標的遺伝子サイレンシングBRAF相乗効果は、新しいGAL-GNR-siBRAFナノシステムを使用して肝細胞癌細胞の増殖を阻害します

はじめに

肝細胞癌（HCC）は、世界の主要な健康問題です[1]。これは世界で6番目に多い癌であり、癌関連死の3番目に多い原因です[2、3]。ほとんどのHCC症例は、東アジアとサハラ以南のアフリカで発生します。しかし、フランス、英国、日本、米国などの一部の先進国では発生率が上昇しています[4]。初期のHCCの標準的な治療法は、腫瘍の外科的切除です。手術後の5年生存率は89〜93％の範囲です[5]。残念ながら、早期に診断されるHCC患者の割合はごくわずか（約20〜30％）です。ほとんどのHCC患者（> 70％）は進行した場面で発見され、外科的切除を受けることができません。他の治療オプションには、肝移植、経カテーテル動脈化学塞栓療法（TACE）、および全身化学療法が含まれます[6]。ただし、肝移植は供給によって制限されており、不完全なTACE塞栓術は、全身化学療法の重大な副作用や全体的な予後不良を伴う治療の失敗につながる可能性があります。したがって、肝細胞癌の新しい治療法は、臨床的に非常に厳しいものです[7]。

RAS / RAFシグナル伝達経路は、肝臓がんの発症に重要な役割を果たしており、BRAFはこの経路に不可欠ながん関連遺伝子の1つです。これらの遺伝子の遺伝的変化は、しばしば2つのカスケード障害を引き起こします。 RAS / RAFシグナル伝達経路の異常な活性化は、癌患者の予後不良と関連しています[8]。 BRAFはRAFファミリーで最も頻繁に変異する遺伝子であり、RAS / RAF経路を標的とすることは、HCCの治療のための新しい治療戦略です[8,9,10]。 RAFキナーゼ阻害剤であるソラフェニブはHCCの治療に有用であることが示されているため、BRAF変異がHCC療法の好ましい標的になっています[8]。より具体的には、RAFキナーゼ阻害剤ソラフェニブの臨床開発がアジア、ヨーロッパ、および米国のHCC治療で見出されているため、BRAF変異は進行したHCCの治療の望ましい標的となっています[11]。プラセボと比較して、ソラフェニブは全生存期間を延長し、進行したHCC患者の全生存期間の中央値を延長しました[12、13、14]。しかし、ソラフェニブは腫瘍を標的とする能力が低く、高血圧、脱毛、悪心などの有害な副作用を引き起こす可能性があります[15]。高い特異性で肝臓がんを標的とし、RAFをブロックする薬剤は、さらに調査される必要があります。

肝臓ガラクトース受容体としても知られるアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）は、肝細胞の正弦波表面に発現するC型レクチンです[16]。 ASGPRは、末端ガラクトース残基を持つ物質の結合、内在化、および除去に重要な役割を果たすため、肝臓ナノ構造の必須のターゲットであると考えられています[17]。いくつかの単糖（ガラクトース、マンノース、ラクトース、N-アセチルガラクトサミン、およびシアル酸）は、さまざまな程度でASGPRと相互作用することが報告されており、ガラクトースはASGPRに対してより高い親和性を示しました[18]。 ASGPRは肝実質細胞の表面に強く露出しているため[19]、受容体はガラクトースおよびガラクトシル化プロドラッグまたは肝臓を標的とする送達システムに対して強い親和性を持っています。ガラクトースナノ粒子[20]、ガラクトースミセル[21]、およびガラクトースリポソーム[22]は、肝細胞カルチノイド細胞を特異的に標的とする肝標的化薬物システムとして同定されています。

金ナノロッド（GNR）は棒状の金ナノ粒子であり、ナノキャリアとして大きな利点があります[23]。金ナノロッド（GNR）は優れた生体適合性を備えており、siRNAの安定した送達に使用できます[24]。それらは大きな比表面積を持っており、特定の腫瘍標的アダプターの柔軟な変更を可能にします[25]。局在表面プラズモン共鳴（LSPR）は、近赤外光照射下での光熱変換効率が高く、優れた光熱抗腫瘍材料になっています[26]。金ナノロッド（GNR）のアスペクト比を調整することで、最大の光熱効率を実現できます。金ナノ粒子のinvitroおよびinvivo毒性は、それらのサイズ、表面電荷、および表面コーティングに依存します[27]。ただし、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）は、金ナノロッドの合成に不可欠な活性剤であり、明らかな細胞毒性があり、生物学的用途を制限します[28]。

RNA干渉（RNAi）は、低分子干渉RNA（siRNA）によって標的遺伝子を効果的にノックアウトまたはサイレンシングするため、癌治療への有望なアプローチになっています[29]。最近、siRNA分子はヒトの治験段階に入り、複数の変異遺伝子の癌や腫瘍を治療する有望な方法であると考えられています[30]。しかし、siRNAの適用は、血清の不安定性（細胞外環境でのヌクレアーゼによる分解）やオフターゲット効果などの大きな課題に依然として直面しています[31]。さらに、siRNAは負に帯電しているため、負に帯電した細胞膜に結合することはできません[32]。これらの特性のため、siRNA自体が細胞に直接送達される可能性は低いです。 siRNAの安定性は、siRNAを化学修飾するか、siRNAローダーを保護担体材料に挿入することで改善できます[33]。

本研究では、多機能ナノキャリアGAL-GNR-siBRAFを新たに構築しました。このシステムは、内部コアとして光学的発熱能力を備えた金ナノロッドと、肝腫瘍を特異的に標的とする外部修飾GAL（d-ガラクトース）を使用しています。このシステムは、金ナノロッドの表面でのCTABの生物学的毒性を低減し、高いsiRNA負荷容量を示し、肝臓癌のBRAF遺伝子を効果的にサイレンシングするために使用できます。 GAL-GNR-siBRAFの適用は、肝癌細胞の増殖、浸潤、および遊走を大幅に弱めました。さらに、GAL-GNR-siBRAFは、BRAFの遺伝子サイレンシングと光熱効果を同時に誘導し、腫瘍細胞の殺傷能力において相乗効果を達成し、肝臓がんの臨床治療の開発に新しい考え方を提供しました。

材料と方法

細胞株

マウス肝細胞癌細胞株Hepa1-6は、中国科学院の幹細胞バンクから購入しました。細胞は、5％CO ₂ を含む37°Cで10％FBSを含むDMEM培地（Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド）で培養されました。 。

BRAFsiRNAの合成

BRAF遺伝子を標的とするsiRNAの配列は5'-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3 'であり、Dharmacon、Inc。（Lafayette、CO、USA）によって合成されました。市販の標的ルシフェラーゼ遺伝子siGL2をネガティブコントロールsiRNAとして使用しました。

CTAB-GNRの合成

水溶性の金ナノロッドは、シードを介した成長経路を使用して合成されました[34]。シード溶液は次のように製造されました。1mLの臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）（0.2 M）（Sinopharm）を1mLのHAuCl <と穏やかに混合しました。 sub> 4 （0.5 mM）（シノファーム）。溶液を28°Cで攪拌し、完全に混合し、0.12mLの冷NaBH ₄ を加えました。 （0.01 M）（Sinopharm）得られたシード溶液が茶色になり、予備のままになるまで。次に、成長溶液を次のように合成しました：50 mLのCTAB（0.2 M）と50mLのHAuCl ₄ （1 mM）、2.5 mL AgNO ₃ （4 mM）（Sinopharm）を28°Cで軽く混合しました。十分に穏やかに混合した後、溶液の色が濃い黄色から無色に変わるときに、670μLのアスコルビン酸（0.079 M）を加えました。 28℃で穏やかに攪拌しながら120マイクロリットルのシード溶液を加えると、色は徐々に紫から紫黒に透明になりました。一定温度で24時間撹拌した後、溶液を12,000 rpmで10分間遠心分離して、追加のCTABを除去し、将来の使用のためにGNR粉末に真空凍結乾燥しました。

MUA-PEIとGAL-PEI-MUAの合成

メルカプトウンデカン酸（MUA; 654 mg）を30 mLのクロロホルム（CHCl ₃ ）に溶解しました。 ）次に、100ミリモルの1-エチル-3- [3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）および100ミリモルのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）と室温で15分間インキュベートします。次に、100 mmolのポリエチレンイミン（PEI）を上記の溶液に加えた。室温で24時間反応させた後、等量の脱イオン水を使用して水溶性PEI-MUAを抽出しました。同じ方法を使用して、水溶液中のd-ガラクトースの活性化を完了しました。次に、上記の水溶性PEI-MUA溶液に過剰の活性化d-ガラクトース（500 mmol）を加え、室温で24時間十分に反応させて水溶性GAL-PEI-MUAを得た。複雑です。

GAL-PEI-MUA-GNR（GAL-GNR）およびPEI-MUA-GNR（PEI-GNR）の合成

凍結乾燥したCTAB-GNR粉末（10 mg）を10mLの水溶性PEI-MUAまたはGAL-PEI-MUA複合体に懸濁しました。室温で24時間撹拌すると、CTABはAu–S結合に置き換わりました。溶液を12,000rpmで15分間遠心分離して過剰な上清を除去し、沈殿物を蒸留水で3回洗浄した。 PEI-GNRまたはGAL-GNR粉末は、凍結乾燥によって調製され、秤量され、非リボザイム水に溶解された後、多機能酵素アナライザー（Spectra Max M5e、MD、USA）によって血漿共鳴効果が観察されました。

透過型電子顕微鏡

GNRまたはGAL-GNRを蒸留水に懸濁し、再懸濁物を銅グリッド上に配置しました。銅メッシュ上のサンプルを空気中で30分間完全に乾燥させた後、透過型電子顕微鏡（LIBRA 120、Carl Zeiss、ドイツ）を使用して銅メッシュを画像化しました。

紫外可視分析

GNR、PEI-GNR、またはGAL-GNRを蒸留水に懸濁しました。多機能マイクロプレートリーダー（SpectraMax M5e、MD、USA）を使用して、600〜900nmの波長範囲のナノ材料の表面プラズモン共鳴効果を調べました。

ゼータ電位および流体力学的直径分析

GNR、PEI-GNR、またはGAL-GNRを蒸留水に懸濁し、ゼータ電位とナノ材料の流体力学的直径をZetasizer NanoZSで測定しました。

核磁気共鳴分析

GAL-GNR凍結乾燥粉末を重水（99％、Sigma）に溶解して均一な懸濁液を作成し、次に懸濁液をNMRサンプルチューブに移しました。 GAL-GNRの組成は、核磁気共鳴（NMR）（Bruker、600mhz、ドイツ）によって決定されました。

ゲルシフトアッセイ

GAL-GNRとsiBRAFは、質量比（0：1、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1）に従って混合されました。室温で30分間インキュベートした後、DNAローディングバッファーを混合物に加えました。すべてのサンプルを0.01％Goldview（Bioshop、USA）を含む2％アガロースゲルに加え、90Vで30分間電気泳動しました。 siBRAFのラッピングの程度は、ゲルイメージングシステムで視覚化されました。

血清中のsiRNAの安定性

GAL-GNR-siBRAF（6：1）の混合物を、新鮮なマウス血清中で37°Cでそれぞれ0時間、3時間、6時間、12時間、24時間、および48時間インキュベートしました。裸のsiBRAFと新鮮なマウス血清群を同じ条件下で処理した。等量の2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）をGAL-GNR-siBRAF溶液に加えました。室温で30分間インキュベートした後、DNAローディングバッファーを添加し、すべてのサンプルを2％アガロースゲル（0.02％Goldview（Bioshop、USA）を含む）にロードし、90Vで30分間電気泳動しました。 siBRAFのストリップの明るさは、ゲルイメージングシステムで視覚化されました。

GAL-GNR-siBRAFの競合阻害アッセイ

2×10 ⁵ Hepa1-6細胞を12ウェルマイクロプレートで一晩培養しました。次に、細胞をラクトビオン酸で12時間前処理し、GAL-GNR--siBRAF（Cy3標識）で30分間トランスフェクトしました。細胞内蛍光強度は、蛍光顕微鏡（スケールバー=200μm）によって決定されました。

GAL-GNR-siBRAFの肝臓がんを標的とした送達能力

1マイクログラムのcy3ラベル付きsiBRAFをPEI-GNR（30μg/ mL）、GAL-GNR（30μg/ mL）と室温で20分間インキュベートし、Hepa1-6細胞の培地に添加しました。 30分間のインキュベーション後、細胞を50％FBSで3回洗浄し、細胞内の蛍光強度を蛍光顕微鏡で測定しました。

光熱効果

20、40、60、80、および100μgのGAL-GNRと100μgのGNR凍結乾燥粉末を1mLの蒸留水に完全に溶解しました。溶液を24ウェルプレートに加え、803 nmの近赤外レーザー光源（2 W / cm ² ）を連続的に照射しました。 ）15分間。各グループの温度は、最初の5分間は0.5分ごとに赤外線温度計で記録され、その後、1分ごとに温度がマークされました。

MTTアッセイ

200マイクロリットルの細胞（3.5×10 ⁴ / mL）を96ウェルマイクロプレートで24時間培養した後、さまざまな濃度のGNRまたはGAL-GNR（0、15、30、45、60、75、90、105、120μg / mL）で培養しました。 24時間または48時間のインキュベーション後、20μLのMTTを培養システムに添加し、さらに4時間インキュベートしました。紫色の結晶を150μLのDMSOに溶解した後、マイクロプレートリーダー（SpectraMax M5e、MD、USA）で650nmのリファレンスを使用して490nmで分光光度分析を行いました。

カルセイン-AMおよびPI染色テスト

Hepa1-6セル（1.5×10 ⁵ ）を12ウェルプレートに一晩保持し、PBS、レーザー、GAL-GNR-siBRAF（30μg/ mL：1μg）、GAL-GNR-siGL2（30μg/ mL：1μg）+レーザーまたはGALで処理しました。 -GNR-siBRAF（30μg/ mL：1μg）+レーザーを4時間照射した後、近赤外光（808 nm、2 W / cm ² ）を照射 ）15分間。 GAL-GNRの細胞毒性は、カルセイン-AM（生細胞）およびPI（死細胞）染色実験によって検出されました。カルセイン-AMの緑色蛍光とPIの赤色蛍光を蛍光顕微鏡で撮影しました。

リアルタイム定量PCR

全細胞RNAはTrizol（Trizol試薬、Invitrogen）を使用して抽出され、cDNA合成のテンプレートとして使用されました。 Q-PCRは、Stratagene Mx3000P qRT-PCRシステム（Agilent Technologies、マサチューセッツ州レキシントン、米国）で遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマー（それぞれ0.5μL×10μM）を使用して実施しました。 SYBRグリーンPCRMasterMix（Life Technologies）は、メーカーのスキームに従って使用されました。ハウスキーピング遺伝子β-アクチンを内部参照として使用しました。プライマー配列はβ-アクチンであった：5'AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3 '（順方向）および5'ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'（逆方向）。 BRAF：5'-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3 '（順方向）および5'-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3'（逆方向）。遺伝子発現の差は、2 ^−∆∆Ct によって計算され、表示されました。 メソッド。

ウエスタンブロット

Hepa1-6細胞の総タンパク質は、RIPAバッファー（Cell Signaling、Pickering、Ontario、Canada）によって取得され、ビシンコニン酸（BCA）によって定量化されました。タンパク質を12％SDS-PAGEで分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）に転写しました。ハウスキーピング遺伝子β-アクチンは、BRAFタンパク質の発現を検出するための内部参照として使用されました。タンパク質バンドと標的タンパク質の内部参照は、ECL化学発光によって検出されました。

スクラッチテスト

トランスフェクトされたHepa1-6（1.7×10 ⁵ / mL）細胞を12ウェルプレートに一晩播種しました。プレートに完全に付着した細胞を10μLのピペットチップで引っ掻いた。細胞をPBSで2回洗浄し、2％FBSを含む培地と交換しました。創傷線の平均は、0、24、および48時間後に顕微鏡で観察されました。各スクラッチテストは3回実行されました。

移行と侵入のトランスウェルアッセイ

8マイクロメートルのトランスウェルチャンバー（Corning Life Science）を使用して、細胞の遊走と浸潤を評価しました。 200μLの無血清培地に懸濁したHepa1-6を、1.7×10 ⁵ の密度で上部チャンバーに添加しました。 mL細胞/ウェル、次に12％FBSを含む500μLの培地を下部チャンバーに加えました。 24〜48時間のインキュベーション後、細胞を4％パラホルムアルデヒド溶液で30分間固定し、次に細胞を1％クリスタルバイオレット溶液で30分間染色しました。最後に、細胞を倒立顕微鏡下で写真撮影し、カウントした。細胞浸潤アッセイの場合、細胞浸潤実験にはECMゲルコーティングが必要であり、残りのステップは一貫しています。

統計

すべての実験は3回行った。データは平均±SDおよび学生の t として表されました 2つの方法の違いを判断するためのテスト（両側）。複数のグループの比較には、一元配置分散分析を使用しました。データは p で統計的に有意であると見なされました <0.05（* p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001）。

結果

ナノキャリアGAL-GNR-siBRAFの合成と特性評価

低分子干渉RNA（siRNA）を肝細胞に送達し、同時に金ナノロッドの光熱効果を維持できる新しいナノキャリアGAL-GNRを設計しました。 GAL-GNRの合成手順をスキーム1に示します。この肝臓を標的としたシステムには、3つの機能コンポーネントが含まれています。まず、GAL-GNRの基本部分はGNR骨格であり、TEM画像（図1a）に示すように、長さ約30 nm、直径10 nmであり、化学的に結合したGNR（GAL-GNR）は有意ではありませんでした。寸法変化があり、依然として十分な分散性を持っていました（図1b）。粒子サイズのデータ​​は、GNRの平均サイズが30.23 nmであり、これは電子顕微鏡の結果と一致しており、GAL-GNR（50 nm）およびPEI-GNR（42.35 nm）のサイズはGNRよりも大きいことを示しています。 GALとPEIの結合により、粒子間の水和が増加しました（図1c）。第二に、GNRの表面にある生物学的に毒性のあるCTABは、負に帯電したsiRNAをロードできる正に帯電したMUA-PEIに置き換えられました。ゼータ電位測定は、GNRがPEIまたはGAL-PEIでそれぞれ修飾された場合、GNRの表面電荷が35.6から42.7mVまたは41.8mVに増加することを示し、GAL-GNRがsiRNAに結合する強い能力を持っていることを示しています（図1d）。第三に、肝細胞癌の特定のホーミングに使用できるGNRナノキャリアを結合するためのガイド分子としてGALを適用しました。 UV-Vis吸収分光法を使用して、修飾されたGNRの構造を事前に検出しました。未修飾GNRの初期吸収スペクトル波長は763nmでした。波長の7nmのシフトは、MUA-PEIの変更で最初に観察され、GALによるGNRの変更が成功したとき、合成の最後に8 nmの別のシフトが観察されました（図1e）。ナノシステムでGALを確認するために、NMR画像を使用して化学基を分析しました。結果は、ガラクトースのHシグナルが、NMR水素スペクトルのGAL-GNRスペクトルでのみ検出されたことを示しています。これは、δ：3.60、3.65、3.70、3.78、3.90、4.53でした。 NMRスペクトルにより、GALの化学構造が確認されました。GALは​​GNR表面にうまく結合しました（図1f）。

GAL-GNR合成手順。 a MUA-PEIの合成プロセス。 b d-ガラクトースの活性化とMUA-PEIとの化学反応。 c GAL-GNRの最終合成製品

GNRおよびGAL-GNRの特性評価。 a GNRのTEM顕微鏡写真（スケール=0.5μm/ 50 nm）。 b GAL-GNRのTEM顕微鏡写真（スケール=0.5μm/ 50 nm）。 c さまざまな修正GNRの粒子サイズ分析。 d さまざまな修正GNR（GAL-GNR）のゼータ電位分析。 e さまざまな修飾GNRと水の正規化されたUV-Vis吸収スペクトル。 f GAL-GNRのNMR吸光度スペクトル

GAL-GNRのsiRNAカプセル化能力と安定性

GAL-GNRナノスケルトンは、正に帯電したPEIによって修飾されており、静電相互作用によって負に帯電したsiRNAと組み合わせることができます。ゲルシフトアッセイを使用して、GAL-GNRのsiRNA結合能力を評価しました。遊離のsiRNAは、結合したsiRNAの速度が低下するか、完全に停止する間、ゲルの通路に沿って移動する可能性があります。さらに、結合したsiRNAは臭化物に効果的に結合しなくなるため、それに応じて蛍光強度が低下します。ゲル電気泳動の結果は、GAL-GNRをsiBRAFで飽和させるための最適な比率が6：​​1（w / w）であることを示しました（図2a）。

ゲルシフトアッセイ。 a GAL-GNRのsiRNA負荷容量。 1マイクログラムのsiRNAを、GAL-GNRの質量比が異な​​る等量で混合しました。 30分間のインキュベーション後、ゲル移動アッセイを使用して、GAL-GNRのsiRNA負荷容量を評価しました。 b マウス血清中のsiRNAの安定性。 1マイクログラムのBARFsiRNAに1：6の質量比でGAL-GNRを接種し、続いて新鮮なマウス血清に添加しました。 37°Cで0、3、6、12、24、および48時間反応させた後、GAL-GNR-siBARFからのsiRNAを2％SDSで抽出し、エチジウムブロマイドで可視化しました

裸のsiRNAは、特にinvivoで非常に分解性があります。デリバリーシステムの重要な機能は、siRNAを分解から保護することです。したがって、結果として、新鮮な血清中のsiRNAに対するナノキャリアGAL-GNRの保護効果をテストしました。裸のsiRNAと比較して、結合したsiRNAは血清中に長期間保存されました。図2bに示すように、裸のsiRNAは最大12時間血清中に存在する可能性がありますが、結合したsiRNAは48時間後もまだ豊富です。この結果は、GAL-GNRが血清中でのsiRNAの分解を効果的に防ぎ、invivoでの標的化送達を確実にすることができることを示しました。

ナノマテリアルの細胞毒性

生物学的毒性が低いことは、ナノマテリアルのもう1つの重要な特性であり、癌治療での使用を可能にします。この新しいGAL-GNRナノ構造の生体適合性を評価するために、その細胞毒性をテストしました。図3に示すように、未修飾のGNR処理群のHepa1-6の死細胞は、最初は30μg/ mLの低濃度で観察されました。 75μg/ mLのGNRと24時間インキュベーションした後、細胞死率は最大56.09％であり、48時間のインキュベーション後の死亡率は75.5％に増加しました。それどころか、GAL修飾は細胞毒性を大幅に減少させました。 GAL-GNRを48時間インキュベートした後、80％以上の細胞が高濃度（105μg/ mL）でもまだ生きていました。これらのデータは、ナノキャリアGAL-GNRがGNRと比較して高い生体適合性を持ち、アプリケーションの安全性を確保していることを示唆しています。

GAL-GNRの毒性。 Hepa1-6細胞は、GNR（CTAB-GNR）またはGAL-GNRで、示された濃度で24時間または48時間処理されました。細胞生存率はMTTアッセイ（ n =5）

肝細胞癌細胞-siRNAの標的化送達とBRAFのinvitroでの遺伝子サイレンシング

siRNAを癌細胞に送達する能力は、ナノ材料の最も重要な機能の1つです。 siRNAデリバリーにおけるGAL-GNRの可能性を調査するために、Hepa1-6細胞でGAL-GNRによってロードされたsiBRAFを使用して遺伝子サイレンシングの有効性を検出しました。ブランクグループと比較して、GAL-GNR-siGL2（ネガティブコントロール）をトランスフェクトした細胞でのBRAFの発現は変化しませんが、GAL-GNR-siBRAFをトランスフェクトした細胞では有意な減少が見られました（図4a）。さらに、サイレンシング効果は用量依存的であり、これはGAL-GNR濃度の増加と相関している。 qPCRの結果は、GAL-GNR-siBRAFの理想的なトランスフェクト濃度が30μg/ mLであり、サイレンシング効率が90.29％に達する可能性があることを示しています。これは、リポフェクタミン2000のグループ（ポジティブコントロール）と同様です。ウエスタンブロットの結果はqPCRと一致しており、BRAFのタンパク質発現は48時間のトランスフェクション後にダウンレギュレーションされました（図4b）。

invitroでの肝細胞癌細胞を標的としたsiRNAの送達およびBRAFの遺伝子サイレンシング。 a GAL-GNR-siBRAFトランスフェクション後のBRAF発現のmRNA。 Hepa1-6細胞に、同量のBRAF siRNA（1μg）を含むさまざまな濃度のGA-GNRを24時間トランスフェクトしました。 BRAFmRNAの発現はqPCRによって決定されました。エラーバーは、3つの実験の標準偏差を表します（*** p <0.001）。 b GAL-GNR-siBRAFトランスフェクション後のHepa1-6におけるBRAFのタンパク質発現。 Hepa1-6細胞にGAL-GNR-siBRAF、GAL-GNR-siGL2、またはPBSを48時間トランスフェクトし、BRAFおよびβ-アクチンのレベルをウエスタンブロットで測定しました。 c および d GAL-GNR-siBRAFの肝臓がんを標的とした送達能力。 1マイクログラムのcy3ラベル付きsiBRAFを、lip2000、PEI-GNR（30μg/ mL）、GAL-GNR（30μg/ mL）と室温で20分間インキュベートし、Hepa1-6細胞の培地に添加しました。競合阻害アッセイでは、Hepa1-6細胞をラクトビオン酸で一晩前処理しました。細胞内蛍光強度を蛍光顕微鏡（スケールバー=200μm）で観察し、BRAFのmRNA発現をq-PCRで定量しました。エラーバーは、3つの実験の標準偏差を表します（* p <0.05）

ラクトビオン酸は、肝細胞癌細胞膜の表面に発現するアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）と競合的に組み合わせることができる構造においてGALに類似しています[35]。 GAL-GNRの特異的なターゲティング効率を確認するために、Hepa1-6細胞をラクトビオン酸とプレインキュベートし、GAL-GNR-siBRAFでトランスフェクトしました。未処理の細胞をブランクコントロールとして使用し、古典的なトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン2000をポジティブコントロールとして使用しました。図4cに示すように、GAL-GNRをトランスフェクトした細胞の赤色蛍光強度は陽性対照群と同様でしたが、PEI-GNRをトランスフェクトした細胞の蛍光強度は大幅に低下しています。一方、GAL-GNR-siBRAFのみでトランスフェクトされた細胞は、ラクトビオン酸で前処理されたHepa1-6細胞よりもCy3の強い赤色蛍光が観察され（図4c）、qPCRの結果は赤色蛍光の結果と一致していました（図4c）。図4d）。これらの結果は、GALがHepa1-6細胞によるsiRNAのエンドサイトーシスを効果的に促進し、HCCの標的部分として適用できることをさらに示しています。

Hepa1-6細胞の増殖、移動、および浸潤に対するGAL-GNR-siBRAFの影響

BRAFはMAPK経路で重要な役割を果たしており、MAPK経路は細胞の増殖、遊走、浸潤の調節に関与しています[36]。肝細胞癌細胞に対するGAL-GNR-siBRAFの影響を評価するために、最初にMTTアッセイによって細胞増殖を分析しました。図5aに示すように、GAL-GNR-siBRAFをトランスフェクトしたhepa1-6細胞の増殖は、GAL-GNR-siGL2（ネガティブコントロール）またはPBS処理細胞と比較して有意に減少しました。次に、スクラッチおよびトランスウェルアッセイにより、細胞遊走に対するGAL-GNR-siBRAFの効果を調査しました。ネガティブコントロール細胞と比較して、GAL-GNR-siBRAFでトランスフェクトされたHepa1-6細胞の遊走能力は明らかに低下しました（図5b–d）。

GAL-GNR-siBRAFによるHepa1-6細胞に対するBRAF遺伝子のサイレンシングの影響。 a Hepa1-6細胞の増殖。 Hepa1-6細胞にGAL-GNR-siBRAF、GAL-GNR-siGL2、またはPBSをトランスフェクトし、細胞増殖をMTTアッセイで測定しました（ n =5）。エラーバーは、3つの実験の標準偏差を表します（* p <0.05）。 b Hepa1-6セルのスクラッチテスト。 Hepa1-6細胞を上記のように24時間トランスフェクトし、10μLのチップでこすり落としました。細胞の引っかき傷の画像は、さまざまな時点で撮影されました（スケールバー=200μm）。 c および e Hepa1-6細胞の移動と浸潤。上記のように、Hepa1-6細胞を24時間トランスフェクトしました。細胞の遊走および浸潤能力はトランスウェルアッセイによって決定され、さまざまな時点で想像されました（スケールバー=200μm）。 d および f 細胞移動と浸潤能の柱状統計分析（*** p <0.001）

浸潤に対するGAL-GNR-siBRAFの可能性をさらに調査するために、トランスウェルアッセイを実施しました。結果は、GAL-GNR-siBRAFでトランスフェクトされたhepa1-6細胞が、GAL-GNR-siGL2またはPBSと比較して、Hepal-6の浸潤を有意に減少させたことを示しました（図5eおよびf）。上記の結果は、GAL-GNR-siBRAF複合体を使用したBRAF遺伝子のノックダウンにより、肝細胞癌細胞の遊走と浸潤を効果的に低減できることを示唆しています。

GAL-GNR-siBRAFの光熱効果と遺伝子サイレンシングとの併用治療

私たちの以前の研究は、金ナノ材料が近赤外線の下で熱エネルギーを生成できることを示しました[37]。この現象は、GNRのLSPR特性により、光熱効果と呼ばれます。我々の結果は、GAL-GNR濃度の増加に伴い、GAL-GNRの熱生成能力が向上することを示した。 GAL-GNRの濃度が100μg/ mLの場合、温度は24°Cから60°C以上に急速に上昇します。さらに、GNRとGAL-GNRの間で熱生産能力に有意差はありませんでした（図6a）。

GAL-GNRによって誘発される光熱効果と、肝臓癌細胞に対する光熱効果と遺伝子サイレンシングの併用治療。 a 803 nm近赤外レーザー光源（2 W / cm ² ）を使用して、GNR、GAL-GNR、または蒸留水（ブランクコントロール）の溶液を15分間照射しました。温度は、さまざまな時点で赤外線温度計によって検出されました。 b Hepa1-6細胞は、それぞれPBS、レーザー、GAL-GNR-siBRAF、GAL-GNR-siGL2 +レーザー、またはGAL-GNR-siBRAF +レーザーで処理されました。カルセインAM（生細胞）の緑色蛍光とPI（死細胞）の赤色蛍光が蛍光顕微鏡で観察されました

新規ナノシステムGAL-GNR-siBRAFは、肝臓がんの特異的ターゲティング、BRAFのsiRNAベースの遺伝子サイレンシング、およびGNRが提供する光熱効果という3つの個別の特徴を備えています。したがって、本発明者らは、抗腫瘍治療におけるGAL-GNR-siBRAFの相乗的治療効果をさらに研究する。 GAL-GNRのないHepa1-6細胞は、近赤外線の下でも高い生存率を維持し、レーザー自体が腫瘍細胞に有意な影響を及ぼさなかったことを示唆しています。 GAL-GNR-siGL2処理に基づいてレーザー照射を行うと、光熱効果はHepa1-6細胞に対して強力な殺傷能力を示しました。 BRAF遺伝子サイレンシングだけで細胞死が誘発されましたが、その効果は決定的なものではありませんでした。ナノ材料GAL-GNR-siGL2とレーザー照射による細胞の処理は、BRAF遺伝子サイレンシング個体よりもはるかに強力な細胞殺傷能力をもたらしました（図6b）。これらのデータは、BRAF遺伝子サイレンシングと光熱効果が相乗的に腫瘍細胞を殺す可能性を高めることができることを示しています。

ディスカッション

腫瘍を標的とした送達の難しさは、腫瘍の臨床治療における主要な障害です。この研究は、私たちが新しい多機能ナノキャリアGAL-GNR-siBRAFを開発したことを初めて示し、多くの利点がありました。改変GAL-GNRは、優れた生体適合性を備えているだけでなく、GNR骨格のLSPR現象を維持し、優れた光熱変換能力を備えています。 GALで修飾されたGNRは、ASGPRを介して肝細胞癌細胞をホーム化することができます。これは、肝細胞癌の標的分子治療に大きな可能性を秘めています。さらなる研究により、BRAF遺伝子サイレンシングが肝細胞癌細胞の増殖、遊走、および浸潤を阻害することが示されました。 GAL-GNR-siBRAFは、BRAFの光熱効果と遺伝子サイレンシングの組み合わせでより強力な細胞殺傷能力を示すことは注目に値します。

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子の発現と調節における重要な役割のために多くの注目を集めています。遺伝子治療のために癌細胞の配列特異的遺伝子をノックダウンするためにsiRNAを使用することは、効果的かつ特異的な標的遺伝子治療であり、癌を含む多くの疾患の新しい治療ツールになりました[29、31]。しかし、血清中の安定性が低く、細胞への取り込みが不十分なため、臨床応用におけるsiRNAが制限されます[38]。一方、siRNAは負に帯電した細胞膜に結合するのを妨げる負の電荷を持っており、siRNA自体が細胞に直接送達される可能性は低いです[32、39]。さらに、siRNA療法におけるトランスフェクション効率の低さと細胞内在化の低下に関連する問題があります[40]。これらの障壁は、標的細胞へのsiRNAの送達を妨げます。 siRNAの安定性を高め、遺伝子サイレンシングの有効性を強化するために、3つのコンポーネントを含む新しいナノキャリアGAL-GNR-siBRAFを合成しました（スキーム1）。このナノキャリアは、分子サイズが小さく（経度約30 nm、直径10 nm）、分散性に優れています（図1）。さらに、GAL-GNR-siBRAFは、低濃度で大量のsiRNAを効果的にロードし（図2a）、血清中のRNaseからsiRNAの分解を保護することができます。 siRNAは、新鮮なマウス血清の存在下、37°C​​で少なくとも2日間の安定性によって証明されました（図2b）。

生体適合性は、生物療法の分野で使用されるナノ材料にとって不可欠です。 CTABは、その生物学的用途を制限する明らかな細胞毒性を持っていますが、金ナノロッドの合成に不可欠な活性試薬です[41]。材料の細胞毒性を低減するために、正電荷PEIの外部修飾とターゲティングアダプターGAL（d-ガラクトース）によってGNRを操作しました。我々の結果は、機能化されていないGNRと比較して、GAL修飾GNRの生体適合性が優れていることを示しています。細胞生存率は、非常に高濃度（105μg/ mL）のGAL-GNRでも48時間80％以上維持されました（図3）。さらに、ナノロッドの小分子サイズと円筒形は、細胞膜を通過して細胞に浸透するのを容易にします[37、38、42]。この現象は、癌細胞の標的療法で特に顕著です。ガラクトースを標的とする部分で修飾されたナノコンストラクトは、腫瘍細胞にGAL-GNR-siBRAFを大量に蓄積させ、BRAF遺伝子発現の効果的なダウンレギュレーションを誘導しました（図4）。さらに、競合阻害実験によれば、GAL-GNRは主にHepa1-6細胞のASGPR表面受容体を介して細胞に侵入することがわかりました（図4c）。

BRAFおよびRAF1の発現が高いHCCは、急速な増殖と成長を示す傾向があることが報告されています[41、43、44]。 B-RafとRaf1は、主にERK / MAPK経路の下流で作用し、カスケード増幅を介して核内因子を調節します。この経路の活性化は、HCC細胞の増殖と分化を異常に加速します[41、44、45]。 RAF遺伝子は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）の発現を促進することもできます。これにより、腫瘍細胞の接着が変化し、細胞外マトリックス（ECM）と基底膜が分解され、腫瘍の浸潤と転移が促進されます[44、45]。 BRAFキナーゼはRAS-RAF-MEK-ERK経路を調節し、腫瘍細胞の増殖、浸潤、転移を促進し、アポトーシスによる細胞死を可能にします[5、46、47]。以前の研究では、BRAF遺伝子がHepa1-6細胞で高度に発現していることを発見しました（データは示していません）。 Hepa1-6でのBRAF発現のノックダウンは、RAS-RAF-MEK-ERK経路をブロックし、Hepa1-6の生物学的変化を導くと推測されています。仮説を検証するために、肝細胞癌細胞にGAL-GNR-siBRAFをトランスフェクトし、細胞増殖、遊走、浸潤を大幅に抑制できることを発見し（図5）、肝細胞癌の臨床治療のための新しい戦略を提供します。

GNRのもう1つの重要な利点は、局所表面プラズモン共鳴（LSPR）を備えていることです。これにより、吸収された光エネルギーを近赤外光照射下で熱エネルギーに変換し、細胞を殺して破壊することができます[42]。次に、GAL-GNRの光から熱への変換能力を調べた結果、修正されたGAL-GNRは、近赤外光の照射下で効果的に熱エネルギーを誘導できることが示されました（図6a）。次に、GAL-GNR-siBRAFの相乗効果をさらに調査しました。 BRAF遺伝子サイレンシングは限られた細胞毒性を示しましたが、GAL-GNR-siGL2 +レーザーの治療は、腫瘍細胞に対してはるかに強力な殺傷能力を示しました。同時に、光熱温熱療法とBRAF遺伝子サイレンシングの組み合わせは、85％以上の細胞死を引き起こす可能性があり（図6b）、GAL-GNR-siBRAFと光熱効果の相乗効果が肝臓癌を抑制する理想的な戦略である可能性があることを示しています。

結論

この研究は、GAL-GNR-siBRAFがsiRNA分解の障害を克服し、invitroでの血清中のsiRNAの安定性を効果的に高めることを示しました。さらに、GAL-GNR-siBRAFは、肝細胞癌細胞へのsiRNAの送達を標的とし、BRAFの発現をノックダウンし、細胞の増殖、浸潤、および遊走を大幅に阻害することができます。さらに重要なことに、GAL-GNR-siBRAFは、新しい多機能ナノキャリアとして、近赤外光と組み合わせると腫瘍細胞を殺す能力を大幅に向上させることができます。結論として、GAL-GNR-siBRAFは肝細胞癌の治療に大きな可能性を秘めており、肝癌の臨床応用のための新しいアイデアを提供します。

データと資料の可用性

この調査で生成されたすべてのデータと使用された資料は、原稿と対応する追加フ​​ァイルに含まれています。

略語

GAL：

d-ガラクトース

GNR：

ゴールデンナノロッド

siBRAF：

BRAFに特異的な低分子干渉RNA

HCC：

肝細胞がん

ASGPR：

アシアロ糖タンパク質受容体

TACE：

経カテーテル動脈化学塞栓療法

LSPR：

局在表面プラズモン共鳴

CTAB：

セチルトリメチルアンモニウムブロミド

MUA：

メルカプトウンデカン酸

EDC：

1-エチル-3- [3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩

NHS：

N-ヒドロキシスクシンイミド

PEI：

ポリエチレンイミン

TEM：

透過型電子顕微鏡

NMR：

核磁気共鳴

FBS：

ウシ胎児血清

DMSO：

ジメチルスルホキシド

BCA：

ビシンコニン酸

PVDF：

ポリフッ化ビニリデン