薬物送達、染料分解および過酸化水素の比色検出のためのポルフィリン鉄グラフト化メソポーラスシリカ複合材料

要約

ポルフィリン鉄分子（ヘミン）は、SBA-15（FeIX-SBA-15）のチャネリングされたメソポーラスシリカにうまくグラフトされ、付着したヘミン分子は酸化反応を触媒する酵素模倣物として機能しました。 H ₂の存在下 O ₂ 、調製されたFeIX-SBA-15複合材料は、溶液と膜の両方で工業用染料Orange IIと触媒テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB）を効果的に分解し、そこから比色H ₂ O ₂ 検出が達成されました。さらに、ヘミングラフト複合材料は、リアルタイム細胞分析によってモニターされる持続放出挙動を示すドキソルビシン塩酸塩（DOX）の抗癌剤の高い負荷含有量を示し、その結果、そのDOX / SBAと比較して癌細胞増殖に対する抑制効果が改善された-15。ヘミン修飾メソポーラスシリカナノコンポジットは、有望な生物医学的用途を備えた統合ナノプラットフォームを提供します。

はじめに

過酷な環境条件下での変性に対する感受性などの天然酵素の欠点を克服するために、酸化グラフェン、ヘミン、金属ナノ粒子などの安定性の高い酵素模倣物を開発するために多大な努力が払われました[1,2]。これらの人工酵素の中で、ヘムタンパク質ファミリーの活性中心であるヘミンは、よく知られている天然のメタロポルフィリンです[3]。触媒として、メタロポルフィリン錯体は、多環芳香族炭化水素（PAH）やアゾ染料などの環境汚染物質の酸化を効果的に触媒し、基質分子を機能性酸素含有有機化合物に変換したり、無害な化合物に分解したりします[4,5,6]。それにもかかわらず、ヘミンの触媒活性は、酸化的自己分解、不活性な二量体を生成する分子凝集、および水性緩衝液への低い溶解性に悩まされる可能性があります[7]。表面積の大きい固体支持体へのヘミンの固定化は、実際の使用での不十分な活性の損失を最小限に抑えながら、その高い触媒性能を達成するための経済的でありながら効率的な戦略を提供しました。

外面および内面への構造適応の実現可能性[8]により、メタロポルフィリンを含むさまざまなタイプのメソポーラスシリコンナノ材料（MSN）が、さまざまな用途でますます注目を集めています。たとえば、Huang etal。顕著なペルオキシダーゼ様活性を有するヘミンベースのメソポーラスシリカナノリアクターが報告されています[9]。 Barbosa etal。 Fe ₃を固定化したメタロポルフィリンを開発 O ₄ @SiO ₂ 炭化水素酸化のための再利用可能な生体模倣触媒としてのメソポーラスサブミクロスフェア[10]。ごく最近、Sun etal。トロンビン検出用のデュアルアプタマー生体認識とヘミンカプセル化メソポーラスシリカに基づく新しい化学発光センサーを報告しました[11]。さまざまなMSNの中で、SBA-15（Santa Barbara Amorphous-15）は、六角形の細孔構造と、化学グラフト機能分子に適した3〜10 nmの調整可能な細孔サイズを示します[8、12]。シリコン材料として、SBA-15は生物学的毒性が低く、SBA-15の表面にある大量の不安定なSi-OH基を使用して、他の機能性分子をグラフトし、SBA-15のより多くの機能を付与できます[13]。 SBA-15は、酵素の固定化、抗体のローディング、およびドラッグデリバリーの担体として使用できることが報告されています[14、15、16]。

効果的な化学療法抗生物質としてのDOXは、広域スペクトル癌の第一選択治療ですが、診療所でのその副作用は依然として深刻な問題です[17]。 DOXの体系的な毒性を低減しながら治療効果を向上させるために、分子設計やさまざまなドラッグデリバリーシステムの製剤開発に多大な努力が払われてきました。 2001年にメソポーラスMCM-41（Mobil Composition of Matter No. 41）が最初に薬物担体として使用された後[18]、SBA-15を含むMSNは、薬物負荷に望ましい固有の細孔構造のために有利な機能を備えていました[19、20]。とリリースします。それにもかかわらず、MSNの複雑な化学修飾は、実際のアプリケーションを制限する可能性があります。

この研究では、SBA-15にヘミンを移植して、ヘミンの酵素様活性が保持されるだけでなく、効率的なカプセル化と持続性を備えた複合材料（FeIX-SBA-15）を構築することに成功しました（スキーム1）。ドキソルビシン塩酸塩（DOX）の放出は、リアルタイムセルアナライザー（RTCA）テクノロジーによる培養癌細胞の増殖曲線に反映されるように達成されました[21、22、23]。特に、DOX / FeIX-SBA-15の場合、フェロセンカルボン酸修飾SBA-15（FCA-SBA-15）[24]を使用した以前の研究と比較して、比較的高いDOX負荷量が得られました。サポート内のグラフトされたFeIXとDOXの間のπ-πスタッキング。さらに、市販のフィルター膜に固定化されたFeIX-SBA-15の固体形態により、過酸化水素の効果的な色素分解と比色検出のためのフロー触媒フォーマットが開発されました。

材料と方法

資料

すべての試薬は分析グレード（A.R.）であり、さらに精製することなく使用しました。トリブロック共重合体PluronicP123（EO ₂₀ PO ₂₀ EO ₂₀ 、MW =5800）はSigma-Aldrich（ドイツ）から購入しました。 3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）、テトラエチルオルトシリケート（TEOS）、アシッドオレンジII、およびテトラメチルベンジジン塩酸塩は、Shanghai Aladdin biotechnology Co.、Ltd（中国）から入手しました。ヘミンとドキソルビシン塩酸塩はShanghaiMacklin Biochemical Co.、Ltd（中国）から購入しました。トリプシン-EDTA溶液は、Beyotime Biotechnology Co.、Ltd（中国）から入手しました。細胞培養培地（RPMI-1640）は、GE Healthcare Life Sciences Co.、Ltd（中国）から入手しました。ウシ胎児血清（FBS）は、Gibco Co.、Ltd（USA）から入手しました。ペニシリンとストレプトマイシンはThermoFisher Scientific Co.、Ltdから入手しました。A549細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手しました。

薬物負荷のためのSBA-15の化学的グラフト化

SBA-15は以前に報告されたように調製されました[12]。続いて、0.40gのSBA-15を80°Cで140mLのメチルベンゼンに分散させ、APTES（1.2 mL）を添加しました。次に、混合物をさらに8時間撹拌し、5000rpmで5分間遠心分離して分離しました。エタノールと水で洗浄した後、APTES-SBA-15で得られた生成物を80°Cで乾燥させました。ヘミン（0.15 g）を最初に30 mL DMSOに分散させ、次にAPTES-SBA-15（0.60 g）を添加し、次に混合物を70°Cでさらに7時間撹拌しました。得られた生成物を遠心分離し、洗浄し、最後に乾燥させた。これはFeIX-SBA-15であった。

FeIXがSBA-15に正常にグラフトされていることが確認された後、FeIX-SBA-15（0.50 g）をDOX・HCl（2 mg / mL）を含む20 mLの脱イオン水に懸濁し、37°Cで24時間撹拌しました。 DOXをロードします。次に、製品を5000rpmで5分間遠心分離しました。洗浄、乾燥、粉砕後、最終製品を回収しました（DOX / FeIX-SBA-15）。

特性

サンプルの形態的特徴は、15 kVの加速電圧で動作するエネルギー分散型分光法（EDS）X線検出器を備えた走査型電子顕微鏡（SEM、Hitachi SU-1510）によって研究されました。準備された材料の小角X線回折（SAXRD）パターンは、CuKα放射線（λ）を使用してSmartlab TM 9 KWX線回折計によって収集されました。 =0.154 nm）0.2°–8°の2θで。蛍光X線（XRF）分析は、蛍光X線分析装置（Thermo Scientific、USA）で測定しました。窒素収着等温線は、体積吸着分析器（BELSORP-MINI、日本）で相対圧力範囲P / P ₀で測定されました。 0.01から0.99まで。比表面積と細孔径の分布は、それぞれブルナウアー-エメット-テラー（BET）とバレット-ジョイナー-ハレンダ（BJH）の測定値を使用して計算されました。材料の固体UV-visスペクトルは、固体UV-vis分光光度計（Thermo Scientific、USA）によって記録されました。サンプルの吸収スペクトルを紫外可視分光光度計（UV-vis 7300、中国）で測定し、次の式に従ってDOX薬物負荷量（DLC）を計算しました：DLC（wt。％）=（負荷薬物の重量/合計メソポーラス材料とロードされた薬物の重量）* 100％。 DOX / FeIX-SBA-15の鉄含有量は、誘導結合プラズマ発光分光計（ICP、PE Optima 2000DV、米国）によって決定されました。分析前に、DOX / FeIX-SBA-15を最初にフッ化水素酸に完全に溶解し、次にフッ化水素酸を揮発させ、サンプルを濃硝酸に再溶解しました。

FeIX-SBA-15の触媒活性と分解挙動

FeIXの酵素様活性を利用して、TMBの触媒活性と溶液中の酸性オレンジIIの分解挙動を調べた。 20 mMNaOHと1.5mM Triton X-100を含む混合溶液を調製し、FeIX-SBA-15を溶解するためにPB溶液で4倍に希釈しました。 TMB触媒反応では、500μLのFeIX-SBA-15（600μg/ mL）を500μLのH ₂と混合します。 O ₂ （2 mM）を基質として使用して、TMB（500μL、3 mg / mL）を分解しました。スペクトル測定は、反応の程度を評価するために特定の時間間隔で実行されました。合成された複合材料の分解挙動を研究するために、500μLのFeIX-SBA-15（600μg/ mL）溶液と500μLの10 mM H ₂の混合物 O ₂ 溶液は基質として機能した。次に、500μLのOrange II（0.25 mM）を上記の溶液に加えました。吸光度の測定値は485nmで記録されました。

さらに、複合材料を市販のフィルター膜にさらに固定化して、フロー触媒方式でアシッドオレンジIIを分解しました。 FeIX-SBA-15の5mL懸濁溶液（600μg/ mL）を市販のフィルター（0.22μm、ミリポア）に通して、材料をフィルターにトラップし、室温で乾燥させました。 500μLのH ₂と混合した500μLのOrangeII（0.25 mM）溶液 O ₂ （10 mM）および500μLのH ₂ OはFeIX-SBA-15をロードした市販のフィルターメンブレンを通過しました。混合物のスペクトル測定値が記録されました。

H ₂の比色検出 O ₂

H ₂の場合 O ₂ 溶液中の検出では、500μLのFeIX-SBA-15（600μg/ mL）と500μLTMB（3 mg / mL）の混合物を調製しました。次に、500μLのH ₂ O ₂ 上記の溶液にさまざまな濃度（25〜500μM）を加え、30°Cで10分間インキュベートしました。最後に、スペクトル測定値は651nmで記録されました。

同時に、H ₂の測定 O ₂ フロー触媒方式で複合材料を固定化した市販のフィルター膜で実施しました。改変された膜は、上記のように得られた。次に、500μLのH ₂の混合物 O ₂ （0.293〜8.8 mM）、500μLTMB（2 mg / mL）および500μLH₂ Oは、改良された市販のフィルターメンブレンを個別に通過させた後、混合物のスペクトル測定値を651nmで記録しました。

H ₂の濃度に対して吸光度をプロットしました。 O ₂ 、およびメソッドの検出限界（LOD）は、式LOD =3RSD / slopeによって評価されます。（RSD：相対標準偏差）。

細胞組織とRTCA検出

ヒト非小細胞肺細胞A549は、5％CO ₂を含むインキュベーター内で、10％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を含むRPMI-1640培地で培養されました。 37°C（Thermo Scientific）で。材料の細胞毒性評価には、リアルタイムセルアナライザー（RTCA）テクノロジー（xCELLigenceシステム、ACEA Biosciences Inc.）およびCell Counting Kit-8（CCK-8、DOJINDOラボラトリー）メソッドを採用しました。 RTCA検出では、ウェルあたり5000〜8000個の細胞をEプレートに播種しました。細胞のインキュベーションと増殖は、アナライザーによってリアルタイムで監視され、信号の変化は、細胞指数（CI）として定義される任意の単位として表されました。細胞は、12.6 µg / mLの濃度でFeIX-SBA-15およびDOX / FeIX-SBA-15に曝露されました。 DOXの濃度は0.50µg / mLでした。また、IC ₅₀を入手するには DOX / FeIX-SBA-15のうち、1.6〜50.4 µg / mLの異なる用量のDOX / FeIX-SBA-15で処理された細胞が検出されました。さらに、エンドポイント法としてのCCK-8キットアッセイを使用して、材料の細胞毒性を検出しました。 CCK-8試薬を細胞と2時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで450nmの波長で吸光度を測定しました。

結果と考察

材料の特性評価

DOX / FeIX-SBA-15の複合体は、スキーム1に示すように合成されました。APTES-SBA-15は、最初にアミノ化反応によって調製されました[13]。次に、FeIXの分子を、アミド反応と、メソポアのカルボキシル基とアミノ基の間の静電相互作用によって、APTES-SBA-15の表面にグラフトしました。最後に、抗がん剤DOXがFeIX-SBA-15複合材料にロードされ、FeIXの共役平面大環状分子[25]とDOXのアントラサイクリン発色団[24]により、FeIXとDOX間のπ-πスタッキングの強力な分子相互作用が関与します。

複合材料の表面微細構造は、走査型電子顕微鏡（SEM）によって評価されました。図1aに示すように、0.4〜1μmのサイズの一定の均一性を持つ管状構造のSBA-15がSBA-15で形成され、付着したFeIXおよびDOX分子は明らかな形態変化を引き起こしませんでした。 SBA-15と比較したDOX / FeIX-SBA-15のTEM画像（図S1）は、化学修飾後に保持されたメソ構造を検証しました。 DOX / FeIX-SBA-15の化学組成は、蛍光X線分析によってさらに推定されました。表S1に示すように、DOX / FeIX-SBA-15には、Si、O、C、Feおよび微量の他の吸収元素が含まれています。 FeIX-SBA-15と比較して、DOX / FeIX-SBA-15のSi（〜24.3％）とFe（〜2.5％）の計算された原子パーセンテージはわずかに低かったが、Cの量（11.3％）は比較的高く、DOXのカプセル化が成功したことを示しています。表面成分をさらに評価するために、複合材料の固体UV-visスペクトルを記録しました。図S2に示すように、FeIX分子と同様に、FeIX-SBA-15は250〜350 nm、450〜550 nm、600〜700 nmに吸収帯を示しましたが、SBA-15には実質的に観察可能な帯はありませんでした[ 26]。比較すると、DOX / FeIX-SBA-15は、DOXから生じる450〜550nmの広い吸収帯を示しました。

複合材料の小角X線回折分析も実施されました。図1bに示すように、SBA-15のSAXRDパターンは、0.94°に主な回折ピークを示し、1.6°と1.8°に2つの観測可能なピークがあり、それぞれ（100）、（110）、（200）の結晶面を示しています。明確に定義されたメソ構造に[27]。 SBA-15と比較して、DOX / SBA-15のSAXRDパターンはピーク強度の減少を示し、DOXの負荷が細孔構造に損傷を与えなかったことを示しています。しかし、SBA-15にFeIXをグラフトすると、（110）および（200）結晶面のピーク強度が低下し、大きな角度に向かってピークシフトが観察され、材料のメソ構造の規則性が部分的に失われたことが示唆されました[28]。特に、FeIX-SBA-15にDOXをさらにロードすると、（110）および（200）の結晶面が消失しました。

サンプルのメソ構造パラメータを取得するために、窒素収着等温線を記録しました。図1Cに示すように、すべてのサンプルは、高い相対圧力で鋭い毛細管凝縮ステップを伴う典型的なタイプIV等温線を示し、化学修飾後のメソ構造の保持を示しています[24]。図1Dと表S2に示すように、SBA-15の約6 nmと比較して、FeIX / DOXの結合による細孔サイズの減少が観察され、SAXRDの結果が裏付けられました。 DOX / SBA-15およびDOX / FeIX-SBA-15のDOXローディング含有量は、それぞれ1.14％および4.27％と計算されました。結果は、FeIXグラフト化SBA-15がメソ細孔におけるDOXの負荷能力を増強したことを示しました。これはDOX / SBA-15の約3.7倍、以前の研究からのDOX / FCA-SBA-15の約1.6倍でした。 [24]。薬物分子のこのような改善されたローディング能力は、FeIXとDOXの間の洗練された分子相互作用に起因する可能性があります。

メソポア上のすりおろしたヘミンの触媒活性と分解挙動

FeIX-SBA-15の触媒活性は、H ₂の存在下でTMBを使用して評価しました。 O ₂ モデル反応として[29]。図2aは、アッセイ溶液（TMB + H ₂）の吸光度を示しています。 O ₂ + FeIX-SBA-15）は、触媒反応時間とともに増加しました。したがって、溶液は青色に変化し、時間とともに暗くなっていきました（図2b）。ただし、H ₂のいずれの場合も、反応は発生しませんでした。 O ₂ または、FeIX-SBA-15が溶液中に存在せず、FeIX-SBA-15のペルオキシダーゼ活性を示しています。一方、図S3Aに示すように、FeIX-SBA-15はH ₂の存在下でオレンジIIを分解することができました。 O ₂ 3時間の反応時間内のUV-vis吸光度によって監視されます。

ヘミングラフトメソポーラス複合材料の固体形態を利用して、FeIX-SBA-15で固定化された市販のフィルター膜に基づくフロー触媒フォーマットが有機変換についてテストされました[30、31]。図S3Bに示すように、H ₂ O ₂ オレンジII混合物はSBA-15のみの対照膜と比較して修飾膜を通過し（図S3C）、溶液の吸収強度は同時に減少し、再利用後に優れた触媒活性のFeIX-SBA-15固定化膜を示しています。廃水中の染料分解に適用できる可能性があります[32、33]。

さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼと比較して、ヘミンを含む複合材料は、酸性溶液を含む比較的過酷な条件下でのヘミンの十分な安定性に起因する広範囲のpHで顕著な触媒活性を示しました[29、34]。これは実用上重要です。

H ₂の比色検出 O ₂

FeIX-SBA-15のTMB触媒反応モデルに基づいて、H ₂を決定するための比色戦略 O ₂ 溶液中は、図2cに示す検量線で確立されました。 H ₂の濃度範囲 O ₂ 25〜500 µMで、検出限界（LOD）は2.1 µMでした。

続いて、H ₂の単純な発色検出 O ₂ H ₂の直接フィルタリングによっても開発されました O ₂ FeIX-SBA-15修飾市販膜を介してさまざまな濃度の。図2dに示すように、線形検出範囲は0.293〜8.80 mMと推定され、検出限界は0.067mMです。得られた分析パラメータと以前のレポートの分析パラメータとの比較を表1に示します。これは、触媒濃度、pH、アッセイ温度などの反応条件に関連する検出性能を示しています[35]。提案されたメソッドは、これらの以前のレポートを上回っていませんでしたが、広いキャリブレーション濃度範囲での分析性能は、発色メソッドと同等でした。

<図>

細胞毒性アッセイおよびDOXをロードした複合体の細胞への影響の動的モニタリング

図3に示すように、A549細胞に対するサンプルの増殖阻害効果は、最初にCCK-8キットによって評価され、測定された半阻害濃度（IC ₅₀ ）の24時間は、表S3にまとめられています。 150μg/ mLのSBA-15で処理された細胞は、材料の細胞毒性が低いことを反映して、80％を超える細胞生存率を維持していました。 IC ₅₀ DOX / FeIX-SBA-15（12.6μg/ mL）の値はDOX / SBA-15（58.8μg/ mL）の約4分の1であり、FeIX-SBA-15（35.4μg/ mL）の約3分の1でした。 SBA-15へのFeIXの移植は、細胞毒性効果を改善するためにDOXをロードするのに効率的であることが示唆されました。

さまざまな複合材料で処理されたA549細胞の成長状態は、細胞の生理学的状態を反映するラベルフリーインピーダンス検出原理に基づくRTCAによって監視された図4a、bの持続的な薬物放出を示しました[41]。図4aに示すように、テストされた投与量では、DOX処理細胞の細胞指数値が最初に増加し、その後急速に減少し、DNA損傷プロセスに関連して観察された正規化細胞指数（NCI）値の急激な減少が観察されました[42]。 FeIX-SBA-15（12.6μg/ mL）とDOX / FeIX-SBA-15（12.6μg/ mL）の両方のNCI値はコントロールよりも低かったが、NCI値はインキュベーション時間とともに増加することが観察された。 FeIX-SBA-15と比較して、DOX / FeIX-SBA-15処理細胞のNCI値は、処理の最初の数時間で増加しました。しかし、薬物送達の持続可能な放出挙動およびDOX / FeIX-SBA-15のメソポアから放出されたDOXの効果的な濃度蓄積のために、ほとんどの細胞を殺すのに十分ではなかったため、DOX /で処理されたA549細胞の細胞増殖FeIX-SBA-15は比較的安定した抑制状態を示しましたが、FeIX-SBA-15処理細胞の細胞指数値は次のプロセスで大幅に増加しました。 ICで₅₀ 12.6μg/ mL（CCK-8）の濃度では、DOX / FeIX-SBA-15のNCI値は、24時間で対照群の50％よりも高いことがわかりました。したがって、細胞に対するDOX / FeIX-SBA-15の複数回投与効果が記録され（図4B）、記録されたDOX / FeIX-SBA-15のNCIから導出された用量反応曲線がRTCAソフトウェアを使用して計算されました（図4B）。。4c、d）。 IC ₅₀ DOX / FeIX-SBA-15で処理された細胞の値は、CCK-8テストと一致する15.0（24時間）であると決定されました。そして、48時間のインキュベーション後、IC ₅₀ 計算値は6.7（48 h）µg / mLでした。

結論

この研究では、複数の用途でSBA-15にヘミン分子をグラフトすることに成功しました。構築されたFeIX-SBA-15は、抗がん剤のロードに望ましく、TMBを触媒し、H ₂の存在下で溶液中および膜上でアシッドオレンジIIを分解するのに効果的でした。 O ₂ 。 TMB触媒モデル反応に基づいて、H ₂の定量分析のための比色戦略 O ₂ 設立された。さらに、FeIXグラフト化SBA-15は、DOXの比較的高い負荷含有量を支持し、DOX / SBA-15と比較して癌細胞増殖に対する阻害効果を改善しました。一方、A549に対するDOX / FeIX-SBA-15の細胞毒性は、RTCAによって動的に監視され、メソ細孔からの薬物分子DOXの徐放性挙動を明らかに示唆しています。これに基づいて、このドラッグデリバリーシステムはDOXの細胞毒性を低減しましたが、それでも腫瘍細胞の増殖を阻害するのに効果的でした。まとめると、固体触媒およびドラッグデリバリーシステムとして製造したヘミングラフトメソポーラスシリカナノコンポジットは、巨大な生物医学的可能性を備えた用途の広いナノプラットフォームを提供する可能性があります。