生体への鉄送達の潜在的形態としてのFeをドープした生分解性酸化亜鉛ナノ粒子に関する予備的研究

はじめに

鉄は、人口を含む地球上で生物を構築する最も重要な要素の1つです。この元素の重要性は、体内で起こる多くの構造やプロセスにおける鉄の本質的な役割に関連しています。全身の組織や細胞（ヘモグロビンとミオグロビンの一部）の周りの酸素の運搬、エネルギーの生成（ミトコンドリア呼吸鎖タンパク質の成分）はこれ以上ありません[1、2]。したがって、鉄は細胞や生物全体の重要な生命過程に関与しており、鉄の欠乏は生体の機能に重大な障害をもたらす可能性があります。

世界的な報告が示すように、鉄欠乏は人口の深刻な公衆衛生問題になります。 WHOによると、1993年から2005年にかけて、世界中の社会の30％近くが貧血の影響を受けました。貧血の有病率は、幼児や妊婦でさらに高くなっています[3]。妊娠中の鉄補給の重要性は、鉄欠乏が早産、新生児の低出生体重、および一般的な健康状態の悪化のリスク要因であるという事実に関連しています[4]。乳幼児や就学前の幼児の場合、鉄欠乏の危険因子は、全身の急速な成長とそれに続く鉄貯蔵の消費によって引き起こされます。したがって、鉄分補給は0歳から5歳までの子供にも推奨されます[5]。興味深いことに、子供たちの適切な鉄レベルと彼らの感情的および神経心理学的発達との相関関係を示す科学的報告があります[6]。さらに、鉄欠乏症は、他の哺乳動物種の中でも深刻な栄養障害であり、特に授乳中の子豚では、この元素の子宮内供給が制限され、雌豚乳の鉄含有量が低くなります[7、8]。また、子豚の急速な成長は、数日以内に新生子豚の体重を2倍にし、赤血球の数と一般的な血液量を増加させるため、鉄の貯蔵庫の残骸を急速に枯渇させます。したがって、今日では、人間と動物の両方の人口に対するより効果的で安全な鉄補給戦略が、栄養不足の予防と治療における最も重要な課題の1つになりました。

生体への余分な鉄の送達には、静脈内、筋肉内、および経口の3つの主要な方法があります。それらのそれぞれは、方法の長所と短所の両方を示しています。経口投与は、鉄の吸収と輸送システムの生理学的経路を含む、体にとってより単純でより自然なようです。また、この方法は、ヘプシジンに基づいて体内の循環鉄の量を制御する自然なシステムを維持します[9]。しかし、経口補給経路は、吸収不良と最終的な低効率に悩まされることがよくあります。科学的研究はまた、標準的な可溶性経口鉄補給戦略が動物の腸内微生物叢の組成と代謝活性に強く影響することを報告しました[10]。一方、生体への鉄の静脈内または筋肉内送達は、毒性の副作用のリスクによって妨げられます[11]。さらに、産業養豚では、鉄デキストランの単回投与に基づく鉄補給の標準的な方法は、動物にとってストレスが多く、育種家にとっては厄介です。また、不適切に行われた注射は、動物に炎症やその他の合併症を引き起こす可能性があるだけでなく、不妊状態が観察されない場合、群れにさまざまな病気を広める一因となる可能性があります。

生体への外因性鉄送達の上記の有毒な副作用は、体内の遊離および非結合鉄元素の発生に関連しており、遷移金属として（原子価の変化を通じて）有害なフリーラジカル（すなわち活性酸素）の生成につながる可能性があります種-フェントン反応によるROS）[12]。科学的報告は、細菌感染、新生物、または肝臓病を含むさまざまな状態に寄与する要因として、生物中のフリーラジカルのレベルが上昇するリスクを示しました[13]。遊離鉄によるROSの生成を防ぐ自然で生理学的な戦略は、体内の吸収および輸送経路の各段階で鉄元素を特定のタンパク質と結合させることに基づいています。経口鉄過剰症およびその静脈内/筋肉内投与の場合、鉄循環の生理学的経路は一般に圧倒され、ROSの急速な増加をもたらします[14]。

鉄ベースのナノ粒子（FeベースのNP）は、生物医学的目的のための有望なツールとして広く研究されてきました。これらのナノ構造の最も広範な使用は、それらの磁気特性に関連しています。したがって、それらは主に、特定の組織における腫瘍の画像化または蓄積を目的とした臨床診断技術の造影剤としてテストされてきました[15]。最近、ナノ構造はまた、生物への生物活性物質の送達の新規でより効果的な形態として研究されてきた。 NPキャリアは、バルク形態の物質と比較して、生物のバイオアベイラビリティが大幅に向上していることを明らかにする可能性があります。これは、主にサイズが小さいことに関連しています[16、17]。ある研究では、貧血ラットにおいて、鉄を含むNPの有効性を硫酸第一鉄（貧血を治療するための標準的なサプリメント）と比較しました。血液分析に基づいて、得られた結果は、貧血動物における鉄を含むNPの経口単回投与後の鉄の生物学的利用能の増加を示した。ナノ粒子と硫酸第一鉄を複数回投与した場合、得られた結果は同様でした[18]。別の研究では、ヒトへの代替鉄送達剤としてのFeベースのナノ材料の得られた結果と齧歯動物モデルについて説明しました。著者らは、可溶性形態の鉄と比較して、nanoFeの優れた安全性を特に強調しました。これにより、腸粘膜への鉄の蓄積がなくなり、有益な微生物叢が促進されました[19]。同様に有望な結果は、ビタミンCでキャップされたFeベースのNPで治療された貧血ラットの研究で得られました。これにより、胃腸管からのFe吸収の標準経路を回避することができました。得られた結果は、鉄欠乏療法の標準的な方法と比較して、貧血疾患からの試験動物の回復と、短時間での血液パラメーターの改善を示しました[20]。

材料と方法

ナノ粒子の合成

鉄をドープした酸化亜鉛ナノ粒子（ZnO：Fe NP）は、マイクロ波水熱技術を使用して合成されました。方法は十分に確立されており、比較的安価で、生物に優しく、産業的に拡張可能であり、機能性ドーパントとしてさまざまな外来イオンを導入でき[21、22、23、24、25]、さまざまな酸化物に導入できます[26、27、28]。現在のナノ粒子中の鉄の濃度は5％モルに設定されました。硝酸塩（V）から出発して合成を行った：Zn（NO ₃ ） ₂ ・6H ₂ O（99％、Sigma–Aldrich）およびFe（NO ₃ ） ₃ ・9H ₂ O（96％、カール・ロス）。私たちはさまざまなサプライヤーをテストし、測定可能なレベルの不溶性の残り物を含まない最も均一な製品を提供するサプライヤーを選択しました。化合物を蒸留水に溶解しました：17.63 gの硝酸亜鉛（V）と1.25 gの硝酸鉄（III）（V）。次に、透明な溶液を２５％アンモニア水溶液（カールロス）を使用してｐＨ８にアルカリ化した。得られた赤色の残留物をブフナー漏斗を使用して約１リットルの蒸留水で洗浄し、吸引濾過した。沈殿物を100mlのテフロン容器に入れ、容量の80％まで水を満たしてから、Ertec MagnumIIリアクターチャンバーで閉じました。マイクロ波水熱プロセスは、4MPaで20分実施されました。反応後、淡赤色の生成物を収集し、60℃で一晩乾燥させた。

ナノ粒子の特性評価

製品の特性評価は、走査型電子顕微鏡（SEM）、フォトルミネッセンス（PL）およびカソードルミネッセンス（CL）分光法、およびエネルギー分散型元素分析（EDX）を使用して実施されました。 SEM測定は、特徴的な放射線検出器と二次電子（SE）および透過（TE）モードのカソードルミネッセンスシステムGATAN Mono CL3を備えた高解像度（1 nm）日立SU-70顕微鏡を使用して実施しました。フォトルミネッセンスの発光および励起スペクトルは、励起源としてキセノンランプと浜松ホトニクスR928P光電子増倍管を備えたHoriba / Jobin-YvonFluorolog-3分光蛍光光度計を使用して記録されました。動的光散乱（DLS）とゼータ電位は、DelsaMaxPro粒子特性評価システムで測定されました。熱重量分析（TGA）は、アルゴンフロー下でNETZSCH STA 449 F1Jupiter熱重量分析装置を使用して実施しました。 SEM測定は、寒天ポリカーボネートでコーティングされた400銅メッシュにナノ粒子を堆積させた後に実施しました。 Sonics VCX500超音波プロセッサを使用してサンプルを蒸留水に懸濁し、懸濁液の液滴をメッシュ上に置いてから乾燥させました。重い粒子を2時間沈降させた後、サンプルを調製しました。

インビトロモデル

現在の研究では、消化管の上皮細胞のモデルとして、Caco-2細胞株（白人結腸腺癌細胞）を使用しました。細胞株は、European Collection of Authenticated Cell Cultures—ECACC（Sigma–Aldrich、カタログ番号86010202）から入手しました。細胞を0.5×10 ⁶ で播種しました 6ウェルまたは96ウェルプレートに細胞/ mlを入れ、10％ウシ胎児血清-FBS（Gibco）、1％非必須アミノ酸-NEAA（Gibco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地-DMEM（Gibco）で維持）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン-PSN（Gibco）、および0.2％重曹（Gibco）、37°C​​および5％CO ₂ 。 95〜100％のコンフルエンシーが観察されたら、細胞培養培地を除去し、新鮮な増殖培地中のZnO：FeNPの懸濁液を添加しました。細胞を4つの異なる濃度のZnO：Fe NP（1.0; 0.1; 0.01;および0.001mgのZnO：Fe NP / ml）とともに、37°C​​および5％CO ₂ で24時間インキュベートしました。 。

細胞生存率分析

XTTアッセイとトリパンブルー染色の2つの方法を使用して、Caco-2の細胞生存率を評価しました。 XTTアッセイに必要なすべての試薬は、市販のキット（Cell Proliferation Kit II、Roche）から提供されました。異なる濃度のZnO：Fe NPを含む96ウェルプレートで増殖させた細胞をインキュベートした後、細胞を50μlのXTT標識混合物とともに37°Cおよび5％CO ₂ で4時間インキュベートしました。 。続いて、ホルマザンの濃度を分光光度法で評価した。吸光度は470 / 650nmで測定され、結果は生細胞の数と相関していました。次の実験では、最高の吸光度の結果を細胞の100％の生存率と仮定しました。最終結果は、4つの別々の実験の繰り返しに基づいて計算されました（ n =4）。

トリパンブルー染色を行うために、6ウェルプレートで増殖した細胞をさまざまな濃度のZnO：Fe NPとインキュベートした後、細胞を収集し（0.05％トリプシンおよび0.2％EDTAで10分間）、遠心分離し、ペレットを再培養しました。 1mlの増殖培地に懸濁。 100マイクロリットルの滅菌0.4％トリパンブルー溶液を100μlの細胞懸濁液と混合しました。 10マイクロリットルのサンプルをカウントスライドにロードし、JuLi Br Couting Software（NanoEnTek）を使用して分析し、生細胞の数を評価しました。最終結果は、3つの別々の実験の繰り返しに基づいて計算されました（ n =3）。

動物モデル

この予備研究の目的のために、成体の雄のBalb-cマウス（ n =6）標準的で管理された生活条件（12/12時間の明暗期間、25°C、湿度30％）の下で、標準的な食物と水（自由に与えられる）で個別に維持されました。すべての手続きは、地方倫理委員会によって承認されました。 WAW2 / 59/2017。 7日間の順化後、水中のZnO：Fe NPの懸濁液（10 mg / ml; 0.3 ml /マウス）を実験群（ n ）の動物に強制経口投与（IG）しました。 =4）。対照群のマウスは、IGによって0.3 mlの飲料水を与えられました（ n =2）。実験中、試験動物の行動の変化や組織の異常は見られませんでした。 24時間後、実験群と対照群の両方のマウスをCO ₂ で犠牲にしました。 -O ₂ チャンバー（CO2ボックス、Bioscape、Merazet）とそれに続く組織の収集。新たに収集したサンプルの半分は、原子吸光分析（AAS）のために-20°Cで凍結しました。組織の後半を4％緩衝ホルマリンで固定し、70％エタノールに移しました（24時間後）。続いて、サンプルをエタノールの濃度を上げながら脱水し、パラフィン（Leica TP1020、Leica EG1150）に包埋し、ミクロトーム（Leica RM2255）を使用して6μmの薄さ（または組織病理学的検査では4μmの薄さ）の顕微鏡スライドを作成しました。

Perlの染色によって評価された鉄の蓄積

脾臓、肝臓、脳の顕微鏡スライドを、鉄の存在についてパールズ法（プルシアンブルー）で染色しました。サンプルを脱パラフィンし、蒸留水に再水和した後、等量の5％フェリシアン化カリウム（Sigma-Aldrich）と5％塩酸（Sigma-Aldrich）を含む作業溶液に入れ、30分間染色しました。続いて、切片を水ですすぎ、ニュークリアファストレッド（Sigma-Aldrich）で5分間対比染色し、水ですすぎ、Permount（Fisher Scientific）でカバーガラスの下にマウントしました。染色されたサンプルの画像は、OlympusBX60顕微鏡とCell ^ P画像取得ソフトウェアを使用して撮影されました。テストされた各サンプルから、16個のランダムに選択された画像が、家庭内画像分析プロトコル[29]に従ってMicroImage v.4.0（Olympus）でさらに検査するために選択されました。脾臓の検査では、組織内の赤脾髄のみが分析中に考慮されました。鉄含有量は、画像内の細胞核の面積に対する鉄陽性染色（青色）の面積と強度の比率として計算されました。

原子吸光分析で測定されたテスト済み組織の鉄濃度

以前に収集され、-20°Cで保存され、その後解凍された組織サンプルは、[24]の前に詳細に説明されたプロトコルに従って、原子吸光分析（AAS）法による鉄濃度のさらなる定量的評価のために準備されました。簡単に説明すると、組織の重量を測定し、5 mlの65％硝酸と1 mlの30％過酸化水素（Merck）を含む溶液で16時間以上保持しました。続いて、サンプルをマイクロ波システムEthos 900（Milestone、USA）で鉱化して溶液にし、AAS（Perkin-Elmer）で鉄含有量を評価しました。

統計分析

研究で得られたデータは、平均±平均の標準誤差（SEM）として提示されました。 Perlの染色で得られた鉄の蓄積を統計的に評価するために、すべてのグループに対して、Tukey-Kramer多重比較事後検定を使用した一元配置分散分析を実行しました。 AAS分析からの対照群と実験群の有意差を評価するために、対になっていない t テストが使用されました。インビトロ実験における対照群と実験群との間の有意差は、一元配置分散分析とダネット多重比較検定を使用して評価されました。統計分析は、GraphPad InStat3.10を使用して計算されました。すべてのテストで、得られた結果は P で統計的に有意であると見なされました。 ≤0.05および P ≤0.01および P ≤0.001は、非常に重要です。

結果

ナノ粒子の特性評価

マイクロ波水熱プロセスZnO：Feナノ結晶で結晶化した走査型電子顕微鏡（SEM）画像を図1に示します。合成後に保存した乾燥粉末を超音波浴を使用して水に分散させ、銅400メッシュに堆積させました。超音波処理による懸濁液は、大きな粒子の凝集と沈降のために2時間放置されました。サンプルでは、​​細長い六角柱の形をしたZnO結晶がよく見られます。結晶はc面の成長方向に伸びています— [001]。プリズムの交差点が画像にはっきりと見られます。六角形のサイズは50〜100nmです。基本的に、ナノ粒子は凝集し、より大きな構造を形成します。図１ｂには、高度に凝集してグループ化されたＺｎＯ：Ｆｅ結晶のそのような構造が示されている。サンプルは不均一な粒子で構成されており、サイズ分布には数百ナノメートルからマイクロメートルが含まれています。 ZnO相以外の分離の明確な兆候はなく、鉄ベースの相（酸化鉄など）の結晶化がないことを示唆しています[30]。

大きな凝集体の沈降後に銅メッシュ上に堆積したZnO：FeNPの走査型電子顕微鏡画像。倍率100kx（ a ）および20 kx（ b ）。水1ミリリットルあたり1mgのZnOナノ粒子を含む懸濁液を、ポリカーボネートでコーティングされた銅メッシュに滴下して、高解像度の走査型顕微鏡観察を可能にしました。

熱重量分析（TGA）と示差走査熱量測定（DSC）は、室温から800°Cまでのアルゴンの流れの下で実行され、得られた結果を図2に示します。最初の質量損失は200°Cまで発生し、これにより、サンプルの質量が初期質量に対して4.78％減少しました。 2番目の損失は200〜400°Cで記録され、その値は約7.36％です。 800°Cまで他の質量減少はありませんでした。 1つ目は表面吸着水分子の蒸発に関連しており、2つ目はヒドロキシル基の還元が原因である可能性があります。 DSC曲線は、118.3°Cでの吸熱ピーク（-0.6175 mW / mg、水の蒸発）と283.1°Cでの発熱ピーク（0.4356 mW / mg、ヒドロキシル基の分解）を示しています。分解に関連する小さな影響は、マイクロ波水熱プロセスでZnO：Feナノ粒子のほぼ完全な結晶化が起こったことを示しています。

アルゴン中で加熱されたZnO：FeNPのTGA / DSC

図3は、ZnO：FeNPの室温フォトルミネッセンススペクトルを示しています。発光スペクトル（図3a）は、2つの特徴で構成されています。低強度のナローバンドエッジ（NBE）発光と、非常に強いブロードディープレベルエミッション（DLE）の発光です。最初のピークは約380nmで、2番目のピークは600nmです。スペクトル上でのDLE強度の優位性は、得られたナノ結晶が結晶学的レベルで強く欠陥があることを示唆しています[31、32、33]。励起スペクトル（図3b）は、ZnO：Feのバンドギャップの深いレベルからの発光のメカニズムを示しています。

フォトルミネッセンス（PL）発光（ a 、λ _exc =260 nm）および励起（ b 、λ _em =595 nm）ZnO：FeNPのスペクトル。サンプルをアルミニウムマトリックスに緩く注ぎ、バランスを取り直してPL測定を可能にしました。 2次以上の励起波長は、スペクトルバンドパスフィルターでフィルター処理されました

ZnO：FeNPのカソードルミネッセンススペクトルを図4に示します。 DLE / NBE強度比は約25です。NBEバンドのピークは約25です。 380 nm、DLEバンドには、約570、625、653 nmでピークに達し、770nmで非常に弱い4つの成分が含まれています。 McCluskey and Jokela [34]によると、570 nmのバンドは酸素空孔に関連しており、他のバンドはウルツ鉱型格子の亜鉛空孔に割り当てられています[35]。

ZnO：Fe NPのカソードルミネッセンス（CL）スペクトル。乾燥ナノ粉末をペレット化して、大量のサンプルに由来するCLスペクトルを取得しました。示されているバンドは、酸化亜鉛ナノ結晶に存在する結晶学的欠陥の量と質を示しています

サンプル中の鉄の量は、原子吸光分光法（AAS）とエネルギー分散型X線分光法（EDX）の2つの手法を使用して決定されました。 AASの場合、げっ歯類の実験で使用したのと同様に調製した懸濁液を分析して、ZnO：Fe中の原子％Feが3.98であることを示しました。 EDX法により、銅メッシュ内の乾燥粉末を分析したところ、鉄の濃度は4.5％atでした。亜鉛イオンに関連して。

懸濁液の特性は、DLSおよびTEM法を使用して測定され、ナノ粒子の直径の分布は図5に示されています。分布は二峰性です。1つの集団では、最も頻繁な直径は20〜100 nm（TEM）および50〜 200 nm（DLS）。 2番目の母集団には、100〜500 nm（TEM）および約100〜500nmの大きなオブジェクトが少量含まれています。 150〜500 nm（DLS）。ナノ粒子の二峰性は、示された両方の方法で明確に観察されます。より大きな集団におけるサイズの高い分散は、それが凝集したナノ粒子に対応することを示しています。 100 nmを超える直径について示されている統計は、ZnO：Feナノ粒子が凝集しているさまざまな方法を示しています。ゼータ電位が0V未満であることから明らかなように、水懸濁液中のナノ粒子は負に帯電しています。約-40 mVの値は、最終的な水懸濁液が安定しており、ナノ粒子が凝集に親和性がないことも示しています。

水懸濁液（点）で測定され、ナノ結晶の短辺と長辺に沿ってTEM画像から直接取得されたナノ粒子の流体力学的半径の分布（テキストを参照）。ナノ粒子は、高出力超音波ホーンによって水懸濁液に移されました。乾燥物の濃度は、水1mlあたり1mgでした。沈降が終了した後、移動度の10回の測定を実行して、信頼できる移動度とナノ粒子の直径のプロットを取得しました。 TEMサイズは画像から直接取得されました： c に沿って 軸（ZnO結晶の長辺）および m に沿って および a 軸（結晶の短辺）

ZnO：Feナノ粒子のinvitro毒性評価

両方の細胞生存率分析（XTTおよびトリパンブルー）は、生細胞の数と直接相関するZnO：FeNPとインキュベートしたCaco-2細胞の吸光度の低下を明らかにしました。統計的に有意な変化は、培養細胞を最高濃度のNP（1.0および0.1 mg / ml）に24時間曝露した後にのみ観察されましたが、生理学的レベルのNP濃度（0.01および0.001 mg / ml）は細胞培養に有意な影響を与えませんでした。 （図6および7）。

XTT法で試験した細胞生存率（Caco-2ライン）。細胞は、次のようにさまざまな濃度の鉄でドープされたZnONPの懸濁液に24時間さらされました。 0.01 mg / ml; 0.1 mg / ml;および1mg / ml。結果は、対照群と実験群の生細胞の平均パーセンテージ（±SEM）を表します（ n =4）。 ** P の大きな違い ≤0.01vs。コントロールがグラフにマークされました

トリパンブルー染色でテストされた細胞生存率（Caco-2ライン）。細胞は、次のようにさまざまな濃度の鉄でドープされたZnONPの懸濁液に24時間さらされました。 0.01 mg / ml; 0.1 mg / ml;および1mg / ml。結果は、対照群と実験群の生細胞の平均パーセンテージ（±SEM）を表します（ n =3）。 ** P の大きな違い ≤0.01vs。コントロールがグラフにマークされました

動物モデルにおける鉄の分布

ZnO：Fe NP、マウス（ n =4）ZnO：Fe NPの懸濁液を経口投与し、24時間後、重要な組織をさらに収集して動物を怖がらせた。検査した組織内の鉄含有量の定量的評価は、収集したすべての臓器についてAAS法で分析し、肝臓、脾臓、脳組織についてはMicro Imageソフトウェア（Perlの染色に基づく）で計算しました。図8に示すように、データは、ZnO：Fe NPの経口投与の24時間後に、心臓、骨格筋、脾臓、および小腸組織の鉄含有量のレベルが増加したことを示しています（統計的に有意な増加はありません）。骨の場合、実験群内の鉄の平均レベルは、対照結果よりもわずかに高かっただけです。肝臓および脳組織中の鉄の含有量は大幅に増加しました（ P ≤0.01）ZnO：Fe NPのIGの24時間後、対対照群（図8）。腎臓、内臓および皮下脂肪組織、および肺では、ZnO：FeNPの投与後24時間でFeレベルが低下しました。

ZnO：FeNPのIG投与の24時間後の分析された組織内の鉄の分布。データは、実験グループのテストされた臓器におけるFeの平均パーセンテージを表します（ n = 4）対照群と比較（100％-水平線）。鉄含有量はAASで分析されました。 ** P の大きな違い ≤0.01vs。コントロール

肝臓内でPerlの方法で染色された鉄含有量の評価は、非常に重要であることが明らかになりました（ P ≤0.001）すべての実験動物と対照動物でFeレベルが上昇しました（図9b）。同様に、脾臓組織の赤脾髄で得られた結果は、非常に有意な（ P ≤0.001）すべての実験動物と対照動物の鉄含有量の増加（図10b）。脳組織の分析から得られたデータは、ZnO：Fe NPのIGの24時間後に実験グループでFeの増加がないことを示しました（図11b）。

Perlの染色およびMicroImageソフトウェアで計算された肝臓の鉄含有量。結果は、細胞核の面積に対する鉄陽性染色の面積と強度の比率として計算されました。検査した各動物の平均（±SEM）結果として提示されたデータ（ a ）および対照群と実験群の両方の平均（±SEM）値として（ b ）。 * P の大きな違い ≤0.05、** P ≤0.01、および*** P ≤0.001

Iron content in the red pulp of the spleen calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ）。 Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001

Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ）

In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).

Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).

Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens

General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).

Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a 、 b ) and red pulp (c 、 d ）。 The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a 、 b ) or × 20 (c 、 d ) lens

Discussion

As was mentioned in the “Introduction” section, the iron deficiency is a considerable nutritional disorder in human population, as well as in other mammalian species [3, 7, 8]. Consequently, an implementation of new, more efficient and safe iron supplementation strategy seems to be highly desirable. Currently presented results come from preliminary studies aimed at further, detailed investigations related with potential usage of biodegradable ZnO NPs doped with Fe as a novel strategy for iron supplementation. As was confirmed previously, in-house manufactured zinc-based NPs undergo very efficient absorption after their oral administration with further, rapid distribution to major organs and tissues in the living organism [22,23,24]. Moreover, we reported that these nanostructures demonstrated bio-safety and biodegradability within the body along with fast clearance from the organism [36]. Employed in the current study, the oral way of NP administration provides a highly efficient way of fast delivery of the exogenous nanostructures to the body, based on persorption process [37, 38]. Furthermore, this strategy decreases chance of eventual toxic effects related with administration of iron-doped substances, because of the existence physiological “security mechanisms” related to both Zn and Fe absorption from the gastrointestinal tract. This crucial, physiological pathways of iron distribution may be avoided in case of intravenous/intramuscular application iron-doped substances [14], which can result in increased possibility of occurrence iron-related toxic side effects. The examination of the internalization pathways of the nanoparticles, their dynamics, and cellular systems involved in the process is being currently studied in the frame of other publication. In the current paper, we decided to show overall effect of our nanoparticles on living organism, focusing on the effect of iron.

Toxicity of nanostructures may be related with various features of material, not only with chemical composition, but also with e.g. size, shape, or their ability to aggregate [39]. Nevertheless, it was confirmed that smaller NPs were better absorbed than bigger one and high surface-to-volume ratio makes the particles of some metals exceptionally reactive and cytotoxic [40, 41]. Nanostructures were able to enter cells and affect their components, which altered the viability of cells [42, 43]. In one of the previous investigations on cytotoxicity of ZnO or FeO NPs, authors did not observe toxic effects (based on ability of examined cells to grow and divide), even in high doses of NPs [44]. Presented here is a study performed on Caco-2 cell line, as a model of epithelial cells of the gastrointestinal tract, revealing a low toxicity of used nanomaterials. ZnO:Fe NPs in small/physiological doses (0.001 mg/ml and 0.001 mg/ml) did not alter the viability of cells (Figs. 6 and 7). Following the incubation of Caco-2 cells with high doses of ZnO:Fe NPs, a statistically significant decrease of viability was observed. However, IC50 (the half maximal inhibitory concentration), as a measure of the effectiveness of a substance in inhibiting a specific biological or biochemical function, still remained surprisingly high—around 1 mg/ml (Figs. 6 and 7). Observed drop of cell viability was probably associated with the physical deposition of nanoparticles on the surface and overstress of the cells rather than the cytotoxic effect related to the nanoparticles themselves. In another study, authors concluded decrease IC50 of cells from cancer cell line following incubation with ZnO and ZnO:Fe3O4 NPs and relatively low cytotoxicity effect (and non-dose-depended) of examined NPs on noncancerous cells [45]. Similar observations were also reported for ZnO and platinum NPs [46, 47]. Nevertheless, further examinations on chronic toxicity profile of such composites including antioxidant activity profiling, production of reactive oxygen species (ROS), and using another cells and cell line must be performed.

Obtained in the in vivo experiment, results indicated a rapid distribution of ZnO:Fe NPs to tissues mostly related with iron homeostasis (Figs. 8, 9, and 10). Similar studies, concerning the bioavailability of iron from “nano” form, were mostly performed on anemic animals or examined following the iron depletion period [18, 19, 48], where our preliminary studies were carried out on healthy, normally maintained mice. Comparison of data presented in the current work with similar studies may be misleading because of differences in employed NPs e.g. their size, shape and compound or route, dose, and frequency of their administration to animals. Results of iron level in the liver showed significantly increased level at 24 h after application of ZnO:Fe NPs, comparing with control (Figs. 8 and 9). Iron accumulation was visible in hepatocytes of liver tissue (Fig. 12), where the major storage site of the element takes place [49]. Similarly, previous studies with intraperitoneally injected iron oxide, magnetic NPs to rats also resulted in 55% accumulation of these nanomaterials in the liver at 6 h following injection [50]. Likewise, the spleen level of iron in the current study was clearly higher in experimental group, than within control (Figs. 8 and 10). Interestingly, tendency of iron accumulation was detected around blood vessels within the spleen, which might indicate the transfer of ZnO:Fe NPs from general bloodstream into the tissue (Fig. 13b, d). Primary accumulation of nanostructures within the liver and spleen after their application might also be attributed with clearance via mononuclear phagocytes in these tissues, as was also postulated previously [50,51,52].

In case of brain tissue, the measurement of total iron level (AAS method) showed significantly higher level of the element in animals with previously administered ZnO:Fe NPs (Fig. 8), which was not confirmed by analysis based on Perl’s staining (Fig. 11). Inconsistency between both, employed in the study methods, may be related with sensitivity of Perl’s staining. This histological method of iron visualization is dedicated to detect iron aggregates. Iron contained in the “nano” form, additionally distributed within the tissue without physiological deposits of these elements, might not be sensitive enough to stain these extremely small deposits of iron. Possibility of overcoming the blood-brain barrier with manufactured by us nanostructures was already described [23, 24, 53]. In another study, with intraperitoneally administered superparamagnetic maghemite iron oxide NPs to mice, no accumulation of iron in experimental group was detected, nor within brain or heart tissues, which is inconsistent with our results [52]. Another study, focused on a distribution pattern of iron oxide magnetic NPs within living organism, indicated similar circulation mechanism of nanostructures as in our study—increased level of Fe within the brain and heart after administration of NPs [51]. Increased level of iron in heart tissue may be caused by presence of ZnO:Fe NPs in the general blood stream and consequently its higher level within the tissue. Likewise, higher level of iron within a skeletal muscle detected in AAS analyses is probably related with intensive blood circulation within this muscle and in case of small intestine, the improved content of iron is caused by residues of orally administered NPs.

結論

In conclusion, we performed the preliminary study on the distribution of biodegradable ZnO:Fe NPs as a perspective, new supplementation strategy in iron deficiency. Deposition of iron in the body of mice following oral administration of the nanostructures was detected within the crucial tissues, where the major storage site of the element takes place. We assumed that obtained in the study results might indicate the biodegradable ZnO:Fe NPs as a good carriers of exogenous iron in the living body. However, further research is needed to completely understand the exact mechanisms of the deposition, elimination, and influence of ZnO:Fe NPs on the body.

データと資料の可用性

The conclusions of the following study are based on the data presented in this manuscript.

略語

NP：

ナノ粒子

ZnO:Fe NPs:

Zinc oxide nanoparticles doped with iron

IG:

Intra-gastric

ROS:

活性酸素種

SEM：

走査型電子顕微鏡

PL：

Photoluminescence spectroscopy

CL：

Cathodoluminescence spectroscopy

DLS：

動的光散乱

Caco-2 cells:

Caucasian colon adenocarcinoma cells

DMEM：

Dulbecco’s modification of Eagle’s medium

FBS：

ウシ胎児血清

NEAA:

Non-essential amino acids

PSN:

Penicillin–streptomycin–neomycin

EDTA：

エチレンジアミン四酢酸

AAS:

Atomic absorption spectrometry

SEM (in statistical analysis):

Standard error of the mean