Phellodendri Chinensis CortexCarbonisataに由来するカーボンドットのDeinagkistrodonacutus毒誘発性急性腎障害に対する保護効果

要約

背景

新たなナノ材料として、カーボンドット（CD）は生物医学的応用のために多大な注目を集めてきました。ただし、ヘビ毒によって誘発される急性腎障害（AKI）を阻害する生物活性に関する情報はほとんどありません。

メソッド

この研究では、Phellodendri Chinensis Cortex（PCC）を唯一の前駆体として使用してCDを合成するためのグリーンなワンステップ熱分解プロセスの開発と、 Deinagkistrodon acutus（D。acutus）> 毒によって誘発されたAKIは初めて調査されました。 AKIモデルは、 Dを注入することによって確立されました。 acutus マウスの腹腔への毒液と、6つの時点（1、3、および12時間、および1、2、および5日）が調査されました。

結果

これらの結果は、PCCC-CDが腎機能障害（血清クレアチニン（SCR）、血中尿素窒素（BUN）、尿中総タンパク質（UTP）、微量アルブミン尿（MALB）濃度の低下）および化学誘引物質（単球走化性タンパク質）の産生を有意に阻害することを示しました。 1（MCP-1））、炎症性サイトカイン（インターロイキン（IL）-1β）、および Dの腹腔内注射に応答した抗炎症性サイトカイン（IL-10）。 acutus 毒。有毒マウスに対するPCCC-CDの有益な効果は、腎組織学および血小板減少症の変化に対する効果と同様でした。

結論

これらの結果は、 Dによって誘発されたAKIに対するPCCC-CDの顕著な保護効果を示した。 acutus 毒は、CDの生物医学的応用を広げるだけでなく、 Dによって誘発されるAKIの新しい治療薬の開発のための潜在的な標的を提供します。 acutus 蛇咬傷の毒。

はじめに

Deinagkistrodon acutus（D。acutus） クサリヘビ科に属する、は中国で最も危険な陸生ヘビの1つと見なされています[1]。 Dによる毒殺。 acutus 出血、血小板減少症、腎臓への直接的な損傷の可能性などの一連の症状に関連しています[2、3]。急性腎障害（AKI）は、最も深刻な全身的影響であり、 Dによる毒物注入の一般的な合併症です。 acutus これは、持続的な腎機能障害と高い罹患率に直接つながります[4、5]。現在の局所治療は、解毒剤としての馬由来の過免疫抗毒素の使用を含む。しかし、その有効性は、特にAKIの発生において、局所組織の損傷を中和するのに制限されており、アナフィラキシー反応や発熱反応などのいくつかの不十分な効果があります[6]。さらに、抗毒素の比較的高いコストと貧弱な安定性もまた、 Dによって噛まれた人々の不十分な治療の一因となる。 acutus 、特に野生または農村地域で[7,8,9]。したがって、 Dの治療のための効果的で、安全で、手頃な価格の補完的な薬が緊急に必要とされています。 acutus 毒によって誘発されたAKI。

サイズが10nm未満の新しいクラスのカーボンナノ材料であるカーボンドット（CD）は、2004年に単層カーボンナノチューブの分離と精製によって偶然に発見され[10]、その注目に値するため、過去10年間で多くの関心を集めてきました。かなりの生体適合性、低毒性、高水溶性、豊富な原材料などの新しい特性[11、12、13]。 CDの出現は、主にバイオイメージング[14]、生物医学[15]、ドラッグデリバリー[16]、光触媒[17]などのさまざまな「スマート」ナノシステムの開発に関する研究に貢献しています。

注目すべきことに、固有の生物活性の可能性を備えたCDの開発は、前述の顕著な利点のために、いくつかの疾患の効果的な制御または治療のための新世代の薬剤を発見するための多くの戦略を提供します。細菌性角膜炎を治療するための抗菌剤[18]、止血剤[19]、ペルオキシダーゼ様[20]、抗癌剤、抗ウイルス剤、および抗炎症剤[21]などのいくつかの生物活性が報告されています。これらの効果は、CDの追加の製薬および生物医学的応用を研究するために科学者の注目を集めています。特に、 DでのSchizonepetaeSpica Carbonisata [22]に由来するCDの緩和作用。 acutus 毒液誘発性出血は、 Dによって誘発されたAKIに対するCDの有益な効果の調査に関する新しい展望を提供しました。 acutus 今まであまり理解されていなかった蛇咬傷。

Phellodendri Chinensis Cortex（PCC）Carbonisata（PCCC）-CDは、PCC（伝統的な漢方薬の一種であり、1000年以上使用されている）を1段階の熱分解処理で直接熱分解することによって合成されます。 PCCC-CDは、直径が1.2〜4.8nmの低毒性CDです。 PCCC-CDは、顕著な止血効果を有することが報告されており、CDの生物医学的応用を拡大するだけでなく、PCCCの止血材料の基礎の解明を開拓しました[23]。注目すべきことに、木炭加工によって調製された伝統的な漢方薬であるPCCCは、最初に普遍的な救済のためのタイピンの聖なる処方箋に記録されました。（978–992 AD、中国）。止血や抗炎症などのPCCCの安全性プロファイルと満足のいく治療効果により、1000年以上にわたって臨床応用が継続され、中華人民共和国の薬局方で認められました。（PPRC、2015年）。ただし、PCCC-CDの追加の基礎となる生物活性の研究は課題となっています。特に、 Dによって誘発されるAKIの阻害に関する情報はほとんどありません。 acutus 毒。

さらに、蛇咬傷による毒物注入は、腎毒性成分を介して直接、または免疫および炎症性メディエーターの活性化または調節によって、腎生理学を危険にさらす可能性があることが報告されています[24]。これらの影響は主に生物医学的パラメーター[25]（血清クレアチニン（SCR）、血中尿素窒素（BUN）、尿中総タンパク質（UTP）、微量アルブミン尿（MALB）濃度）、炎症性サイトカイン（インターロイキン（IL）-1β）、抗炎症性サイトカイン（IL-10）、および単球走化性タンパク質1（MCP-1）、腎組織学の変化、および血小板（PLT）数。本研究では、グリーンワンステップ熱分解法を使用してPCCC-CDを合成し、 Dをマウスに腹腔内注射することによって誘発されるAKIのこれらの異常の発症に対する保護効果を初めて調査しました。 acutus 毒。

材料と方法

化学薬品

PCC材料は、Beijing Qiancao Herbal Pieces Co.、Ltd。（北京、中国）から購入し、PCCCは当研究室で作成しました。分子量1000Daの透析膜は、Beijing Ruida Henghui Technology Development Co.、Ltd。（北京、中国）から購入しました。細胞計数キット（CCK）-8はDojindo Molecular Technologies、Inc。（熊本、日本）から購入しました。 Dの凍結乾燥したヘビ毒。 acutus 実験用にAnRen Snake Farm（Yujiang County、Yingtan、Jiangxi、China）から提供されました。他の分析グレードの化学試薬は、Sinopharm Chemical Reagents Beijing（北京、中国）から入手しました。マウスMCP-1、IL-10、およびIL-1β酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キットは、Cloud-CloneCropから購入しました。（武漢、中国）。すべての実験は、脱イオン水（DW）を使用して実行されました。

動物

動物の管理と研究のプロトコルは、北京中医薬大学の動物実験倫理委員会によってサポートされ、承認されました。雄の昆明マウス（体重30.0±2.0 g）は、実験動物の適合証明書とともに北京バイタルリバー実験動物技術株式会社から購入し、12時間の光で一定の温度と湿度のケージに保管しました。 自由にするダークサイクル食料と水へのアクセス。

毒液の調製

凍結乾燥した毒液を通常の生理食塩水に20分間穏やかに混合して溶解し（最終濃度：5 mg / mL）、必要になるまで-20°Cで保存しました。

PCCC-CDの準備

PCCCは、以前の方法[23]に従って、PCCを唯一の前駆体として使用するワンステップ熱分解法を使用して調製しました。簡単に説明すると、PCCサンプルを別々の磁器製るつぼに入れ、予熱した炉内で350°Cで1時間加熱しました。 30℃に冷却した後、得られた均質な黒色残留物を微粉末に粉砕し、100℃で1時間に2回水中で2回煮沸した。次に、0.22μmの酢酸セルロース膜で懸濁液を事前にろ過することにより、溶液を収集しました。非炭素質不純物は、DWに対して72時間透析することにより除去されました（保持分子量：1000 Da）。 PCCC-CDs溶液を濃縮し、使用するまで4℃で保存しました。図1のフロー図は、上記のプロセスを示しています。

熱分解処理によるPhellodendriChinensis Cortex（PCC）からのカーボンドット（CD）の形成プロセスの図解

PCCC-CDの特性評価

CDの形態は、200 kVの電子エネルギーを持つ透過型電子顕微鏡（TEM、JEM-2100電子、JEOL、日本）を使用して研究されました。構造の詳細は、Tecnai G2 20電子顕微鏡（FEI、米国）を使用した高分解能TEM（HRTEM）を使用して調べました。紫外可視（UV-Vis）スペクトルと蛍光特性は、それぞれUV-Vis（CECIL、ケンブリッジ、英国）および蛍光（F-4500、東京、日本）分光法を使用して記録および測定されました。フーリエ変換赤外（FTIR）分光法を使用して、400〜4000 cm ^{− 1} のスペクトルウィンドウで表面官能基情報を分析しました。。

細胞毒性アッセイ

ヒトL02肝細胞およびヒト胎児腎臓293T細胞株を使用して、CCK-8アッセイを使用してPCCC-CDの潜在的な細胞毒性を評価しました。 L02細胞は10％ウシ胎児血清（FBS）を含むRoswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）培地で培養し、293 T細胞は10％FBSを含む高グルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養しました。両方の細胞株を加湿した5％CO ₂中で37℃でインキュベートしました。。

L02および293T細胞を2.0×10 ⁴ の密度で播種しました 96ウェルプレートで細胞/ウェルを培養し、5％CO ₂の加湿雰囲気下で37℃で培養 24時間。次に、両方の細胞タイプを100μLの異なる濃度（5000、2500、1250、625、156、78、39、および19.5μg/ mL）の無血清培地中のPCCC-CD溶液で処理し、さらに24時間インキュベートしました。 h。続いて、PCCC-CDを含む培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した。細胞毒性は、10μLのCCK-8試薬を加えた直後に450 nmでプレートを読み取り、37°Cで4時間インキュベートすることによって決定されました。

D。 acutus 毒によるAKIと治療

D。 acutus 毒によって誘発されたAKIモデル

ＡＫＩマウスモデルは、マウスにＤを腹腔内注射することによって確立された。 acutus ヘビ毒。マウスは、それぞれ36匹の動物からなる次の5つのグループにランダムに分けられました。モデル;および高用量、中用量、および低用量のPCCC-CD治療群。モデルグループは Dを受け取りました。 acutus 体重1mg / kg（0.15 mg / mL、0.2 mL）の毒液と0.5 mLの通常の生理食塩水を腹腔内投与し、高用量、中用量、低用量のPCCC-CD治療群は同量のヘビ毒とPCCCを投与しました。 -それぞれ8.0、4.0、および2.0 mg / kgの用量のCD抽出物。通常の生理食塩水（NS）のみを腹腔内注射したマウスを対照とした。 NS、 Dの投与の1、3、および12時間後に、各グループからの6匹のマウスを犠牲にした。 acutus 毒液、および上記のスケジュールのPCCC-CDは、1、2、および5日目にマウスを犠牲にして、NS、 Dを継続的に投与しました。 acutus ヘビ毒、およびPCCC-CDを1日2回。

UTPおよびMALB濃度の分析

それぞれの治療の投与後、対照、モデル、およびPCCC-CD-（4.0 mg / kg）治療群の動物は、潜伏期間が終了するまで（24時間）、尿収集のために直ちに適切な代謝ケージに入れられた。 UTPとMALBの濃度は、自動生化学分析装置を使用して分析されました。

腎機能のバイオマーカーの分析

腎機能は、SCRとBUNのレベルを測定することによって評価されました。マウスを安楽死させる前に、血液サンプルを眼窩後神経叢から採取し、4°Cで少なくとも4時間プラスチックチューブに入れました。血清は750× g での遠心分離により得られた。 15分間、自動生化学分析装置を使用してBUNおよびSCRレベルを分析しました。

炎症性サイトカインレベルの検出

マウスの右腎臓を取り出し、ドライアイスで急速に凍結し、次の手順で使用するまで-80°Cで保存しました。異なるグループの組織サンプル（100 mg）を氷上でPBSでホモジナイズし、750× g で遠心分離しました。 15分間。上清を収集し、製造元の指示に従ってそれぞれのELISAキットを使用してMCP-1、IL-10、およびIL-1βのレベルを決定しました。

腎臓の組織学

マウスの左腎組織サンプルを10％中性緩衝ホルマリンで4°Cで48時間以上固定し、脱水し、パラフィンに包埋し、切片に切り、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色しました。形態学的変化は、対照群、モデル群、およびPCCC-CD治療群の間で比較されました。

血小板減少症の活動

PLTは、眼窩後神経叢からマウスから採取した血液に対して実施し、自動血液分析装置（XS-800i、シスメックス株式会社、神戸、日本）を使用して検出しました。

統計分析

統計分析は、社会科学統計パッケージ（SPSS、バージョン13.0）を使用して実行されました。正規分布のデータと均一な分散は、平均値±標準偏差（SD）として表されます。一元配置分散分析（ANOVA）とそれに続く最小有意差（LSD）検定を、多重比較に使用しました。 P <0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

PCCC-CDの特性評価

TEMを使用して、PCCC-CDの形態とサイズ分布を直接観察しました（図2a、c、およびd）。調製されたCDは球形でサイズが均一で、ほとんどが2.84±0.89 nmで、明確な凝集はありませんでした。 HRTEM画像は、CDの格子縞（0.24 nm）を示しました。これは、図2bに示すようにグラファイト状炭素に対応します。

図3aに示すように、CDは、370nmの励起に続いて445nmに最大ピークを持つ明確な青色の蛍光を示しました。したがって、UV-Visスペクトルに表示されるPCCC-CDの光学情報は、CD表面の共役有機分子のπ-π*遷移に対応する265 nmに強い吸収ピークを示しました（図3b）。

さらに、図3cに示すように、FTIRスペクトルに基づいて、配合されたCDの官能基を詳細に特定しました。 3433 cm ^{− 1} のピークはO–HおよびN–H伸縮振動の吸収帯に割り当てられ、C–H伸縮振動は2923 cm ^{− 1} に現れました。および2853cm ^{− 1} 。さらに、1624 cm ^{− 1} の吸収ピーク C =Oの存在を示した。 C–O–C結合は1109 cm ^{− 1} で観察されました、および1400 cm ^{− 1} のピーク C–Nストレッチに起因していました。これらの調査結果は、以前のレポートの調査結果と一致していました。

インビトロ細胞毒性

細胞毒性を評価するために、L02および293 T細胞をさまざまな濃度のPCCC-CDに24時間曝露し、CCK-8アッセイを使用して生存率を調べました。図4aに示すように、PCCC-CDで処理したL02細胞の生存率は、5 mg / mLの高濃度でも、対照細胞の生存率と比較して> 85％でした。同様に、PCCC-CDは、最大約2500μg/ mLの濃度で293T細胞の増殖に影響を与えませんでした（図4b）。これらの結果は、PCCC-CDが低い細胞毒性を示したことを示しています。

UTPおよびMALB濃度に対するPCCC-CDの影響

対照群のUTPレベル（0.98±0.38 mg / L）と比較して、UTPレベルは Dで有意に増加しました。 acutus 毒処理（3.08±0.92 mg / L、 P <0.01）およびPCCC-CD（2.36±0.83 mg / L、 P <0.05）グループ（図5a）。さらに、UTPレベルは、毒液投与後のレベルと比較して、PCCC-CD治療後に減少しました（ P <0.05）。さらに、MALBのレベルは Dの腹腔内注射の24時間後に明らかに増加しました。 acutus 毒（17.78±5.96 mg / L、 P <0.01）対照群と比較（2.02±0.91 mg / L）。対照的に、PCCC-CDで治療したマウスは、MALBのレベルの低下傾向を示しました（14.25±4.16 mg / L、図5b）。

PCCC-CDは Dで腎臓機能障害を軽減しました。 acutus 毒によって誘発されたAKIマウス

腎機能は、BUNおよびSCRのレベルを測定することによって評価されました。 6および7。 Dで処置されたマウス。 acutus 毒液のBUNレベルは有意に高かった（12.07±1.00 mmol / L [1日]、 P <0.01; 11.43±1.37mmol / L [2日]、 P <0.01; 14.83±2.53mmol / L [5日]、 P <0.01）およびSCR（12.83±1.43μmol/ L [1日]、 P <0.01; 13.48±2.26μmol/ L [2日]; P <0.01。 13.80±1.90μmol/ L [5日]、 P <0.01）NS治療マウスよりも（BUN：8.95±1.04 [1日]、9.53±1.40 [2日]、および9.07±1.57 [5日] mmol / L; SCR：9.40±0.89 [1日] 、10.27±2.04 [2日]、および9.85±1.99 [5日]μmol/ L）1日目から5日目（図6aおよび7a）。注目すべきことに、モデルグループと比較して、低用量PCCC-CDによる治療は、SCRレベルの上昇を有意に抑制しました（9.77±0.79μmol/ mL、 P <0.01）およびBUN（10.50±1.38 mmol / L、 P <0.05）、高い（9.62±1.87μmol/ mL、 P <0.01）および培地（10.75±1.48μmol/ mL、 P <0.05）用量はSCRの増加を抑制しましたが（図7b）、 Dによって誘発されたBUN（図6b）は抑制しませんでした。 acutus 1日目の毒液。高用量、中用量、および低用量のPCCC-CD治療群のSCR（図7c）のレベルは減少しました（10.97±0.88、10.42±1.75、および10.68±1.41μmol/ mL、それぞれ; P <0.05）2日目のモデルグループよりも。さらに、モデルグループと比較して、BUNレベルは高-（9.57±0.52 mmol / L、 P ）で有意に減少しました。 <0.01）および低用量（10.72±2.04 mmol / L、 P <0.05）2日目はPCCC-CD群であるが、中用量群ではない（図6c）。 6dおよび7dでは、両方の指標のレベルで高い抑制効果が観察されました（12.28±1.65 mmol / L、 P <0.01（BUN）; 11.38±1.80μmol/ mL、 P <0.05（SCR）、それぞれ）および中（12.40±1.33 mmol / L、 P <0.05（BUN）; 10.83±2.57μmol/ mL、 P <0.05（SCR）、それぞれ）PCCC-CDの用量。さらに、SCRの対照群とPCCC-CD治療群の間に有意差は観察されませんでした。

PCCC-CDはサイトカイン分泌を阻害しました

Ｄの注射に応答した化学誘引物質（ＭＣＰ－１）および炎症誘発性（ＩＬ－１β）および抗炎症性（ＩＬ－１０）サイトカインの産生に対する３つの濃度のＰＣＣＣ－ＣＤの効果。 acutus 毒が調査された。図8は、毒液の注射により、マウスモデルで放出されたIL-1βが増加したことを示しています（1 h：58.19±5.35 ng / mL、 P <0.01; 3 h：56.57±3.54 ng / mL、 P <0.01; 12 h：49.48±7.74 ng / mL、 P <0.05; 1日目：41.09±4.82 ng / mL、 P <0.05; 2日目：47.96±8.33 ng / mL、 P <0.05; 5日目：45.11±6.95 ng / mL、 P <0.05）NS処理マウスのレベルと比較（1 h：35.96±4.72 ng / mL、3 h：34.94±2.58 ng / mL、12 h：36.42±5.25 ng / mL、1日目：34.47 / mL、2日目：39.84±3.71 ng / mL、5日目：36.82±8.27 ng / mL）。図8b–dに示すように、 Dとの比較。 acutus 毒液誘発群は、高濃度（50.09±7.68 ng / mL、 P ）への1時間、3時間、および12時間の曝露を示しました。 <0.05 [1時間]; 40.36±8.51ng / mL、 P <0.01 [3時間]; 39.87±4.64ng / mL、 P <0.05 [12 h]、それぞれ）および低-（46.64±3.83 ng / mL、 P <0.01 [1時間]; 37.65±9.61ng / mL、 P <0.01 [3 h]; 38.75±6.64ng / mL、 P <0.05 [12 h]、それぞれ）用量のPCCC-CDはIL-1βのレベルを有意に低下させます。さらに、中用量のPCCC-CDは、IL-1βのレベルを有意に低下させました（41.50±11.08 ng / mL、 P <0.01）3時間での毒液処理マウスと比較したが、他の時点では比較しなかった。

抗炎症性サイトカインIL-10のレベルは Dで劇的に増加した。 acutus さまざまな時点での毒液治療群（23.27±0.72 ng / mL、 P <0.01; 22.03±0.96ng / mL、 P <0.05; 21.76±1.99ng / mL、 P <0.05; 26.31±6.55ng / mL、 P <0.01; NS治療群と比較して、それぞれ3時間、12時間、1日目、2日目）（図9）。対照的に、高用量および中用量のPCCC-CD（それぞれ、17.17±4.04および17.25±5.64 ng / mL、両方とも P ）による治療 <0.05）は3時間で毒液誘発性のIL-10分泌を抑制し、低用量PCCC-CDは3時間、12時間、および1日目（17.17±5.24、17.83±4.11、および18.31±2.14 ng /）のレベルを抑制しました。それぞれmL、すべて P <0.05）。 PCCC-CD治療群とNS群の間に有意差は観察されませんでした。

さらに、図10は、 Dの注入を示しています。 acutus 毒液はモデルグループでMCP-1放出を有意に増加させました（1 h：197.45±22.34 ng / mL、 P <0.01; 3 h：182.42±12.94 ng / mL、 P <0.01; 12 h：169.20±26.74 ng / mL、 P <0.01; 24 h：142.81±25.85 ng / mL、 P <0.05）NS処理コントロール（1 h：115.82±14.80 ng / mL; 3 h：106.46±13.76 ng / mL; 12 h：120.35±60±15.75 ng / mL;および24hと比較） mL）。さらに注目すべきことに、3回のPCCC-CD用量での有毒マウスの治療は、MCP-1レベルの増加を抑制しました。培地-（3 h：136.84±39.94 ng / mL、 P <0.01; 12 h：127.48±13.75 ng / mL、 P <0.01）および低-（1 h：152.13±18.89 ng / mL、 P <0.05; 3 h：129.54±30.85 ng / mL、 P <0.01; 12 h：118.75±19.96 ng / mL、 P <0.01）用量のPCCC-CDは、1時間（178.20±22.79 ng / mL）で中用量を除いて、1、3、および12時間でMCP-1のレベルの増加を抑制しました。高用量PCCC-CDによる治療は、MCP-1のレベルで3時間でのみ効果的に減少しました（131.42±24.62 ng / mL、 P <0.01）。

対照的に、特定の時点でのPCCC-CD治療群のIL-1β、IL-10、およびMCP-1レベルは、モデル群のレベルと有意差はなく、減少傾向を示しました。

血小板減少症の抑制に対するPCCC-CDの効果

PLTはAKIの病因に特定の役割を果たします。そこで、血小板数を調査し、その結果を図11に示します[26]。対照群のPLT値と比較（1 h：[1228±51]×10 ⁹ ; 3 h：[1120±36]×10 ⁹ ; 12 h：[1245±111]×10 ⁹ ; 1日目：[1177±69]×10 ⁹ ; 2日目：[1195±51]×10 ⁹ ; 5日目：[1181±46]×10 ⁹ ）、 Dの1時間後に大幅な減少が発生しました。 acutus 毒の投与、3時間で最下点が発生します。その後、PLTは5日目まで着実に増加しました（1 h：[354±70]×10 ⁹ 、 P <0.01; 3 h：[315±77]×10 ⁹ 、 P <0.01; 12 h：[435±91]×10 ⁹ 、 P <0.01; 1日目：[663±226]×10 ⁹ 、 P <0.01; 2日目：[941±248]×10 ⁹ 、 P <0.05; 5日目：[1083±89]×10 ⁹ ）。注目すべきことに、この時間間隔でも、PLT値は対照マウスの値よりも有意に低かった。さらに、PCCC-CDを8 mg / kgの用量で投与すると、1時間で誘発された毒液誘発性血小板減少症が著しく抑制されました（[435±91]×10 ⁹ 、 P <0.05）、3 h（[599±290]×10 ⁹ 、 P <0.05）、12 h（[929±92]×10 ⁹ 、 P <0.01）、1日目（[1028±248]×10 ⁹ 、 P <0.01）、および2日目（[1183±89]×10 ⁹ 、 P <0.01）。この抑制効果は、PLTの増加に加えて、3時間および2日目に2 mg / kgのPCCC-CDおよび2日目に4mg / kgのPCCC-CDの用量でも観察されました。モデル群と中用量群の間に有意差はありませんでしたが、他の異なる時点で増加傾向が観察されました。

病理学的観察

毒液群の腎障害を組織学的に評価した。図１２ａに示されるように、正常な糸球体および尿細管細胞性を示したＮＳ処置群とは対照的に、Ｄの腎実質に顕著な変化が観察された。 acutus 毒治療群。これらの変化には、著しい出血、尿細管拡張、および変性が含まれます。 PCCC-CDとの併用治療は Dを予防しました。 acutus 毒液誘発性の腎障害、および腎組織の構造の組織病理学的検査は、軽度の止血、腎尿細管拡張、および変性を伴ってほぼ正常でした。

ディスカッション

新たなナノ材料として、CDは次世代ナノ医療の革新的な材料として重要なニッチを占め始めています。従来の重金属ベースの量子ドットと比較して、CDは、毒性が比較的低い新薬の開発にかなりの潜在的な利点がある独自の特性があるため、生物医学的用途に適しています[27、28]。

誘導されたPCCC-CD粒子は準球形であり、水によく分散しており、表面に豊富な官能基が存在していました。この観察結果は、以前に報告された発見[23]と一致しています。さらに、調製したままのCDは、L02および237 T細胞に対して低い毒性を示し、生物医学的用途に適していることを示しています。

現在の研究は、私たちの知る限りでは、 Dによって誘発されたAKIに対するPCCC-CDの顕著な生物活性を実証する最初のものです。 acutus スネークバイト。 D。 acutus Dに噛まれた人々や動物の民間伝承の説明から、中国の民間療法では「5ペーサー」または「100ペーサー」と広く呼ばれています。 acutus 100歩以上歩くことはできませんでした。 Dの人口の90％以上。 acutus は中国で発見されており、このヘビの咬傷に関連する重大な状態や死亡の頻度は、他の多くの毒ヘビよりも高くなっています[29]。 AKIは、最も深刻な全身性の影響と一般的な合併症であり、二次性腎虚血と不全につながります。 Dによって誘発されたAKIに関する関連情報の強化された知識。 acutus 毒物注入は、新しい治療アプローチの開発に貢献するでしょう。しかし、一般的なヘビ毒の腎毒性について入手可能なかなりの知識とは対照的に[30、31]、 Dによって誘発されたAKIに関する情報。 acutus 毒液はまれであるため、まだ開発の初期段階にあるこの潜在的な薬を調査することになりました。

この研究では、 Dを腹腔内注射することによってAKIモデルを確立しました。 acutus 毒液をマウスに注入して、毒液誘発性AKIの複雑で多因子的な病因を評価します。さらに、このモデルは、 Dによって誘発されたAKIに対するPCCC-CDの保護効果を調査するためのツールを提供しました。 acutus 毒。

現在の実験では、炎症性サイトカインと血清および尿の生化学的指標に明確な変化を伴う実質的なAKIの発症、およびヘビ毒の腹腔内注射後の腎障害の組織病理学的証拠が示されています[31]。これらの発見は、主に毒の毒性に寄与する可能性のある要因が[32]（1）腎臓に対する直接的な毒の細胞毒性および（2）腎臓の炎症反応であることを示した。

具体的には、タンパク尿および血清バイオマーカー（SCRおよびBUN）の上昇に関連する乏尿に基づいて、毒注射の約24時間後に腎不全が確認されました。我々はさらに、 Dにおける腎臓の関与を確認した。 acutus 生化学的分析を使用した毒液治療群は、対照群と比較して有意に上昇したUTPおよびMALBレベルを示しました。これらの発見は、組織病理学的変化の証拠によって裏付けられた、毒液治療群における糸球体機能不全および尿細管再吸収の存在を示した[33]。対照的に、UTPおよびMALBのレベルの有意な低下は、毒を与えられた中用量のPCCC-CD治療群で観察されました。さらに、血清生化学的指標（SCRおよびBUN）は、AKIの腎機能障害の上昇を決定するために使用される他の重要なパラメーターであり、診断における臨床指標のままです[34]。 1日目から5日目にヘビ毒を注射すると、SCRとBUNのレベルも劇的に増加しましたが、PCCC-CDによる治療はこれらの効果を逆転させ、対照群よりも回復が早くなりました。さらに重要なことに、腎臓組織の明確な変化、顕著な出血、尿細管拡張、および変性は、毒による腎臓の直接的な障害をさらに示した。この研究では、組織病理学的変化に対するPCCC-CDの減衰効果が実証されました。これらの結果は、PCCC-CDが、腎機能障害および腎組織学的損傷に関連する尿および血清生化学的マーカーのAKI誘発性異常発現を阻害したことを示唆しました。さらに、これらの影響は、 Dの直接腎毒性の改善に起因する可能性があります。 acutus PCCC-CDによる毒[35]。 PCCC-CDの保護効果は、 Dの阻害によって証明された。 acutus 毒による直接的な腎臓の損傷。

激しい炎症反応は、ヘビや毛虫などの毒動物による毒物によって誘発される一般的な特徴です[35、36、37]。単核細胞浸潤、好中球増加症、尿細管上皮細胞変性、および壊死を伴う全身性炎症の兆候は、ヘビ毒の注射によって誘発される腎臓障害でも示されています。 MCP-1は、炎症反応中に白血球を動員して活性化するのに重要な役割を果たす小分子タンパク質です[38]。さらに、単核貪食細胞およびリンパ球は、炎症性メディエーターの分泌などのさまざまなメカニズムによって急性腎細胞傷害に寄与する可能性があり、その後、常在腎細胞にケモカインを発現させる可能性があります[39]。Ｄを注射されたマウスにおけるＡＫＩの病因における炎症反応におけるＭＣＰ－１、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β）および抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－１０）の関与。 acutus 本研究では毒のみが実証された。この観察は、 Dの根底にあるメカニズムを示した。 acutus 毒液誘発性AKIは、腎炎症反応に関連している可能性があります。 PCCC-CDへの曝露がIL-1β、IL-10、およびMCP-1のレベルを有意に低下させたという証拠は、CDが腎炎症反応を阻害することによって腎保護を示す可能性があることを示唆しています。

さらに、PLTは急性止血および炎症過程において重要な役割を果たし、多様な炎症性病変と関連しています[40、41]。それらは非常に敏感であり、生物が損傷または出血したときに、内皮細胞および白血球と相互作用するために急性損傷の部位に到達する最初の細胞として、生物学的変化に迅速に応答します[42]。 PLTはAKIの病因に関与しており[43]、AKIのより悪い結果と有意に関連している予後マーカーと見なされています[44]。この研究は、 D。 acutus 毒液はPLT数を著しく減少させました。これは、血小板減少症がヘビ毒によって誘発される可能性があることを報告した研究の結果と一致していました[34、45]。 PCCC-CDへの曝露により、PLT数が大幅に増加することが観察されました。これは、以前の研究の結果と一致していました[23]。

Dによって誘発されたAKIの異常。 acutus 私たちの知る限り、毒液は現在の研究で初めて実証され、主にタンパク尿、乏尿、BUNおよびSCRレベルの上昇、病的な腎障害、炎症反応、血小板減少症に関連する腎機能障害が含まれていました。

注目すべきことに、PCCC-CDは Dに対して保護活性を示しました。 acutus この研究で初めて証明されたように、関連する障害を阻害することによる毒誘発性AKI。この研究は、 Dによって誘発されたAKIに対するPCCC-CDの有益な効果の予備評価でした。 acutus 毒、そして根底にあるメカニズムのさらなる調査は、将来の研究の焦点となるでしょう。

結論

Dに対するPCCC-CDの印象的な保護効果。 acutus 毒によって誘発されたAKIは、私たちの知る限り、この研究で初めて実証されました。 AKI関連の影響は、主に腎機能障害、病的腎障害、炎症反応、および血小板減少症として現れました。これらの結果は、PCCC-CDが Dによって誘発される異常の治療のための補完的な薬として使用するための潜在的な応用の見通しを持っていることを示した。 acutus 毒によって誘発されたAKI。さらに、これは伝統的な漢方薬製剤の有効成分を研究するための新しい戦略を提供し、CDの生物医学的応用をさらに広げます。