結腸特異的薬物送達のためのキトサンでキャップされた酵素応答性中空メソポーラスシリカナノプラットフォーム

要約

生分解性キトサン（CS）が切断可能なアゾ結合（HMSS–N =N–CS）を介して結合した中空メソポーラスシリカ球（HMSS）に基づいて、酵素応答性結腸特異的デリバリーシステムが開発されました。ドキソルビシン（DOX）は、HMSSの中空空洞とメソ細孔に非結晶状態で35.2％の高負荷量でカプセル化されました。インビトロでの薬物放出は、HMSS–N =N–CS / DOXが酵素応答性薬物放出を実行することを証明しました。グラフト化されたCSは、生体適合性と安定性を高め、HMSSへのタンパク質の吸着を減らすことができます。胃腸粘膜の炎症と細胞毒性の結果は、HMSSとHMSS–N =N–CSの良好な生体適合性を示しました。細胞取り込みの結果は、HMSS–N =N–CS / DOXを結腸酵素混合物とプレインキュベートした後、DOXの取り込みが明らかに増加したことを示しました。結腸酵素とインキュベートしたHMSS–N =N–CS / DOXは細胞毒性の増加を示し、そのIC ₅₀ 値は、結腸酵素を含まないHMSS–N =N–CS / DOXグループの値の3分の1でした。本研究は、経口結腸特異的薬物送達のためのメソポーラス担体に関するその後の研究の基礎を築きます。

はじめに

最近、刺激応答性薬物送達システム（DDS）が、標的となる病変組織における薬物の効率的な負荷と選択的放出のために大きな注目を集めています[1]。設計された刺激応答システムは、患部に送達され、オンデマンドの薬物放出を実現して、治療効果を改善し、早期の漏出によって誘発される副作用を防ぐことができます。酸化還元電位[2]、pH [1]、酵素[3]、温度と光[4、5]などのすべての内部および外部刺激は、刺激応答性DDSの設計に使用されています。これらの刺激の中で、酵素は、内部刺激として、さまざまな組織でのそれらの明確な濃度のために広く注目されています[6]。

過去20年間で、サイズが2〜50 nmのメソポーラスシリカ球（MSS）は、刺激応答性の薬物担体として確立されてきました[7、8]。薬物負荷容量、よく組織化された細孔構造、容易に機能化される表面、および優れた生体適合性[9]。さらに、メソポーラスシェル構造と中空空洞を備えた中空メソポーラスシリカ球（HMSS）ナノ粒子は、中空構造がMSSキャリアよりも高い貯蔵容量でより多くの薬物を効率的に保持できるため、従来のMSSよりも優れています[10、11]。 MSSに基づくあらゆる種類の刺激応答性ナノキャリアは、ポリマー[12]、無機ナノ粒子[13]、デンドリマー、生体高分子[14]、大環状化合物ペプチド[15]、脂質[15]などのさまざまなゲートキーパーを使用して薬物分子をホストするために開発されました。 16]。機能的キャッピングを備えたMSSに基づく多数のDDSは、さまざまな外部または内部刺激に応答して放出を実現できますが、結腸特異的標的化ドラッグデリバリーに使用されたものはほとんどありません。

経口ドラッグデリバリーが薬物を投与するためのお気に入りで簡単な方法であることはよく知られています。結腸特異的標的化ドラッグデリバリーは、クローン病、結腸直腸癌、潰瘍性大腸炎などの結腸疾患の治療に非常に魅力的です。しかし、結腸特異的薬物送達は、胃腸（GI）管の他の部位よりも水分含有量が少なく、経口吸着のための表面が比較的少ないなど、いくつかの問題に遭遇する可能性があります[17、18、19]。さらに、経口DDSは胃内の強酸性環境にも適合し、消化管に負荷された薬物の分解を促進する可能性があるため、結腸を標的とした送達を実現する能力が失われます[19]。このため、いくつかのpH依存性DDSは、胃領域の強酸性条件に抵抗し、消化管のほぼ中性のpH値（6〜7）でpHによって引き起こされる薬物放出を実現するように設計されています[20、21、22 、23]。腸（pH 6.8）領域と結腸（pH 7.4）領域の間の酸性度にはわずかな違いしかありません。したがって、このようなpH応答性DDSは、結腸特異的放出を実現するのが困難です。

カチオン性で生分解性の天然に存在する多糖類であるキトサン（CS）は、β-（1-4）結合型グルコサミンとN-アセチル-D-グルコサミンユニットで構成されています[24]。 CSは、生分解性、生体適合性、粘膜付着性、抗菌活性などの魅力的な特性により、生物医学で大きな注目を集めています[25、26、27、28、29]。複雑なプロセスで合成されたポリマー、高分子電解質、超分子と比較して、CSは比較的安価で、キチンの徹底的な脱アセチル化によって容易に入手できます[30、31、32]。さらに、CSは細胞間の密着結合を開き、薬物吸収を増加させることが報告されています[33]。したがって、ポリマーCSは、その優れた生体適合性と、HMSSのメソ細孔を覆って薬物放出をブロックするのに適したサイズであるため、キャッピング剤として選択されました。

私たちの研究では、HMSS材料（HMSS–N =N–CS）に基づく結腸特異的酵素応答性DDSが、スキーム1に示すように初めて設計されました。このシステムでは、HMSSキャリアは選択的エッチング戦略。ポリマーCSはアゾ結合によってHMSSの表面に付着し、HMSSの開口部をブロックするゲートキーパーとして機能しました。 HMSSとCSの間のアゾ結合は、結腸部位の酵素によって切断され[34、35]、HMSSの開口部からCSが分離されます。 HMSSの空洞に埋め込まれるモデル薬物としてDOXを使用し、結腸酵素の存在下での酵素応答性放出を評価するためにinvitro薬物放出実験を実施しました。共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）とフローサイトメトリー（FCM）を使用して、Caco-2細胞による細胞取り込みを調査しました。最後に、Caco-2細胞に対するHMSS–N =N–CS / DOXの細胞毒性を測定しました。

材料と方法

資料

テトラエトキシシラン（TEOS）; N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）;キトサン（DAC≥95％）;セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）; 3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）; 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）;アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸;臭化カリウム（スペクトル純度、≥99.5％）; N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）およびDOXは、Aladdin Chemical Inc.（上海、中国）から購入しました。アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸は、Inno-chem Technology Co. Ltd.（北京、中国）から供給されました。細胞培養培地DMEM、ペニシリン-ストレプトマイシン、およびウシ胎児血清（FBS）は、GIBCO、Invitrogen Co.（Carlsbad、USA）から提供されました。すべての分析試薬は、使用前にさらに精製されたわけではありません。

HMSS–N =N–CSの準備

HMSS–NH ₂の準備

HMSSナノ粒子は、選択的エッチング法を使用して公開された研究に基づいて調製されました[36]。固体シリカ球は、最初に修正ストーバー法によって合成されました。簡単に説明すると、6mLのTEOSを10mLの脱イオン水、74 mLのエタノール、および3mLの濃縮NH ₃の混合物に注ぎました。・h ₂ O.続いて、混合物を60分間撹拌して、周囲温度でコロイド状シリカ懸濁液を得た。固体球体を遠心分離し、洗浄し、さらに使用するために乾燥させた。次に、メソポーラスシリカシェルを固体シリカ球で覆った。 300ミリグラムの固体シリカを45分間の超音波処理により50mLの脱イオン水に分散させました。そして、シリカ懸濁液を60 mLのエタノール、450 mgのCTAB、90 mLの水、および1.7mLのNH ₃の混合物に注ぎました。・h ₂ O.混合物を60分間撹拌した後、TEOS（0.75 mL）を加えた。続いて、ナノ粒子を6時間攪拌した後、遠心分離してサンプルを収集し、40mLの水に再分散させました。約1.2gNa ₂ CO ₃ 激しく攪拌しながら水懸濁液に加えた。混合物を55°Cで12時間維持した後、HMSSナノ粒子の生成物を収集し、無水エタノールで洗浄しました。 HMSSとAPTESの比率を4：1（m / v）にして、HMSS–NH ₂を調製するグラフト後法 N ₂の下で80°Cで 8時間の条件で、CTABは逆流によって除去されました[3]。

HMSS–N =N–COOHの準備

アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸（50 mg）をpH 5.8PBSに加えました。次に、（5 mg / mL）、EDC、および（3 mg / mL）NHSを添加して、アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸を30°Cで1時間活性化しました。そして、15 mg / mL HMSS–NH ₂を含む10mLPBS を加え、混合物を24時間撹拌した。そして、得られたHMSS–N =N–COOHを遠心分離によって分離し、エタノールで洗浄しました。

HMSS–N =N–CSの準備

0.15gのCSと0.5mLの酢酸を50mLの水に加えてCS溶液を調製しました。そして、100 mgのHMSS–N =N–COOHを25mLのpH5.0 PBSに分散させ、EDCとNHSによって0.5時間活性化しました。次に、CS溶液（10 mL）を1日間連続的に攪拌しながら懸濁液に注ぎました。最後に、合成されたHMSS–N =N–CSを遠心分離し、洗浄してサンプルを収集しました。

ミクロフローラからの結腸酵素混合物の抽出

結腸のミクロフローラは、公表された研究[37]に従って収集されました。次に、培養物に接種して、37℃で結腸微生物叢によって分泌される酵素混合物を得た。酵素混合物を含むシミュレートされた結腸培地を0.22μmフィルターで濾過して、培養液からすべての細胞破片を除去した。続いて、濾液を凍結乾燥して粉末状の酵素混合物を得、これをさらなる研究で使用した。

薬物負荷プロセスと酵素応答性リリース

25ミリグラムのDOXを5mLのpH3.5HCl溶液に溶解しました。そして、100 mgのHMSS–N =N–CSをDOX溶液に加え、周囲温度で12時間撹拌しました。続いて、0.2 MNaOH溶液を使用して混合物のpHを7.0に調整し、懸濁液をさらに12時間撹拌した。次に、DOXをロードしたHMSS–N =N–CS（HMSS–N =N–CS / DOXと呼ばれる）を遠心分離および洗浄して、HMSS–N =N–CSの表面に吸着したDOXを除去しました。上清を各ステップで収集し、UV-Vis分光光度法によって480 nmでのDOXローディング効率（LE）を測定しました。 HMSS–N =N–CSにロードされたDOXの総質量は、追加されたDOXの初期質量から、薬物ロードプロセス後にアンロードされたDOXを差し引くことによって計算されました。 HMSS / DOXは、最初のキャリアとしてHMSSを使用してコントロールとして準備されました。 DOXのLEは、次の式に従って計算されました。

$$ \ mathrm {LE} \ \ left（\％\ right）=\ frac {m_A- {m} _B} {m_A- {m} _B + {m} _C} \ times 100 $$

その中で m _A DOXの追加質量 m _B 上澄み中のDOXの質量であり、 m _C HMSS–N =N–CSの総質量でした。

HMSS–N =N–CS / DOXからのDOXのinvitro酵素応答性放出は以下のように評価されました。 2ミリグラムのHMSS–N =N–CS / DOXおよびHMSS / DOXナノ粒子を、さまざまな濃度の結腸酵素混合物（0 mg / mL、0.3 mg / mL、および1 mg / mL）とともに125rpmで振とうpH7.4PBSに分散させました。。指定された時間間隔で、1mLの放出媒体を取り出して吸光度を測定しました。 DOXの放出は480nmで測定されました。コントロールとしてHMSS / DOXを使用しました。

BSA吸着

BSA吸着量は、公表された研究[38、39]に基づいて評価されました。 BSAをpH7.4 PBS（0.5 mg / mL）に加えました。 5ミリグラムのHMSSおよびHMSS–NH ₂ そしてHMSS–N =N–CSを2.5 mLのPBS（pH 7.4）に加えました。そして等量のBSA溶液を供給し、懸濁液を100rpmのシェーカーに入れました。 6時間後、遠心分離を使用して上部溶液を収集しました。最後に、クマシーブリリアントブルー溶液で染色した後、BSA濃度を595nmで測定しました。

特性評価

HMSSナノ粒子のメソポーラスネットワーク構造と形態は、TEM画像（EM–208S、CSIS、米国）によって評価されました。ナノ粒子の表面積と細孔径分布は、窒素吸着分析アナライザー（V-Sorb 2800P、Gold APP Instrument Corporation、中国）を使用して特性評価されました。 ξポテンシャルと粒子サイズは、Nano-z90 Nanosizer（Malvern Instruments Ltd.、Worcestershire、UK）で特性評価されました。 TGA分析は、TGA-50装置（島津製作所、京都、日本）で、窒素流下で10°C /分の加熱速度で測定されました。フーリエ変換赤外分光光度法（FT-IR）スペクトルは、FT-IR分光計（Bruker Tensor27、スイス）を使用して測定しました。範囲は400から4000cm ^-1 で実施されました。 KBrペレット技術を使用します。 Power XRDは、Siemens D5005 X線回折計（Karlsruhe、ドイツ）でCu-Kα放射線（λ）を使用して実行されました。 =1.5418Å）。

細胞培養と細胞取り込み実験

Caco-2細胞は、10％FBS、1％非必須アミノ酸、1％（v / v）ピルビン酸ナトリウム、および1％ストレプトマイシンを添加した培地で培養しました。 NIH-3T3細胞は、1％ストレプトマイシンと10％FBSを含むDMEMで培養されました。ナノキャリアのCaco-2細胞取り込みは、FCMとCLSMを使用して特徴づけられました。 Caco-2細胞を24ウェルプレートに播種しました。一晩培養した後、遊離DOX、HMSS–N =N–CS / DOX、および結腸酵素ナノ粒子（5μg/ mLDOXの濃度に等しい）でプレインキュベートしたHMSS–N =N–CS / DOXを対応するウェルに添加しました。。 2時間のインキュベーションを続けた後、細胞培地を除去し、PBSで完全に洗浄した。次に、細胞を4％ホルムアルデヒドで固定し、CLSM観察のためにHoechst33258で染色しました。 FCMを使用して、細胞取り込みの定量的評価を取得しました。 Caco-2細胞を6ウェルプレートに播種し、さらに24時間インキュベートしました。 PBSで洗浄した後、Caco-2細胞を遊離DOX、HMSS–N =N–CS / DOX、および結腸酵素ナノ粒子（5μg/の濃度に等しい）でプレインキュベートしたHMSS–N =N–CS / DOXでインキュベートしました。 mL DOX）無血清DMEMで2時間。次に、Caco-2細胞を冷PBSでリンスし、トリプシン処理し、0.5mLのPBSに再懸濁しました。細胞内のDOX蛍光は、FACS Cantoフローサイトメーター（Becton、Dickinson、USA）を使用して測定しました。

インビトロ細胞増殖アッセイ

NIH-3T3およびCaco-2細胞に対するHMSSおよびHMSS–N =N–CSブランクキャリアの細胞毒性は、MTTアッセイによって証明されました[40、41]。簡単に説明すると、Caco-2細胞とNIH-3T3細胞を別々に96ウェルプレートに播種し、さらに一晩インキュベートしました。古い細胞培地は、さまざまな濃度のナノ粒子を含む無血清培地に置き換えられました。 2日間のインキュベーション後、50μLのMTT溶液（2 mg mL ^–1 ）を添加し、4時間インキュベートして生細胞を測定しました。次に、MTT溶液を除去し、150μLのDMSOを添加してホルマザンを溶解しました。続いて、マイクロプレートリーダー（Tecan、Männedorf、Switzerland）で570nmの吸光度を測定しました。結腸微生物叢から抽出された酵素混合物とプレインキュベートされた遊離DOX、HMSS–N =N–CS / DOX、およびHMSS–N =N–CS / DOXの細胞毒性は、対応するDOX濃度が（0.1、 1、5、10、および20μg/ mL）。インキュベーション時間は48時間で、他の実験プロセスは上記と同じでした。

毒性研究

胃腸粘膜刺激性試験は、invivoでの経口ドラッグデリバリーのバイオセーフティの評価に不可欠です。オスのSprague–Dawleyラット（180±10 g）をランダムに3つのグループに分けました（各グループに3匹のラット）。ラットには、生理食塩水、HMSS、およびHMSS–N =N–CSナノ粒子を毎日100 mg / kgの用量で投与しました。 7日後、すべてのラットを犠牲にし、組織を収集して組織病理学的検査（H＆E）で検査した。 HMSSおよびHMSS–N =N–CSナノ粒子のバイオセキュリティを評価するために、BALB / cマウス（18–20 g）の体重を100 mg / kgの用量で1日おきに経口投与した後に記録しました。すべての実験手順は、チチハル医科大学の実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施され、チチハル医科大学の倫理委員会によって承認されました。

統計

統計データは、2つのテールの学生の t を使用してSPSSソフトウェアで分析されました。 -テスト。この調査で提示されたエラーバーはSDです。 p <0.05は統計的に有意と見なされます。

結果と考察

HMSS–N =N–CSの準備と特性評価

HMSSは、マイナーな変更を加えた以前の作品に基づいて作成されました[36]。まず、固体のSiO ₂ ナノスフェアを調製し、CTABテンプレートを含む固体シリカナノスフェアの表面にメソポーラスシェルをコーティングしました。次に、Na ₂ CO ₃ 固体SiO ₂を選択的にエッチングするために使用されましたメソポーラスシェルがテンプレートCTABによって保護されている間、ナノスフェア。アゾ結合によって「ゲートキーパー」としてCSが接続されたHMSS–N =N–CSの準備を図1aに示します。まず、HMSSナノ粒子の表面をアルキルカップリング試薬としてAPTESで修飾し、アミノ官能化HMSS（HMSS–NH ₂）にしました。）変更後の方法による。続いて、HMSS–N =N–COOHは、HMSS–NH ₂のアミノ基間のアミド化反応によって調製されました。アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸のカルボキシル基。次に、CSは、HMSS–N =N–COOHのカルボキシル基とCSのアミノ基との間のアミド化反応によって、HMSSナノ粒子の表面に共有結合的に修飾されました。

図1aの透過型電子顕微鏡（TEM）画像に示されているように、HMSSの平均直径は280 nmであり、HMSSは均一な中空構造と高度に秩序化されたメソポーラスシェルを持っていました。メソポーラスシェルの平均厚さは約90nmでした。 HMSSの滑らかな表面と比較して、グラフトポリマーHMSS–N =N–CS（図1b）の表面は粗く、CSがHMSSキャリアを覆っていることを示しています。

メソポーラス材料の表面積と細孔分布は、制御放出のためのホスト分子のロードとデリバリーに重要な役割を果たしました。細孔径分布曲線と等温線はN ₂によって測定されました吸着および脱着分析（図2）。詳細なパラメータ（Brunauer–Emmett–Teller（BET）表面積（ S _ベット）、総細孔容積（ V _P ）、および細孔径分布（ D _P ））を表1に示します。 S _ベットおよび V _P 純粋なHMSSの割合は810.7m ² でした / gおよび0.969cm ³ それぞれ/ g、および D _P 約3.8nmでした。 D _P HMSS–NH ₂のアミノ化後のHMSSとほぼ同じであり、アミノ官能基化後にメソ細孔がブロックされなかったことを示しています。 S _ベットおよび V _P HMSS–N =N–CSの割合は、アゾ化合物とCSコーティングによる修飾後に著しく減少し、CSがHMSSの表面をコーティングしたことを示しています[1]。

<図>

HMSS–N =N–CSのグラフト化の成功は、さまざまな方法で検証されました。 HMSS–NH ₂のξポテンシャル図3aに示すように、機能化後、-27.9から+ 31.4 mVまで変化する大きな変化がありました。これは、HMSSの表面へのアミン基の付加によるものです。 HMSS–NH ₂の後アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸と反応してHMSS–N =N–COOHを形成すると、HMSSの表面にカルボキシル基があるため、ξポテンシャルはさらに-2.0mVに減少しました。 CSポリマーをHMSSの表面にさらにグラフトしてHMSS–N =N–CSを形成した後、ξ電位は+ 32.4mVに戻りました。その結果は、HMSSの表面にあるアミノが豊富な正に帯電したCSコーティングによるものでした[1]。 HMSS、HMSS–NH ₂の熱重量分析（TGA）曲線、HMSS–N =N–COOH、およびHMSS–N =N–CS種を図3bに示します。 HMSS–N =N–COOHと比較して、HMSS–N =N–CSは、CSチェーンの除去により、約19％の追加の重量を失いました。図3bの挿入図に示すように、HMSSの表面へのアゾ結合のグラフト化は、HMSS–N =N–COOHの調製中の色の変化によっても確認されました。反応物HMSS–NH ₂ は白色ですが、生成物HMSS–N =N–COOHは、アゾベンゼン-3,3'-ジカルボン酸がHMSSのアミノ基と反応した後、黄褐色になりました。流体力学的直径（ D _H ）およびHMSS、HMSS–NH ₂の多分散度指数（PDI）値、およびHMSS–N =N–CSは、図3cに示すように、蒸留水中で測定されました。 HMSSの直径は309nm、PDIは0.190でした。 HMSSの表面にアミン基を付加してHMSS–NH ₂を形成した後、 D _H 324nmに増加しました。 HMSS–N =N–CSの直径は342 nmであり、HMSS–NH ₂の直径よりも大きかった。接ぎ木されたCSチェーンによる。 HMSS–N =N–CS（0.177）のPDIは、HMSS–NH ₂のPDIよりも小さかった。、CSのグラフト化後、平均粒子サイズがさらに大きくなったことを示しています。 TEMで得られた直径と比較して、DMSSおよびDMSS–N =N–CSの直径はDLSで測定された方が大きかった。 D _H ナノ粒子のサイズは水和層のある水環境で測定されましたが、TEMによって提供されるナノ粒子のサイズは乾燥ナノ粒子から得られました[3]。 HMSS–NH ₂のFT-IRスペクトル、HMSS–N =N–COOH、HMSS–N =N–CS、およびCSを図4dに示します。 HMSN–NH ₂のピークと比較、2853および2925 cm ^-1 での吸着ピークの増加 − CH ₂の振動に起因していましたカルボキシ末端アゾ結合のグラフト化において。 CSをHMSS–N =N–COOHの表面に添加した後、1660 cm ^-1 で吸着ピークが増加しました。および3435cm ^-1 、υ_{（C =O）}に起因するアミドバンドとCSのN–Hの振動。すべての結果は、HMSS–N =N–CSの準備が成功したことを証明しました。

薬物の状態と負荷効率

DOXは、HMSS–N =N–CSのロードおよびリリース動作を調査するために選択されました。 HMSS–N =N–CSナノ粒子懸濁液のpH値をpH 3.5に調整すると、CS生体高分子は正に帯電しました（pK _a CSの割合は6.3）でした。これは、酸性環境でのプロトン化されたアミノ基によるものです[24]。 CSポリマーは正に帯電して膨潤し、CS電荷間の反発相互作用に起因するHMSSのメソ細孔が開きます。したがって、DOXは拡散によってHMSS–N =N–CSのメソ細孔にアクセスできるようになりました。ただし、薬物を充填した混合物を7.4に調整した後、CS鎖は脱プロトン化して崩壊し、DOXの早期放出を妨げました。

HMSS–N =N–CS / DOXのLEは35.2％であり、他のDOXをロードしたメソポーラスシリカデリバリーシステムよりもはるかに大きかった[3、16]。 HMSSナノキャリアにおけるDOXの高いLEは、中空の空洞、大きな表面積、および薬物貯蔵庫として使用できるメソポーラスネットワークに起因していました。 HMSS–N =N–CS / DOXにおけるDOXの物理的状態は、パワーX線回折（XRD）によって評価されました。 XRDプロファイル（図4）に示されているように、生のDOXは特徴的で強い薬物結晶回折ピークを示しました。 HMSS–N =N–CSとDOXの物理的混合物（PM）も、明らかな結晶回折ピークを示しました。ただし、HMSS–N =N–CS / DOXによって明確な結晶性ピークは示されませんでした。これは、HMSS–N =N–CS / DOXのDOXの物理的状態が、HMSSのメソポーラス構造の制約のために非結晶性であることを証明しました。

シミュレートされた結腸環境でのinvitro酵素応答性放出

HMSS–N =N–CSの酵素応答性放出を調査するために、HMSS–N =N–CS / DOXおよびHMSS / DOXナノ粒子を異なる濃度の結腸酵素混合物を含むpH7.4PBSに添加しました。図5aに示すように、HMSS–N =N–CS / DOXは、pH 7.4のPBSでDOXの徐放を示し、累積放出率は24時間以内に約10％に過ぎず、CSの優れたキャッピング能力を示しています。ポリマーとアゾ結合。予想通り、pH 7.4のPBS中の希薄酵素の場合、DOXの累積放出は同じ期間内に20％以上に改善されました。さらに、濃縮酵素の存在下で、DOXの放出量は劇的に40％近くまで増加しました。 HMSS–N =N–CS / DOXからの酵素応答性放出と比較して、HMSS / DOXからのDOXの放出は、濃縮酵素の存在下または非存在下で同様の傾向がありました。比較的低い薬物放出パーセンテージは、負に帯電したHMSSと正に帯電したDOXの間の静電相互作用によるものでした[42]。上記の結果は、HMSS–N =N–CS / DOXからのDOXの放出が、結腸領域の微生物叢から抽出された酵素によって著しく加速されたことを証明しました。酵素応答性の放出メカニズムは、HMSS–N =N–CSのアゾ結合が酵素によって分解され、HMSSの表面からCSが分離し、HMSSから急速に放出されることである可能性があります。アゾ結合は、結腸の微生物叢によって分泌される酵素によって切断されることが報告されています[34、35]。

さらに、模倣GIT環境でのHMSS–N =N–CS / DOXからの酵素応答性放出をさらに評価するために、HMSS–N =N–CS / DOXナノプラットフォームを最初にSGFに2時間分散させ、次にさらに分散させました。 SIFを6時間行い、最後に、1 mg / mLの抽出酵素を含むpH7.4のPBSに担体を添加しました。図5bに示すように、シミュレートされた胃液では、DOXの放出は比較的速く、累積量は2時間以内に15％に達しました。比較的速い放出は、中性条件下よりも酸性条件下でのHMSS–N =N–CSとDOX間の相互作用が弱いためでした[1]。次に、SIFでDOXのリリースが2〜8時間遅くなりました。しかし、HMSS–N =N–CS / DOXを抽出酵素とともにpH7.4 PBSでインキュベートした後、DOXの放出は著しく増加し続け、累積放出量は24時間以内に50％以上に達しました。 HMSS–N =N–CS / DOXからの不完全なDOX放出は、正に帯電したDOXと負に帯電したHMSSの間の強い相互作用によるものでした。

HMSS–N =N–CSによるタンパク質吸着と安定性

経口投与の場合、ナノキャリアの表面特性は、薬物放出挙動と生体吸着に不可避的に影響を及ぼします[43]。表面へのタンパク質吸着のアッセイを使用して、HMSSの表面へのグラフト化CSの効果を評価しました。図6aに示すように、裸のHMSSナノキャリアは最大16.5％の劇的なBSA吸着を示しました。これは、HMSSの大きな表面積と中空空洞、強力な吸着能力、およびHMSSとBSAのシラノール基間の非特異的相互作用に起因します。 38、39]。さらに、HMSS–NH ₂ 同様に、10.2％の比較的高い吸着BSA量を持っていました。それにもかかわらず、ポリマーCSをカバーとして追加した後、表面に吸着されたBSAの割合は2.5％に著しく減少し、HMSS–N =N–CSの生体内挙動への影響が劇的に減少しました。 HMSS–N =N–CSおよびHMSSサンプルの安定性をさらに観察するために、20 mgのHMSS–N =N–CSおよびHMSSをpH 7.4PBSおよび脱イオン水に添加しました。 As displayed in Fig. 6b, although HMSS–N=N–CS and HMSS were relatively stable in water, HMSS quickly flocculated in pH 7.4 PBS. By contrast, the dispersity of HMSS–N=N–CS was obviously enhanced after the polymer CS was grafted onto the surfaces of HMSS. Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.

Cellular Uptake

Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.

In Vitro Cell Viability Evaluation

To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.

The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. IC ₅₀ value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. IC ₅₀ value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC₅₀ value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.

Toxicity Studies

The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.

結論

In summary, biodegradable CS was attached through azo bonds to gate the openings of HMSS to achieve enzyme-responsive colon-specific drug delivery. DOX was loaded in the hollow cavity and mesopores of HMSS in a noncrystalline state with a high loading efficiency of 35.2%. Stability and BSA adsorption results illustrated that the CS gates could increase the biocompatibility and stability of HMSS. In vitro release results proved that HMSS–N=N–CS/DOX exhibited enzyme-responsive drug release behavior in the presence of colonic enzymes. CLSM uptake and FCM results indicated that the cellular uptake of DOX was obviously increased after HMSS–N=N–CS/DOX was incubated with the colonic enzyme mixture. Cell viability results indicated that HMSS–N=N–CS/DOX incubated with colonic enzymes showed increased cytotoxicity, and the IC₅₀ value obviously decreased from 32.22 μg/mL for HMSS–N=N–CS/DOX to 9.41 μg/mL upon incubation.