過酸化水素の高感度で選択的な無酵素バイオアナリシス用に設計された顕著な電極触媒活性を持つリン化コバルト（Co2P）

要約

この作業では、リン化コバルトナノ粒子（Co ₂ P NP）は、有害なリン源を使用せずに、単純で穏やかな水熱法によって調製されました。 Co ₂の形態構造と表面成分 Pは、透過型電子顕微鏡法、X線回折およびX線光電子分光測定によって特徴づけられました。遷移金属リン化物の優れた電極触媒還元活性と優れた電気伝導性を考慮して、Co ₂を製造しました。インジウムスズ酸化物（ITO）基板上のP NP（Co ₂ P / ITO）for H ₂ O ₂ 検出。 Co ₂ P / ITOトランスデューサは、5秒未満の高速アンペロメトリー応答、0.001〜10.0 mMのより広い応答範囲、および0.65μMの低い検出限界を示しました。さらに、非酵素的Co ₂ P / ITOセンサーは、卓越した選択性、再現性、再現性、安定性を示し、これらすべてがCo ₂に適合しました。 H ₂用の非常に信頼性が高く有望なバイオセンサー用のP / ITO電極 O ₂ センシング。

はじめに

過酸化水素（H ₂ O ₂ ）は生物の代表的な活性酸素種であり、正常な生理機能に重要な役割を果たしています[1]。 H ₂の濃度 O ₂ 生細胞における細胞の生理学的バランスと密接に関連しています[2]。癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびいくつかの重篤な疾患は、H ₂の異常な濃度によって引き起こされる可能性があるという多くの研究も報告されています。 O ₂ [3,4,5]。 H ₂の濃度を検出するための、正確、高感度、迅速かつ選択的な方法の開発 O ₂ 、通常の酸化ストレスバイオマーカーは、間違いなく早期診断に有益です。これまで、分光法[6]、測色法[7]、蛍光法[8、9]、電気化学法[10,11,12]などの多くの分析法がH ₂に適用されてきました。 O ₂ 決定。電気化学的方法、特にアンペロメトリー試験は、H ₂の最も簡単で効果的な検出方法の1つになりつつあります。 O ₂ 高感度、卓越した選択性、低コストなどの利点により、さまざまなセンシング方法の中で生物学的分析を行います。

酵素電気化学センサーは、H ₂を検出するための効果的な機器であることが証明されています。 O ₂ 。ただし、酵素ベースのセンサーの大規模な実用化は、複雑な固定化、環境の不安定性、および再現性の低さによって制限されます。したがって、非酵素的電気化学H ₂を開発する O ₂ センサーは非常に不可欠です。

近年、貴金属[13,14,15]、非貴金属およびそれらに対応する化合物[16,17,18,19]または炭素材料[20、21]に基づくセンサーがますます多く使用されています。電気化学的H ₂ O ₂ 検出。非酵素的バイオセンサーを製造するための電気化学的活物質として、遷移金属化合物がますます関心を集めている。遷移金属リン化物（TMP）は、優れた電極触媒活性、優れた導電性、および多くの優れた特性を備えた、新しく開発された材料のクラスです。したがって、それらは、水分解[22、23]、水素化脱硫[24]、およびスーパーキャパシタ電極[25]での用途について広く研究されてきました。最近の調査によると、CoP、Ni ₂ PおよびCu ₃ P [26,27,28]は、非酵素的H ₂の効率的な電極触媒としても使用できます。 O ₂ 検出。しかし、バイオアナリシスにおけるTMPの応用に関する研究の数は、今日でも限られています。さらに、トリフェニルホスフィン[29、30]、白リン[31、32]、またはその他の環境に有害なリン源[33]を使用すると、TMPの準備におけるオペレーショナルリスクが高まる可能性があります。したがって、TMP準備でグリーンメソッドを開発するためのいくつかの研究作業は、この分野で補足する価値があります。

この作業では、リン化コバルトナノ粒子（Co ₂ P NPs）は、酢酸コバルトと赤リンを原料としたワンステップ水熱合成法で調製しました。ここでは、Co ₂を作成しました H ₂のドロップキャスティング法によるインジウムスズ酸化物（ITO）基板上のP NP O ₂ 検出。 Co ₂ PはH ₂に対して優れた電極触媒活性を示しました O ₂ 割引。さらに、良好な選択性、優れた再現性、および優れた安定性を示したため、H ₂の高感度プラットフォームとしての潜在的なアプリケーションを示しました。 O ₂ 検出。

実験セクション

試薬と材料

すべての試薬は分析グレードであり、さらに精製することなく使用しました。酢酸コバルト（II）四水和物（Co（Ac）₂ ・4H ₂ O）、塩化コバルト六水和物（CoCl ₂ ・6H ₂ O）、D-（+）-グルコース、L-グリシン（L-Gly）、アスコルビン酸（AA）、尿酸（UA）、尿素、NaCl、KCl、NaH ₂ PO ₄ 、Na ₂ HPO ₄ 、過酸化水素（30％H ₂ O ₂ ）、エタノールおよびアセトンは、Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd.Chinaから購入しました。 D-（–）-フルクトース、L-アルギニン（L-Arg）、L-リジン（L-Lys）、ドーパミン（DA）、アセトアミノフェン（APAP）、アミノトリメチレンホスホン酸（ATMP、50 wt％）はAladdin Ltd.市販の赤色リン（98.5％、100メッシュ）はEnergy Chemical Technology（Shanghai）Co.、Ltdから購入しました。NafionPFSAポリマー分散液（5％）はBeijing Honghaitian Technology Co.、Ltdから購入しました。脱イオン水を使用しました。すべての実験で。インジウムスズ酸化物（ITO）ガラス（10×20×1.1 mm、ITOフィルム185±2 nm、シート抵抗6.6±0.1Ω）は、Shenzhen South Xiangcheng Technology Co.、Ltd。から供給されました。

Co _2の合成 Pナノ粒子

市販の赤色リン（2 g）を15 mL H ₂に分散させました Oを超音波処理し、50 mLのテフロンで裏打ちされたステンレス製オートクレーブ内で200°Cで12時間水熱処理して、酸化物層を除去します[34]。次に、熱水処理された赤リンを真空オーブンで乾燥させた。赤リンの前処理を終えた後、1ミリモルのCo（Ac）₂ ・4H ₂ Oを30mLの蒸留水に溶解し、水溶液を得た。次に、熱水処理した赤色リンを、Co / P1 / 10のモル比で15分間超音波処理しながら溶液に添加しました。調製した懸濁液を、50mLのテフロンで裏打ちしたオートクレーブにすばやく注ぎました。次に、オートクレーブを電子オーブンに入れ、160、200、240°Cでそれぞれ12時間熱水処理しました。次に、生成物を遠心分離によって収集し、蒸留水およびエタノールでそれぞれ３回洗浄した。最後に、Co ₂ P NPは、空気中60°Cで3時間乾燥しました。

Co（PO ₃の合成）₂

Co（PO ₃の作成方法）₂ 以前のレポート[35]を参照しました。 0.1 M CoCl ₂ ・6H ₂ Oメタノール溶液を最初に調製した。次に、2 mL ATMP（50 w t％）を上記の紫色の溶液20 mLに滴下し、30分間撹拌しました。続いて、不溶性のコバルト-メタリン酸配位高分子が溶液中に形成された。得られたピンク色の粉末を、Arフロー下で5°C・min ^-1 の加熱速度で900°Cまでさらに加熱しました。その後、2時間保持します。室温まで冷却した後、黒色の生成物を収集し、空気中で650°Cで4時間再加熱して、炭化した有機配位子を除去しました。最後に、Co（PO ₃ ）₂ 取得されました。

Co _2の製造 P / ITO電極

まず、ITOガラス（1cm×2cm）をアセトン、エタノール、脱イオン水でそれぞれ10分間超音波処理しました。その後、処理されたITOを窒素掃引下で乾燥させた。電極の変更には、5mgのCo ₂ PNPを1mLの脱イオン水に分散させて、5 mg mL ^-1 を形成しました。 Co ₂ Pサスペンション。次に、5μLの5％Nafion溶液を懸濁液に添加し、混合物を15分間超音波処理して、均一なインクのような懸濁液を得ました。 Co ₂ P / ITO電極は、100μLのCo ₂をドロップキャスティングすることによって準備されました。 ITO表面にP懸濁液を置き、作用電極として空気中で乾燥させます。 Co ₂の概略準備プロセス P / ITO電極をスキーム1に示します。

特性

X線回折（XRD）データは、CuKα線を使用したD8ADVANCE回折計によって分析されました。透過型電子顕微鏡（TEM）測定は、エネルギー分散スペクトル検出器を備えたTecnai G2F20を使用して実施しました。 X線光電子分光法（XPS）スペクトルは、Thermo ESCALAB250XI分光計で測定されました。

電気化学的測定

ボルタンメトリー測定は、Co ₂を使用して、3電極システムのCHI660E電気化学ワークステーションによって行われました。作用電極としてのP / ITO電極、対電極としての白金箔（1cm×1cm）、および参照電極として3 MKCl溶液を含むAg / AgClを使用して、H _{2 O ₂ 検出。人体の生理食塩水をシミュレートする電解質として、リン酸緩衝生理食塩水（PBS; 0.1 M、pH 7.4）を使用しました。 Co ₂のセンシング性能 H ₂に向かうP / ITO電極 O ₂ 検出は、サイクリックボルタンメトリー（CV）とアンペロメトリー（I-t）によって調査されました。すべての検出実験は、室温で100rpmで攪拌しながら実施しました。電気化学インピーダンステストはVersaSTAT3F電気化学ワークステーションで実行され、インピーダンス測定の電解質としてフェリシアニド溶液が使用されました。}

結果と考察

Co _{2の特性評価} P NP

Co ₂の結晶構造 P NPは、XRD測定によって確認されました。図1aは、Co ₂のXRDパターンを示しています。 160、200、240°Cで12時間調製したPサンプル。 Co ₂ 200°Cで調製されたPサンプルは、40.7°、40.9°、52.0°、56.2°付近に回折ピークを示します。これは、斜方晶相の（121）、（201）、（002）、（320）の特徴的な回折面に対応します。 Co ₂の P（JCPDS番号32-0306）。温度が160°Cから200°Cに変化すると、回折ピークの強度が増加し、ピークが狭く鋭くなりました。これは、製品が200°Cでより高い結晶化度を持っていることを示しています。ただし、温度が240°Cに達すると、いくつかの不純物が形成され、29.7°の回折ピークはCo（PO ₃の（-222）の回折面に起因していました。）₂ （JCPDS番号27-1120）。 Co ₂の調製に対する合成時間の影響 200°C未満のPは、追加ファイル1：図S1に示されています。期間が12時間以内に制御された場合、取得されたCo ₂ P NPは、（121）ピークの半値全幅の最低値を示し、結晶化度が優れていることを示しています。さらに、反応時間が6時間から24時間まで変化した場合、サンプルには不純物は存在しませんでした。 Scherrerの式によると、Co ₂の計算された粒子サイズ 200°Cで12時間準備されたPNPは14.2nmでした。

Co ₂の形態ＰＮＰは、ＴＥＭ測定によって評価された。図1bに示すように、200°Cで調製された製品は、直径が約10〜20 nmの不規則なナノ粒子で構成されており、高分解能TEM（HRTEM）画像（図1の挿入図）に2つの格子縞がはっきりと見られます。 1b）。隣接する平面間の距離は0.22nmで、Co ₂の（121）ファセットに対応します。 P、TMPの形成がCo ₂であることをさらに確認します P。

XPS技術は、Co ₂の表面の化学組成の分析に使用されました。 P.追加ファイル1：図S2は、Co ₂のXPS調査スペクトルを示しています。サンプルからP.Co、P、O元素が検出され、Co ₂の存在が確認されました。 Pおよびいくつかの酸化生成物。 Co ₂のエネルギー分散型X線分光法（EDX）スペクトル P（追加ファイル1：図S3）は、サンプル内の3つの元素（Co、P、O）の共存をさらに確認します。 Co2pとP2pの高分解能XPSスペクトルを、それぞれ図1c、dに示します。 Co 2pスペクトルでは、781.1および797.6 eVのピークは、Co ²⁺ の結合エネルギー（BE）に起因する可能性があります。 2 p _3/2 およびCo ²⁺ 2 p _1/2 、それぞれ[26、36]。 786.0と803.1eVのピークは、2つの明らかなシェイクアップ衛星のピークです。 778.2eVのCo2p BEは、金属CoのCo 2p BE（777.9 eV）から正にシフトします。これは、Co ₂のCoを示唆しています。 Pは部分的に正電荷を帯びています（δ ⁺ ）値が小さい（0 <δ <2）[37]。それどころか、P 2 p 129.4 eVのBEは、元素PのBE（130.2 eV）から負にシフトするため、Pは部分的に負の電荷（δ）を持ちます。 ⁻ ）Co ₂で P.単体と比較したCoおよびP元素のBEの変化は、それぞれCo ₂の電子密度の移動方向を示しています。 PはCoからPまでです[38]。 Co ₂の表面酸化 Pは、サンプル内にいくつかの酸化されたP種を生成します。したがって、高BE範囲の133.2 eVのピークは、酸化物に割り当てられます[39]。

H ₂の電気化学的検出 O ₂ Co ₂で P / ITO電極

Co ₂の電極触媒活性を調査するには H ₂のPNP O ₂ 還元、非酵素的H ₂を設計しました O ₂ Co ₂のドロップキャスティングによる電極裸のITO表面上のPNP懸濁液。図2aは、裸のITOとCo ₂のCV曲線を示しています。 5.0 mM H ₂を使用した場合と使用しない場合のpH7.4の0.1MPBS中のP / ITO O ₂ 、それぞれ。破線は、H ₂に対する裸のITOの応答を示しています O ₂ 削減はごくわずかです。ただし、Co ₂ P / ITO電極は、H ₂の存在下で、-0.5Vに顕著な減少ピークを示します。 O ₂ 、Co ₂の顕著な電極触媒活性を示しています H ₂へのPNP O ₂ 割引。図2bは、Co ₂のCV曲線を示しています。さまざまなスキャンレートでのP / ITO（30〜100 mV s ^-1 ）2.5 mM H ₂ O ₂ 。スキャンレートを上げると、還元ピーク電流が増加し、ピーク電位がより負の電位側にシフトし、H ₂の低下を示します。 O ₂ Co ₂で P / ITOは不可逆反応でした。対応する検量線（挿入図、図2b）は、還元ピーク電流密度がスキャンレートに比例して増加することを示しており、H ₂の電気化学的還元を示唆しています。 O ₂ Co ₂の表面に P / ITO電極は表面制御プロセスです[40]。

図2c、dは、Co ₂のアンペロメトリー応答と検量線を示しています。 H ₂を連続して添加したときのP / ITO電極 O ₂ 攪拌しながら-0.5Vで0.1MPBSに入れます。 Co ₂ P / ITO電極は、H ₂の添加に対して迅速な応答を示しました。 O ₂ 5秒以内に定常電流を達成しました。図2dの検量線は、トランスデューサがH ₂の多重線形範囲を表示していることを示しています。 O ₂ 0.001〜1.0 mM、1.0〜5.0 mM、および5.0〜10.0mMの濃度。センサーの感度は、H ₂の濃度の増加に伴って変化します O ₂ 、H ₂の電極触媒還元速度の変化による O ₂ 電極表面に。以前の報告によると、H ₂の律速段階 O ₂ 還元はH ₂によって支配されます O ₂ 低濃度での吸着、H ₂の活性化 O ₂ 高濃度での主要な決定要因です。中央の領域では、H ₂の還元速度 O ₂ 吸着と活性化を同時に制御します[10]。多数のアナリストがCo ₂の表面に吸着します Pと高濃度の活性部位をカバーし、感度の低下につながります[41]。

H ₂の比較 O ₂ 準備されたCo ₂のセンシング性能さまざまな反応温度と時間でのPサンプルを追加ファイル1に示します。図S4、S5、および表S1は、Co ₂であることを示しています。 200°Cで12時間準備されたPサンプルは、最高のH ₂を示します。 O ₂ センシング性能。反応温度を240°Cに上げると、Co（PO ₃ ）₂ Co ₂で Pは不純物と見なすことができます。 Co（PO ₃の影響をさらに明確にするため）₂ H ₂で O ₂ 検出、Co（PO ₃の電気化学的特性）₂ 調査されました。追加ファイル1に示すように：図S6、Co（PO ₃ ）₂ H ₂に対する電気化学的応答はごくわずかです。 O ₂ 導電率はCo ₂より劣っています P、Co ₂の現在の信号を拒否しますアンペロメトリーテストにおけるP / ITO。したがって、Co ₂の純度と結晶化度が高くなります。 Pサンプルは、センシング性能の向上に寄与する可能性があります。したがって、Co ₂を選択します最高のH ₂として200°Cおよび12時間で調製されたPサンプル O ₂ センシング材料。キャリブレーション I – t 曲線は、H ₂の生理学的範囲である1.0〜50μMの濃度でも良好な線形関係を示しています。 O ₂ 生物系における濃度（図S7）[28]、これはこのセンサーの実用化の可能性を改善するのに役立つ可能性があります。さらに、H ₂の検出限界（LOD） O ₂ センサーは、信号対雑音比3で0.65μMと計算できます。以前に報告されたH ₂と比較して O ₂ センサー、Co ₂の包括的な電気化学的性能 P / ITOトランスデューサーは、表1に示すように、感度、線形範囲、LODが良好なトランスデューサーよりも優れています。

<図>

1.0 mM H ₂を検出した後 O ₂ 35回繰り返し（図3a、b）、Co 2 p のXPSスペクトルおよびP2 p Co ₂の領域 Pは、センシングメカニズムをさらに調査するために分析されます。 P 2 p のピークの位置に大きな変化はありません。 H ₂の前後の領域 O ₂ 検出。ただし、Co 2 p の778.2および793.0eVにピークがあります。複数回測定した後、スペクトルが消えました。 778.2 eVのピークは、Co ₂に還元されたCo種が存在することを示しています。 Pサンプル[37]、これら2つのピークの消失は、Co ₂の価数が低い還元されたCo種を示しています。 PはH ₂によって酸化される可能性があります O ₂ 検出プロセス中、特に高濃度のH ₂ O ₂ 。残りのピークはCo2 p 領域（782.1および798.3 eV）はCo ²⁺ に起因します 2 p _3/2 およびCo ²⁺ 2 p _1/2 それぞれ、Co ₂にCo（II）種が排他的に存在することを示唆しています。複数の測定後のP。 H ₂でのコバルトベースの電極触媒の利用に関する以前の報告によると O ₂ 検出、Co ²⁺ 種はH ₂の触媒活性部位として示されています O ₂ 削減[46,47,48]。一般に、H ₂の電気化学的還元 O ₂ 以下に示すように、PBS [49、50]で2つのステップを実行します。

$$ {\ text {H}} _ {{2}} {\ text {O}} _ {{2}} + {\ text {e}} ^ {-} \ to {\ text {OH}} _ {{{\ text {ad}}}} + {\ text {OH}} ^ {-} $$（1）$$ {\ text {OH}} _ {{{\ text {ad}}}} + {\ text {e}} ^ {-} \ to {\ text {OH}} ^ {-} $$（2）$$ {\ text {2OH}} ^ {-} + {\ text {2H}} ^ {+} \ to {\ text {2H}} _ {{2}} {\ text {O}} $$（3）

最初のステップでは、H ₂ O ₂ 電子を取得して吸着OH ^- を形成します（OH _ad ）。中間OH _ad 追加の電子、H ₂の最終還元生成物を取得します O ₂ 、H ₂ O、が生成されます。 H ₂の酸化還元電位として O ₂ / H ₂ OはCo ³⁺ よりも高い / Co ²⁺ 、Co ₂のCo（II）種 Pは電子移動プロセスでCo（III）に酸化され、H ₂ O ₂ H ₂に削減されます O不可逆的に。アンペロメトリーテスト中、適用されるバイアスは、Ag / AgClに対して-0.5Vです（0.14 V vs に相当します。 NHE）、これはCo ³⁺ の標準酸化還元電位よりも低い / Co ²⁺ 。その結果、酸化されたCo（III）はCo（II）に還元され、Co（II）のこれらの触媒活性部位が再び再生されます。したがって、Co（II）種の触媒サイクルは、H ₂の電気化学的検出中に発生すると結論付けることができます。 O ₂ 原子価の低い還元されたCo種は、H ₂によって酸化されます。 O ₂ 繰り返し測定した後。

Co ₂の選択性、安定性、再現性、再現性 P / ITO電極

干渉防止性能は、バイオセンサーのもう1つの重要な特性です。アンペロメトリー試験で適用されたのと同様の電位で酸素を還元できるため、溶液中の溶存酸素による影響を回避するために高純度窒素が利用されました[51]。 Co ₂のCV曲線の比較 0.1 MPBS中のP / ITO、窒素パージありまたはなし、還元電位、および2.5 mM H ₂の電流応答 O ₂ 図S8に示すように、これらは類似しており、溶存酸素の干渉を無視できることを示唆しています。 Co ₂の選択性 P / ITOは、体液中の一般的な物質やその他の小分子（一部の無機塩、糖類、アミノ酸、還元性生体分子など）でもテストされました。図4aに示すように、上記の干渉物質を追加した後の現在の応答は、1.0 mM H ₂の応答と比較して無視できます。 O ₂ 。 H ₂の2つのO原子の両方として O ₂ 1つまたは2つのCo原子[52]、H ₂と結合できます。 O ₂ 分子はCo ₂のCo（II）種に化学的に吸着します具体的にはP。さらに、高電位での実際の生体サンプル中の一部の還元性化合物の無差別酸化による干渉も、低バイアス電位で大幅に低減できます[53]。したがって、Co ₂の好ましい選択性 PからH ₂ O ₂ 主に、特定の吸着サイトとしてのCo（II）種と、センシングプロセス中に適用される負のバイアス電位の恩恵を受けます。

さらに、Co ₂の安定性、再現性、再現性 P / ITOトランスデューサーも評価されました。 50μMH₂での10回の連続走査CV曲線の還元ピーク電流 O ₂ 図4bに示されています。 10サイクル後、電極のピーク電流は2.7％しか低下しませんでした。また、センサーは空気中に1ヶ月間保管した後も初期電流応答の約98.2％を維持し（図S9）、理想的な検出安定性と優れた長期耐久性を示しています。電極間の再現性は、H ₂の相対標準偏差（RSD）を計算することによって調査されます。 O ₂ 現在の応答。電極製造による電位誤差を可能な限り排除するために、H ₂の存在下での定常電流密度 O ₂ は個々の電極の初期バックグラウンド信号から差し引かれ、得られた差の値は各電極の電気化学的応答と見なされます。 6つのCo ₂ P / ITO電極は、制御された実験と同じ条件下で製造され、図4cに示すように、電流応答のRSDは1.24％であり、Co ₂の比較的優れた再現性を示しています。 P / ITO。一方、再現性は、1.0 mM H ₂を検出することにより、1つの電極で測定されました。 O ₂ 8回、RSD 1.14％が達成されました（図4d）。上記の結果は、H ₂の非酵素的電気化学的検出のための電極の十分な安定性、再現性、および再現性を示しています。 O ₂ 。

結論

要約すると、Co ₂ PNPは水熱法により合成に成功しました。さらに、Co ₂ 200°Cで12時間調製されたPNPは、H ₂の電気化学的還元に向けた効率的な触媒として証明されています。 O ₂ pH7.4のPBSで。非酵素的H ₂として O ₂ センサー、Co ₂ P / ITO電極は、5秒未満の高速アンペロメトリー応答、0.001〜10.0 mMのより広い応答範囲、0.65 µMの低い検出限界、および十分な選択性、再現性、安定性を示しました。この研究は、小さな生体分子と当社のCo ₂の電気化学的検出における遷移金属リン化物の応用に関する研究を広げることを目的としています。 P / ITOセンサーは、H ₂の新しい非酵素プラットフォームとして設計できます。 O ₂ 検出。