用して決定されました。値は平均±標準偏差（ n ）として表されます =3、各実験は3回行います）。統計的有意性は、さまざまな上付き文字で示されます（一元配置分散分析、 P <0.05）。略語：HUVEC、ヒト臍帯静脈内皮細胞; C、対照群（ナノ粒子を含まないホイル）; AgNP、銀ナノ粒子でコーティングされたナノプラットフォーム。 GO、酸化グラフェンでコーティングされたナノプラットフォーム。 Ag-GO、酸化グラフェンと銀ナノ粒子の複合材料でコーティングされたナノプラットフォーム。 RU、相対単位

ナノプラットフォームの毒性は、ニワトリ胚の絨毛尿膜を使用して評価されました（図5）。ナノプラットフォームを絨毛尿膜上で直接インキュベートし、接触部位でのその形態を48時間後に調べた。 AgNPは絨毛尿膜に形態学的変化を引き起こしましたが、GOおよびAg-GOナノプラットフォームの場合、形態は対照群の形態と同等でした（図5b）。 AgNPナノプラットフォームでのインキュベーション後、漿尿膜は毛細血管の数の減少を示し、内皮細胞および間葉細胞への直接毒性を示唆しています。

酸化グラフェンは、銀ナノ粒子によって引き起こされる漿尿膜の形態学的変化を減少させました。ナノプラットフォームとの48時間のインキュベーション後のニワトリ胚絨毛尿膜の形態。 a 対照群（ナノ粒子を含まないホイル）、 b 銀ナノ粒子でコーティングされたナノプラットフォーム、 c 酸化グラフェンでコーティングされたナノプラットフォーム、 d 酸化グラフェンと銀ナノ粒子の複合材料でコーティングされたナノプラットフォーム

AgNPはインターロイキン6および8のリリースを減少させました

抗体アレイを使用して、線維芽細胞によって合成された40の炎症性タンパク質の細胞培地含有量を分析しました（図6）。線維芽細胞によって放出される主な炎症性タンパク質は、インターロイキン8（IL-8;図6、ドット：E5、F5）およびインターロイキン6（IL-6;図6、ドット：E8、F8）でした。 AgNPおよびAg-GOナノプラットフォームは、IL-8の放出レベルを大幅に低下させましたが、GOナノプラットフォームにはそのような効果はありませんでした。さらに、GOとAg-GOの両方のナノプラットフォームは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF;図6、ドット：G5、H5）の放出レベルを低下させました。 GOおよびAg-GOナノプラットフォームは、腫瘍壊死因子ベータ（TNF-β;図6、ドット：A9、B9）の放出レベルの増加にもつながりました。興味深いことに、AgNP、GO、およびAg-GOナノプラットフォームは、IL-6の放出レベルを大幅に低下させました。他の分析されたタンパク質の放出レベルは変化しなかった。分析されたすべてのサイトカインのリストを含むアレイマップは、追加ファイル1：図S1に含まれています。

24時間のインキュベーション後の線維芽細胞の炎症性サイトカイン放出の抗体アレイ分析。 a 対照群（ナノ粒子を含まないホイル）、 b 銀ナノ粒子でコーティングされたナノプラットフォーム、 c 酸化グラフェンでコーティングされたナノプラットフォーム、 d 酸化グラフェンと銀ナノ粒子の複合材料でコーティングされたAg-GOナノプラットフォーム。 AgNPおよびAg-GOナノプラットフォームは、IL-8の放出レベルを低下させました（ドット：E5、F5）。 GOとAg-GOの両方のナノプラットフォームは、GM-CSFの合成を減少させました（ドット：G5、H5）。さらに、GOおよびAg-GOナノプラットフォームにより、TNF-βの合成が増加しました（ドット：A9、B9）。 AgNP、GO、およびAg-GOナノプラットフォームは、IL-6の放出レベルを低下させました（点：E8、F8）。完全な配列マップは、追加ファイル1

ディスカッション

生物医学的用途では、抗菌材料に使用されるナノ材料の安全性は、細菌を殺す効率と同じくらい重要です。この研究では、GOを使用したコーティング材料がナノ材料の毒性を効率的に低減できることを示しました。 AgNPとGO（Ag-GO）でコーティングされたポリウレタンフォイルは、抗菌特性を高めるだけでなく、ヒト細胞での毒性も減らしました。

ラマン分光法を使用して、酸化グラフェンの構造的特徴を分析しました。ラマンスペクトルのGバンドはsp ² に対応します 混成炭素ベースの材料[26]。 Dピークは、酸素官能基の結合による欠陥または格子の乱れに関連しています[27]。 Dバンドの強度は、sp ² のサイズに関連付けられています 面内ドメイン[26]。追加のバンドD ’は、炭素材料のグラファイト構造に存在する欠陥から生じます。 ID / IG比（DおよびGバンドの強度から計算）を使用して、炭素材料のグラファイト構造の乱れを特徴付けることができます。示されているように、GOは、グラファイト粉末の酸化中に形成される構造内の多くの官能基のために、非常に無秩序な構造を持っています[28]。

ATRモードで収集された酸化グラフェンのFT-IRスペクトルは、GOが構造内に多くの官能基を持っていることを明らかにしました。これには、カルボキシル基やエポキシ基が含まれ、ピークは1720 cm ^{− 1} 付近です。 および915cm ^{− 1} 、エポキシ（C–O–C）、1200 cm ^{− 1} 付近にピークが見える 、およびC–H結合（ピークは約2800 cm ^{− 1} ）。 FT-IR分析は、ヒドロキシル、カルボキシル、エポキシ、およびカルボニル基も同定されたGOに対して実行されたXPS測定とよく一致しています[29]。

ナノ材料のコーティングは超音波技術で行われ、AgNPを含む抗菌性および殺菌性物質でさまざまな材料をコーティングする効果的な方法であることが確認されています[30、31]。超音波は、キャビテーション気泡を生成して崩壊させ、高エネルギーと圧力を生成することによってキャビテーション現象を利用します[32]。高速に加速されたナノ材料は、コーティングされた材料と衝突し、表面に堆積します[33]。しかし、適切なコーティング方法を使用するだけでなく、表面により容易に付着できるナノ材料との複合材料を作成することによっても、ナノ材料の堆積の有効性を高めることができます。 GOは、異なるナノ材料と表面の両方を備えた安定した複合材料を作成するための好ましいナノ材料です。炭素原子が六角形のパターンであり、カルボキシル基やヒドロキシル基などの多数の酸素含有官能基が近接しているという独特の構造により、GOは共有結合または静電相互作用を形成する傾向があります[34]。通常、GO-ナノ粒子複合材料は、静電相互作用または共有相互作用を介してGO表面に金属イオンまたは金属ナノ粒子を付着させることによって合成されます。さらに、金属イオンおよび/またはGOの還元は、共有結合を形成するために実行されます[35]。 Ag-GO複合材料は、Ag ⁺ のその場還元による超音波処理を使用して作成されています。 [36、37]、AgNPの沈着による[12]。以前のレポートでは、超音波法を使用して、ポリウレタンフォイル上にAg-GOでコーティングされたナノプラットフォームを合成できることを示しました[25]。しかし、超音波処理は、ポリウレタン箔をナノ材料でコーティングするだけでなく、Ag-GO複合材の形成にもつながりました。フォイルをコーティングする前であっても、Ag-GO複合材を形成すると、コーティング後のAgNPの安定性が向上する可能性があります。

私たちの研究では、線維芽細胞とHUVECを細胞毒性研究に使用し、続いてニワトリ胚の絨毛尿膜を分析しました。皮膚線維芽細胞は、in vivo分析と比較して皮膚刺激性研究の優れたモデルと見なされています[38]が、HUVEC細胞毒性を含む内皮細胞は、生物医学的応用におけるナノ粒子の直接接触の可能性とこれらの細胞のナノ粒子に対する感受性のためにしばしば研究されます[38]。 39、40]。ニワトリ胚絨毛尿膜は、物質毒性学および急性毒性学研究を含むさまざまな毒物学研究のためのげっ歯類モデルの代替の生体内モデルです[41、42]。

線維芽細胞とHUVECは、AgNPでコーティングされたナノプラットフォームよりもAg-GOで増殖させた場合の生存率が高かった。さらに、AgNPナノプラットフォームは絨毛尿膜に形態学的変化を引き起こしましたが、GOおよびAg-GOナノプラットフォームの場合、細胞形態は対照群と同等でした。 Ag-GOナノプラットフォームでの毒性の減少は、GOとの複合体におけるAgNPのより高い安定性と、ナノプラットフォームにおけるAgNPのより良い沈着の複合効果に起因する可能性があります。動物細胞の毒性は、ナノ粒子が直接浸透またはエンドサイトーシスによって細胞に入った後、より深刻になることがよくあります[43]。ナノ粒子のエンドサイトーシスは、サイズと形状に依存します。大きな粒子と複合材料は、サイズが約45nmの粒子よりも吸収されません[44]。エンドサイトーシスとナノ材料の形状またはサイズとの最も顕著な関係は、カーボンウォールナノチューブに特徴的です。長さが1μm未満のナノチューブは、直接拡散によって原形質膜に効果的に浸透しますが、食作用またはエンドサイトーシス経路は、より長いナノチューブと凝集体を内在化します[45]。最近、Ag-GOナノコンポジットは、AgNPよりも約60％少ないJ774マクロファージによって内在化されることが示されました。しかし、Ag-GOはより多くのROSを誘発したため、細胞の全体的な毒性はより高かった[46]。さらに、ナノ粒子の形状に依存する内在化の速度論的分析は、球状サイズのナノ粒子が一般に平坦な粒子よりもはるかに速く内在化されることを示しています[47]。さらに、ヒト細胞に対するナノ粒子の毒性は通常サイズに依存し、小さな粒子はより強い細胞毒性を示します。 RAWに対するAgNPのサイズ依存性細胞毒性に関する研究では、264.7マクロファージおよびL929線維芽細胞ナノ粒子は、より大きなナノ粒子（80、113 nm）で処理した後よりも20 nmAgNPで処理した後の生存率が低かった[13]。したがって、Ag-GO複合材料のサイズの増加と、表面への安定した沈着に起因するナノ粒子を取り込む細胞の能力の低下が、Ag-GOナノプラットフォームで培養されたHUVECと線維芽細胞の両方で観察されたより高い生存率の理由である可能性があります。

AgNPおよびAg-GOナノプラットフォームは、線維芽細胞によるIL-8の放出レベルを大幅に低下させました。 GOおよびAg-GOナノプラットフォームは、TNF-βの放出を増加させました。さらに、AgNP、GO、およびAg-GOナノプラットフォームはIL-6の放出を減少させました。興味深いことに、線維芽細胞による炎症性タンパク質の合成の変化は、AgNPまたはGOでコーティングされたナノプラットフォーム上での細胞のインキュベーションに関連していました。 Ag-GOで培養された細胞の合成レベルは、これらのナノ材料の1つだけでコーティングされたナノプラットフォームで培養されたものと異ならなかった。これは、複合材料の合成後に生物活性が変化しなかったことを示唆している。線維芽細胞は、炎症反応を開始し、急性炎症から組織修復への切り替えを促進することにより、炎症およびリモデリングプロセスにおいて重要です[48、49]。したがって、炎症性サイトカインの線維芽細胞分泌物の分析は、ナノプラットフォームに対する免疫応答を予測するために重要です。 IL-6とIL-8はどちらも、線維芽細胞による合成後、免疫応答の活性化につながる重要な炎症性サイトカインの1つです[50、51]。 IL-6のヒト表皮ケラチノサイト合成レベルは、AgNPによる治療後に減少します[52]。同様に、AgNPによるIL-6放出の阻害は、Jurcat細胞で実証され、MAPK経路が関与しています。 AgNPはまた、腫瘍壊死因子α（TNF-α）の合成レベルを低下させます[53]。 TNF-αと、構造と機能が非常に似ているTNF-βは、急性炎症期に重要な炎症性サイトカインです。免疫細胞は主に炎症の急性期におけるこれらのタンパク質の放出に関与していますが、線維芽細胞およびさまざまな細胞が、創傷治癒の初期過程における炎症性サイトカインの合成に関与しています[54]。 GOによる治療後にTNF-αを誘導する活性は、RAW264.7マクロファージを使用して実証されました[55]。これは免疫学的刺激を示唆しています。しかし、私たちの研究では、細胞がGOおよびAg-GOナノプラットフォームで培養された後、分析された炎症性タンパク質のほとんどの放出レベルは変化しませんでした。したがって、これらの分析は、GOとAg-GOの両方のナノプラットフォームが優れた生体適合性を備えており、強力な免疫反応を引き起こしてはならないことを示唆しています。

結論

結論として、提示された結果は、Ag-GO複合材料でコーティングされたナノプラットフォームが Sのより強い成長阻害を示したことを示しています。 enteritidis AgNPおよびGOでコーティングされたナノプラットフォームよりも。さらに、Ag-GO複合材料は、AgNPでコーティングされたナノプラットフォームと比較して、線維芽細胞、HUVEC、およびニワトリ胚絨毛尿膜に対する細胞毒性を大幅に低減しました。線維芽細胞とHUVECの細胞生存率は、Ag-GOナノコンポジットでコーティングされたナノプラットフォーム上でインキュベートしても変化せず、AgNP毒性の阻害を示しています。これらの結果は、低い免疫学的刺激とともに、GOがナノコンポジット中の異なるナノ材料の細胞毒性の低減に使用できることを示唆しています。さらに、結果は、Ag-GOナノプラットフォームが生物医学アプリケーションでの使用を検討できることを示唆しています。ただし、創傷被覆材を含む特定の用途向けにAg-GOナノプラットフォームを評価するには、追加の研究が必要です。

材料と方法

ナノ材料でコーティングされたナノプラットフォームの準備と特性評価

ナノ粒子でコーティングされたポリウレタンフォイルから作られたナノプラットフォームは、以前に説明されたように準備されました[25]。正方形のポリウレタンフォイル（15×15 mm、厚さ0.05 mm）は、Amepoxおよび/またはGOによって合成されたポリビニルアルコールの存在下での化学還元反応によって合成されたAgNP（HydroSilver1000、Amepox、Łódź、ポーランド）の懸濁液で覆われていました。 Hummersのメソッドを変更しました。 10グラムのグラファイト粉末を230mlの濃硫酸（98％）（Sigma-Aldrich Co.、St。Louis、MO、USA）と10°C未満の温度で混合しました。続いて、4.7 gの硝酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）と30 gの過マンガン酸カリウム（Sigma-Aldrich）を、温度を10°C未満に保ちながらグラファイト混合物に添加しました。次に、混合物を30℃に加熱し、2時間撹拌した。続いて、100mlの水を加え、混合物を10mlの過酸化水素で処理した。 GOをろ過により精製し、ろ液のpHが6.5に達するまで脱イオン水で洗浄しました。 GO、AgNPの懸濁液、およびAgNPとGOの複合体（Ag-GO）を脱イオン水中で調製しました。コーティング中のナノマテリアルの濃度は次のとおりでした。GO、200 mg / l; AgNP、100 mg / l; Ag-GO、200 mg / l;およびAgNP、100 mg / l。ナノ粒子コーティングは、30±1°Cの温度で超音波ホーン（Tiホーン、Ø13mm、60％効率、20 kHz; Sonics＆Materials、Inc。、米国コネチカット州ニュータウン）を使用して実行されました。覆われたサンプルを脱イオン水で洗い流し、滅菌条件で乾燥させた。走査型電子顕微鏡（SEM）、原子間力顕微鏡（AFM）、および横力顕微鏡（LFM）によるナノプラットフォームの特性評価は以前に報告されており、ナノプラットフォームがほぼ完全にナノ材料で覆われていることが示されています[25]。

ナノプラットフォームを得るために使用されたナノ材料は、透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して画像化されました。 TEM画像は、JEM-1220顕微鏡（JEOL、東京、日本）を使用し、Morada 11メガピクセルカメラ（Olympus Corporation、東京、日本）を使用して80kVで取得しました。サンプルは、ハイドロコロイドの液滴をformvarでコーティングされた銅グリッド（Agar Scientific、スタンステッド、英国）に配置し、観察前に風乾させて準備しました。

ラマンスペクトルは、532 nmのレーザー光源を備えたRenishawinVia分光計（Wotton-under-Edge、UK）を使用して収集されました。サンプルの加熱を避けるために、レーザー出力は低く保たれました（0.3 mW、サンプルで校正）。ラマンマッピングモードは、25のスペクトルを含む約10×10μmのスキャン領域で使用されました。各スペクトルは、Gバンド（〜1578 cm ^{− 1} ）の2つのメインバンドで構成されています。 ）およびDバンド（〜1347 cm ^{− 1} ）、ローレンツ線形状を使用してフィットしました。 FT-IR測定は、Nicolet iS10分光計（Thermo Fisher Scientific、米国ウォルサム）を使用して、ダイヤモンド結晶の減衰全反射モードで実行されました。酸化グラフェン懸濁液をポリエチレン表面上で室温で乾燥させて、GO薄いホイルを作成しました。スペクトルは、400〜4000 cm ^{− 1} の範囲で収集されました。 。

Zeta potential measurements of GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were carried out with a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern Instruments, Malvern, UK) at 25 °C, using the Smoluchowski approximation. Nanomaterials were sonicated for 30 min and zeta potential was immediately measured. Subsequently, nanomaterials were left for 24 h at room temperature and the zeta potential was measured again. Each measurement was repeated at least seven times after 60 s of stabilisation at 25 °C.

The hydrodynamic diameter of nanoparticles in water and their size distribution were measured with dynamic light scattering (DLS) using a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern). Similar to for the zeta potential analysis, GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were sonicated for 30 min and left for 24 h at room temperature. Each sample was measured at least seven times at 25 °C.

Bacterial Cultivation

Salmonella enteritidis subspecies enterica serovar Enteritidis (ATCC 13076) was obtained from LGC Standards (Łomianki, Poland). The bacteria were grown on tryptic soy agar (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). The bacteria, grown on agar plates, were harvested by gently washing the plates with sterile distilled saline solution. To calculate the number of bacteria in the cell suspension, the optical density of the suspensions at 600 nm (OD600) was measured using a spectrophotometer (Helios Epsilon, Unicam, Milwaukee, WI, USA). A calibration curve was prepared by performing serial tenfold dilutions of bacterial suspensions of a known optical density, up to 10 ^− 5 。 After 24 h of incubation at 37 °C, the number of formed colonies was enumerated and the number of colony-forming units (CFU) of the original bacterial suspension was calculated.

Bacteria Viability Assay

Viability was evaluated using a PrestoBlue Cell Viability Assay (Thermo Fisher Scientific). Bacteria were cultured onto foils coated with GO, AgNPs and Ag-GO, located on inserts inserted into six-well plates (200 μl MH broth with 5 × 10 ³  CFU per foil) and incubated for 24 h. Subsequently, 90 μl of each sample was transferred to 96-well plates and 10 μl of PrestoBlue reagent was added to each well and incubated for an additional 2 h at 37 °C. The optical density of each well was recorded at 570 nm using a microplate reader (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA). Bacteria viability was expressed as the relative value after substitution of the absorbance from the blank samples. Experiments were repeated three times.

Scanning Electron Microscopy Analysis

Bacteria were incubated on foils with Ag-GO and a sterile cover glass. Bacteria cultures (100 μl, 10 ⁶  CFU/ml) were incubated on foils and a cover glass for 24 h at 37 °C. All samples were dried and covered with gold. Cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) and contrasted with 1% osmium tetroxide (Sigma-Aldrich) and 1% carbohydrazide (Sigma-Aldrich). Subsequently, cells were dehydrated in increasing concentrations of hexylene glycol (Sigma-Aldrich). Drying was performed using a Polaron CPD 7501 critical point dryer (Quorum Technologies, Laughton, UK). Finally, the samples were imaged with a SEM (FEI Quanta 200, Tokyo, Japan) at an acceleration voltage of 15 kV.

Human Cell Lines

Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs; catalogue number:C0035C) and human fibroblasts (catalogue number:C0135C) were obtained from Thermo Fisher Scientific. HUVECs were maintained on low-serum Medium 200 basal media supplemented with Large Vessel Endothelial Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific), whereas fibroblasts were cultured in low-serum Medium 106 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with Low Serum Growth Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1× penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific). Cells were maintained at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂ /95% air.

To analyse biological interactions, the nanoplatforms were put into six-well plates. After detachment from the cell culture flask, HUVECs or fibroblasts were placed directly on the nanoplatform with 100 μl of growth media. To avoid the media drying during incubations, plates were kept in humidity chambers.

Analysis of Nanoplatform Toxicity to HUVECs and Fibroblasts

To analyse HUVEC and fibroblast viability on the nanoplatforms, cells were cultured in the droplet directly on the nanoplatforms or uncoated foil (1 × 10 ⁴ cells in 100 μl growth media). After 24 h of incubation, cell viability was analysed using a PrestoBlue assay (Thermo Fisher Scientific). PrestoBlue reagent was incubated with assessed cells for 2 h in a cell culture incubator. Subsequently, 50 μl of growth media with PrestoBlue reagent was transferred to a 96-well plate where fluorescence (excitation λ  = 560 nm, emission λ  = 590 nm) was analysed using a Tecan Infinite 200 microplate reader (Tecan, Durham, USA). Cell viability was expressed as the relative value after substitution of the fluorescence from blank samples. Experiments were repeated three times.

Fibroblast morphology was observed using an inverted optical microscope (Olympus Corporation) using phase contrast. Fibroblasts were seeded in 35-mm diameter Petri dishes directly on the nanoplatforms (1 × 10 ⁴ cells in 100 μl growth media). Images were taken after 24 h of incubation.

Chorioallantoic Membrane Assay

Fertilised eggs from Ross 308 hens were obtained from a certified hatchery and kept for 4 days at 12 °C. The eggs were cleaned, sterilised with UVC light and divided into four groups (4 × 20 eggs). Embryos were incubated at standard conditions (temperature 37 °C, humidity 60% and turned once per hour). At 8 days of embryonic development, small holes (1 cm ² ) were made in the shell above the air space, the inner membrane was gently striped off and the nanoplatforms were placed on the chicken embryo chorioallantoic membrane. Subsequently, chicken embryos were incubated for the next 48 h, when nanoplatforms were cut out with the chorioallantoic membrane that was directly below the nanoplatform. The chorioallantoic membrane on the nanoplatforms was imaged using a stereoscopic microscope (SZX10, Olympus Corporation).

Antibody Array Analysis

An analysis of inflammation cytokines in fibroblast growth medium was performed using an antibody array (Abcam, Cambridge, UK; catalogue number ab134003). Fibroblast cells (1 × 10 ⁴ ) were incubated on nanoplatforms coated with AgNPs, GO, Ag-GO and uncoated foil with 100 μl of media. After 24 h, 80 μl of growth medium was collected. For each experimental group, the growth medium from six foils was used for analysis. Pooled growth medium from the six experiments was centrifuged (1600 rpm for 5 min), and 500 μl of growth media was diluted in 500 μl of PBS. Therefore, 1 ml of diluted growth media was used per each analysed membrane. The assay was performed in accordance with the manufacturer’s instructions. Diluted growth media was incubated with the membranes for 24 h at 4 °C. Subsequently, antibodies conjugated with biotins were added and incubated for the next 24 h at 4 °C. In the next step, the membranes were incubated with streptavidin conjugated with horseradish peroxidase for 2 h at room temperature. Membranes were visualised after the addition of the provided horseradish peroxidase substrate using a ChemiDoc imaging system (Bio-Rad, Hercules, USA).

Statistical Analysis

Data were analysed using one-way analysis of variance with GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Differences between groups were tested with Tukey’s HSD post hoc tests. Results are shown as means with standard deviations. Differences at P  < 0.05 were considered significant.

データと資料の可用性

The datasets used and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

略語

Ag-GO:

Composite of silver nanoparticles and graphene oxide

AgNPs:

銀ナノ粒子

CFU：

Colony-forming units

DLS：

動的光散乱

FT-IR：

フーリエ変換赤外分光法

GM-CSF:

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

GO：

酸化グラフェン

HUVEC：

ヒト臍帯静脈内皮細胞

IL-6:

Interleukin 6

IL-8:

Interleukin 8

SEM：

走査型電子顕微鏡

TEM：

透過型電子顕微鏡

TNF-α:

Tumour necrosis factor alpha

TNF-β:

Tumour necrosis factor beta