肺癌の標的イメージングのためのCKAP4抗体結合Si量子ドットミセル

はじめに

癌は、世界中の人間の健康を脅かす主要な病気の1つです[1]。その中で、肺がんの発生率と死亡率は、すべての悪性腫瘍の中で最も高く、毎年増加傾向を示しています[2]。外科的切除は固形腫瘍の主要な治療法です。ただし、悪性組織と健康な組織を区別する方法は、主に触覚と視覚の手がかりと外科医の経験に限定されています[3]。

近年、腫瘍切除のためのリアルタイムの術中ガイダンスの研究分野で、蛍光ガイド下手術が普及している[4]。蛍光造影剤と蛍光イメージングシステムの助けを借りて、外科医はリアルタイムの画像ガイダンスを使用して原発腫瘍を切除し、手術腔内の残存腫瘍を特定することができます。従来の生物医学画像法と比較して、蛍光画像システムには、電離放射線がないことや高い空間分解能など、いくつかの利点があります[3、5、6]。

現在、研究者は生物学的イメージングのためのさまざまな蛍光ナノ材料を報告しています[7、8]。その中で、シリコン量子ドット（Si QD）は、生物学的イメージングの分野で人気があります[9、10、11]。ただし、SiQDを使用した肺がん手術ナビゲーション用の蛍光造影剤の調製に関する報告はありません。

2014年、Pi etal。は、新規の水分散性SiQDミセルの合成方法を報告しました[12]。研究データは、Si QDミセルが、制御可能なサイズ、高い蛍光量子効率、優れた光安定性などの利点を示すことを示しました[12]。この研究は、Piらによって報告された水溶性SiQDミセルを改善および変更することを目的としています。将来、肺がん手術のナビゲーション用の蛍光造影剤として使用されることが期待される、新しい蛍光造影剤を調製すること。

2018年、柳田ほかCKAP4は、肺がん患者の血清およびがん組織で高度に発現しており、肺がんの早期診断のための新しいバイオマーカーとして使用できる可能性があると報告されています[13]。したがって、CKAP4抗体結合Si QDミセルは、肺癌手術のナビゲーション用の蛍光造影剤として使用される可能性のある、新しい蛍光造影剤である可能性があります。

この研究では、DSPE-PEG-COOHを使用して、表面にカルボキシル基を持つSiQDミセルを調製しました。次に、EDCを使用してCKAP4抗体をSiQDミセルと結合させました。結果は、SiQDミセル-CKAP4が水溶液中によく分散することを示した。 Si QDミセル-CKAP4は、365nmの紫外線照射下で強い赤色蛍光を示しました。抗体の結合により、Si QDミセル-CKAP4は、invitroおよびinvivoの両方で肺がん細胞および組織に対して優れたターゲティング能力を示しました。さらに、SiQDミセル-CKAP4はinvitroおよびinvivoの両方で高いバイオセーフティを示しました。この研究では、肺がん手術のナビゲーション用に潜在的な蛍光造影剤を準備しました。

メソッド

試薬

ウシ血清アルブミン（BSA）はSigmaから購入しました（アッセイ≥98％;米国ミズーリ州）; Adamas-betaからのテトラヒドロフラン（THF）（純度：99.9％;スイス、バーゼル）;アラジン（上海、中国）のDSPE-PEG-COOH。 AbcamのCKAP4抗体（0.55 mg / mL、英国ケンブリッジ）。 Hyclone（Utah、USA）のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 Gibco（ニューヨーク、米国）からのウシ胎児血清（FBS）およびチリシン。パラホルムアルデヒド（4％）、Triton X-100を使用した免疫染色透過化バッファー、およびBeyotime（上海、中国）の免疫染色用ブロッキングバッファー。ソーラービオからのグリセリン（純度≥99％;北京、中国）;キングモーンのトリプシン（0.25％、中国、上海）。

インストルメンテーション

透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、JEM-2100F電子顕微鏡（JEOL、東京、日本）を使用して撮影されました。水径計は、JEM Zetasizer Nano-ZS90（Malvern Instruments、Malvern、UK）を使用して決定されました。 UV-Vis吸収スペクトルは、Cary 50分光光度計（Varian、米国カリフォルニア州パロアルト）を使用して取得しました。蛍光発光スペクトルは、F-182 4500分光光度計（日立製作所、東京、日本）を使用して得られた。 X線光電子分光法（XPS）は、RBDでアップグレードされたPHI-5000C ESCAシステム（Perkin Elmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して実行されました。フォトルミネッセンス（PL）量子収率（QY）は、蛍光分光計（FLS1000、Edinburgh Instruments、Livingston、England）を使用して推定しました。フーリエ変換赤外分光法（FTIR）は、Thermo IS50（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ、米国）を使用して実行されました。 X線回折（XRD）は、SmartLab（Rigaku Corporation、Tokyo、Japan）によってテストされました。

セル

A549および293T細胞株は、Shanghai Institute of Cell Biology（Shanghai、China）から購入しました。

SiQDミセルの準備

まず、ヒドロシリル化反応によってドデクリSi QDを調製し、THFに溶解して、以前に報告された方法[12]に従ってドデクリSi QD溶液（15 mg / mL）を調製しました。次に、20mgのDSPE-PEG-COOHを10mLの脱イオン水に溶解してブレンドし、DSPE-PEG-COOH溶液（2 mg / mL、10 mL）を調製しました。続いて、dodecly-Si QDs溶液（15 mg / mL、66 µL）を10mLのDSPE-PEG-COOH溶液にゆっくりと滴下しました。 3分間超音波攪拌した後、透明で透明な溶液が得られました。次に、溶液をドラフト内に置き、暗所で12時間攪拌しました。続いて、溶液を24時間透析し、3日間凍結乾燥して、SiQDミセルを得ました。

SiQDミセルの準備-CKAP4

この研究では、CKAP4抗体はEDCによってカルボキシル基を活性化することによりSiQDミセルと結合しました[14]。方法は次のとおりです。4mgのSiQDミセルを900µLのPBSに分散させて、SiQDミセル溶液を調製しました。 EDC（10 mg）を100 µLのPBSに添加して、EDC溶液を調製しました。次に、100 µLのEDC溶液を900 µLのSi QDミセルにゆっくりと加え、5分間超音波で攪拌しました。さらに、20 µLのCKAP4抗体をゆっくりと加え、溶液混合物を暗所で室温で2時間撹拌しました。次に、製品を4000rpmで15分間限外ろ過しました。 PBSで3回洗浄した後、この生成物をSiQDミセル-CKAP4と呼びました。

細胞毒性試験

この研究では、トリパンブルーを使用してナノマテリアルのバイオセーフティをテストしました[15]。 A549および293T細胞を24ウェルプレート（1×10 ⁶ ）でインキュベートしました。 / well）37°Cで12時間。培地を廃棄した後、一連の濃度のSiQDミセルまたはSiQDミセル-CKAP4（Si濃度：0〜152 µg / mL）を24ウェルプレートに添加し、37°C​​で2時間インキュベートしました。培地を廃棄した後、細胞を収集し、PBSで2回洗浄した。トリパンブルーを細胞懸濁液と1：1の比率でブレンドしました。生細胞と死細胞の数は、Countstarを使用して検出および記録されました。細胞生存率（％）=生細胞数/（生細胞数+死細胞数）×100。3つの生物学的複製を使用しました。 Prismソフトウェア（バージョン7.01; GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を統計分析に使用しました。データは、二元配置分散分析とダネットの事後検定を使用して分析されました。統計的有意性は P に設定されました <0.05。 * P <0.05; ** P <0.01;および*** P <0.001。

ナノマテリアルはinvitroで肺がん細胞を標的とします

SiQDミセルおよびSiQDミセル-CKAP4のinvitroでの肺がん細胞へのターゲティング能力は、次のように検出されました。まず、A549細胞をレーザー共焦点ディッシュ（3×10 ⁵ ）でインキュベートしました。 細胞/皿）37°Cで12時間。培地を廃棄した後、細胞をPBSで3回洗浄した。続いて、1 mLのパラホルムアルデヒド（4％）を細胞に添加し、25°Cで10分間インキュベートしました。パラホルムアルデヒドを廃棄した後、細胞をPBSで3回洗浄した。次に、TritonX-100を含む1mLの免疫染色透過化バッファーを細胞に添加し、25°Cで10分間インキュベートしました。 Triton X-100で免疫染色透過化バッファーを廃棄した後、細胞をPBSで3回洗浄しました。続いて、免疫染色用の1 mLブロッキングバッファーを細胞に添加し、25°Cで10分間インキュベートしました。免疫染色のためにブロッキングバッファーを廃棄した後、細胞をPBSで3回洗浄しました。次に、200 µLのSiQDミセルまたはSiQDミセル-CKAP4（Si濃度150 µg / mL）を細胞に添加し、37°C​​で2時間インキュベートしました。ナノ材料を廃棄した後、細胞をPBSで3回洗浄した。写真は、レーザー共焦点顕微鏡（Leica、Wetzlar、Germany）を使用して撮影されました。励起光は405nmに設定され、発光波長は630nmに設定されました。

SiQDミセルおよびSiQDミセル-CKAP4のinvitroでの正常細胞へのターゲティング能力は、次のように検出されました。まず、293T細胞を1.5mLのEppendorfチューブに1×10 ⁶ の密度で収集しました。 細胞/チューブ。 1000 rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨てました。次に、1 mLのパラホルムアルデヒド（4％）を細胞に加え、室温で10分間インキュベートしました。 1000 rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨てました。次に、細胞をPBSで3回洗浄した。次に、TritonX-100を含む1mLの免疫染色透過化バッファーを細胞に添加し、25°Cで10分間インキュベートしました。次に、細胞を1000rpmで5分間遠心分離しました。上澄みを捨てた後、細胞をPBSで3回洗浄した。次に、免疫染色用の1 mLブロッキングバッファーを細胞に添加し、25°Cで10分間インキュベートしました。次に、細胞を1000rpmで5分間遠心分離しました。上澄みを捨てた後、細胞をPBSで3回洗浄した。続いて、200 µLのSiQDミセルまたはSiQDミセル-CKAP4（Si濃度150 µg / mL）を細胞に添加し、37°C​​で2時間インキュベートしました。 1000 rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿物をPBSで3回洗浄しました。細胞を回収し、顕微鏡スライドを準備しました。顕微鏡検査は、レーザー共焦点顕微鏡を使用して実施された。励起光は405nmに設定され、発光波長は630nmに設定されました。

3つの独立した実験が行われた。平均蛍光強度の定量分析は、ImageJソフトウェア（ベセスダ、メリーランド州、米国）を使用して実行されました。統計分析にはPrismソフトウェア（バージョン7.01）を使用しました。データは、一元配置分散分析とダネットの事後検定を使用して分析されました。統計的有意性は P に設定されました <0.05。 *** P <0.001。

腫瘍を有するマウスモデル

10匹のオスのヌードマウス（5〜6週齢）は、Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.、Ltd。（上海、中国）から購入しました。すべてのマウスは、同済大学の実験動物センター（上海、中国）で特定病原体除去（SPF）条件下で飼育されました。担癌マウスモデルを確立するために、マウスに1×10 ⁶ を皮下注射しました。 A549細胞。腫瘍の直径が6mmに達したときに、担癌マウスを実験に使用しました。すべてのマウス実験は施設のガイドラインに従って実施され、同済大学の施設の動物使用およびケア委員会によって承認されました。

SiQDミセル-invitroでの肺がん組織を標的とするCKAP4

担癌マウスを麻酔下で犠牲にした。腫瘍および正常な肺組織を収集して、パラフィン切片を調製した。脱水、抗原回復、血清ブロッキングの後、SiQDミセルまたはSiQDミセル-CKAP4（Si濃度150 µg / mL）を組織に添加し、37°C​​で2時間インキュベートしました。ナノ材料を廃棄した後、組織をPBSで3回洗浄した。組織を4 '、6-ジアミジノ-2-フェニリンドール（DAPI）で10分間染色しました。 PBSで3回洗浄した後、退色防止培地を組織に添加し、25°Cで5分間インキュベートしました。退色防止培地を廃棄した後、組織をPBSで3回洗浄した。写真は、励起波長405 nm、発光波長630 nmの蛍光顕微鏡（Nikon、東京、日本）を使用して撮影されました。 3つの独立した実験が行われた。 ImageJソフトウェアを使用して、平均赤色蛍光強度の定量分析を行った。統計分析にはPrismソフトウェア（バージョン7.01）を使用しました。データは、一元配置分散分析とダネットの事後検定を使用して分析されました。統計的有意性は P に設定されました <0.05。 *** P <0.001。

蛍光-ImagingIn Vivo

実験では、9匹の担癌マウスを3つのグループ（Si QDミセル-CKAP4注射グループ、Si QDミセル注射グループ、および生理食塩水注射グループ）に分けました。 Si QDミセル-CKAP4注射群のマウスに、200 µLのSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg / kg）を静脈内注射しました。 Si QDミセル注射群のマウスには、200 µLのSi QDミセル（Si：4 mg / kg）を静脈内注射しました。生理食塩水注射群のマウスには、200 µLの生理食塩水を静脈内注射しました。蛍光画像は、さまざまな時点（0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、および4時間）で取得されました。 Si QDミセル-CKAP4注射グループのマウスは、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍の蛍光シグナルを検出するために、4時間後に麻酔と安楽死を行いました。この研究では、蛍光イメージングは​​、PEフィルターセット（λ）を備えたVISQUE Invivo Smart-LF（VIEWORKS、京畿道、韓国）を使用して実行されました。 _興奮 450〜500 nm、λ _{エミッション} 600〜650 nm）。統計分析にはPrismソフトウェア（バージョン7.01）を使用しました。データは、一元配置分散分析とダネットの事後検定を使用して分析されました。統計的有意性は P に設定されました <0.05。 * P <0.05; ** P <0.01。

ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色

この研究では、12匹の担癌マウスに生理食塩水（200 µL）、Si QDミセル（Si：4 mg / kg、200 µL）、またはSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg / kg、200 µL）を注射しました。尾静脈を通して。 24時間後、マウスを安楽死させました。 H＆E染色は、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓で行われました。病理学的変化は光学顕微鏡で観察されました[14、16]。

結果

SiQDミセルの準備と特性評価

最初に、ドデシル-Si QDは、以前に公開されたレポート（スキーム1、ステップ1）[12]に従ってヒドロシリル化によって調製されました。報告されたデータと同様に、私たちのグループによって合成されたドデシル-Si量子ドットはメチルベンゼンによく分散しました[12]。 TEMは、ドデシル-Si量子ドットが比較的均一なサイズの球状であることを示しました。 TEM画像のドデシル-Si量子ドットのサイズは、ImageJソフトウェアを使用して測定されました。データによると、ドデシル-Si QDの直径は4.1〜5.3 nmの範囲であり、平均直径は約4.7 nmでした（図1a）。ドデシル-Si量子ドットの拡大画像では、明らかな格子縞が観察されます（図1a）。この研究では、ImageJソフトウェアを使用して格子の平面距離を測定しました。データによると、格子縞間の平均距離は約0.35 nmであり、これは以前に報告されたドデシル-Si量子ドット（0.34 nm）とほぼ同じです。したがって、この研究で合成されたドデシル-Si量子ドットは良好な結晶化度を示しました[12]。動的光散乱（DLS）は、ドデシル-Si QDの流体力学的直径が4.8〜13.5 nmで、平均が6.5 nmであることを示しました（図1b）。

SiQDミセルの概略図-肺がん組織におけるCKAP4調製と標的生物学的イメージング

a ドデシル-Si量子ドットのTEM画像。 b ドデシル-Si量子ドットの水力直径分布; c SiQDミセルのTEM画像。 d SiQDミセルの水力直径分布; e SiQDミセルのTEM画像-CKAP4; f SiQDミセルの水力直径分布-CKAP4; g SiQDミセルのC1sX線光電子分光法（XPS）スペクトル。 h SiQDミセルのC1sXPSスペクトル-CKAP4

水分散性SiQDミセルを調製するために、ドデシル-Si QDをDSPE-PEG-COOHからの自己組織化によって修飾しました（スキーム1、ステップ2）[12]。ここでは、F127の代わりにDSPE-PEG-COOHを使用して、表面にカルボキシル基を持つSiQDミセルを調製しました。結果は、SiQDミセルが水によく分散することを示しました。 ＴＥＭ画像は、Ｓｉ ＱＤミセルが、Ｓｉ ＱＤが挿入された球状粒子であることを示した。 Si QDミセルの直径は22.7〜54.6 nmの範囲で、平均直径は約34.3 nmでした（図1c）。 DLSは、Si QDミセルの流体力学的直径が43.8〜615.9 nmの範囲で、平均58.7 nmであることを示しました（図1d）。 SiQDミセルの平均ゼータ電位は約-20.7mVでした。この研究では、FTIRを実行して、Si QDミセルの組成を調査しました（追加ファイル1：図S1A）。データは、N–H、C–H、O–H、およびC =Oの伸縮振動吸収ピークが3430、2920、2850、および1640 cm ^-1 にあることを示しました。 、 それぞれ; C–HおよびO–Hの曲げ振動吸収ピークは1460および1400 cm ^-1 でした。 、 それぞれ; Si–C、C–O、およびP–O–Cの伸縮振動吸収ピークは1250、1100、および951 cm ^-1 でした。 、 それぞれ; Si–HおよびO =C–Nの曲げ振動吸収ピークは850および526 cm ^-1 でした。 、 それぞれ。これらのデータは、DSPE-PEG-COOHの特性グループ（N–H、O–H、C =O、C–O、P–O–C、O =C–Nなど）との特性グループがドデシル-SiQD（Si–CやSi–Hなど）は、Si QDミセルのFTIRスペクトルで検出でき、DSPE-PEG-COOHによって自己組織化されたミセルにドデシル-SiQDが正常にカプセル化されたことを示しています。さらに、Si QDミセルはXRDによって特徴づけられました（追加ファイル1：図S1B）。 Si QDミセルの回折ピークは鋭く、SiQDミセルの結晶化度が良好であることを示しています。 XRDパターンでは、2 θでピークになります 27.073、28.451、56.598、および73.145は、シリコンの（100）、（002）、（112）、および（203）結晶面に対応し（PDF＃80-0005）、SiQDが正常にカプセル化されたことを示しています。 SiQDミセル。 2 θのピーク 31.692、45.431、66.200、75.260、および83.955は、NaClの（200）、（220）、（400）、（420）、および（422）結晶面に対応します（PDF＃77-2064）。 Si QDミセルにNaClが存在することの合理的な説明は、次のようになります。SiQDミセルの準備後、Si QDミセルをPBSに溶解し、SiQDミセルにNaClが存在するようにしました。

UV-可視吸収スペクトルは、Si QDミセルの吸収が200〜500 nmの範囲であることを示しました（図2a）。 330 nmの励起波長では、SiQDミセルの蛍光発光スペクトルで650nmの強い蛍光が観察されました（図2b）。 Si QDミセル水溶液（Si濃度：80 µg / mL）は、自然光で透明で透明でした。ただし、365 nmのUV光の下で強い赤色の蛍光を発しました（図2c）。この研究では、絶対PL QYは、蛍光分光計（FLS1000）を使用してテストされました。励起波長は365nmでした。データは、SiQDミセルの絶対PLQYが約14.49％であることを示しました。

a SiQDミセルおよびSiQDミセルのUV-可視吸収スペクトル-CKAP4; b SiQDミセルおよびSiQDミセルの蛍光発光スペクトル-CKAP4; c SiQDミセルとSiQDミセルの画像-自然光（左）と365 nmのUV光（右）にさらされたCKAP4

SiQDミセルの準備と特性評価-CKAP4

EDCを使用してCKAP4抗体をSiQDミセルと結合させました（スキーム1、ステップ3）[14]。 TEM画像は、SiQDミセル-CKAP4がSiQDが挿入された球状粒子であることを示しました。 Si QDミセル-CKAP4の直径は24.4〜67.7 nmの範囲で、平均直径は約35.5 nmでした（図1e）。 DLSは、Si QDミセル-CKAP4の流体力学的直径が58.7〜824.9 nmの範囲で、平均78.8 nmであり、Si QDミセルよりもわずかに大きいことを示しました（図1f）。この増加は、CKAP4抗体の結合が原因である可能性があります。 C1s XPSスペクトルは、C1s領域に6種類の炭素原子を示しました：C（O）O（288.81 eV）、C =O（286.5 eV）、C–O（285.76 eV）、C–N（285.25 eV）、C –C（284.88 eV）、およびC–H（284.34 eV）（図1g）。ただし、C（O）OのピークはSi QDミセル-CKAP4のXPSスペクトルでほぼ消失し、カルボキシル基と第一級アミン間の結合が成功したことを示しています。したがって、CKAP4抗体はSi QDミセルとの結合に成功しました（図1h）。 SiQDミセル-CKAP4の平均ゼータ電位は約-10.7mVであり、SiQDミセルよりも高かった。上記の現象の説明は次のようになります。SiQDミセルの表面には多くのカルボキシル基があります。したがって、SiQDミセルは強い負の電気を示しました。ただし、Si QDミセル-CKAP4では、CKAP4抗体のカップリングにより、SiQDミセル-CKAP4の表面のカルボキシル基が減少しました。したがって、SiQDミセル-CKAP4の平均ゼータ電位が増加しました。

紫外可視吸収スペクトルは、Si QDミセル-CKAP4の吸収が200〜500 nmの範囲であり、Si QDミセルの結果と同様であることを示しました（図2a）。 330 nmの励起波長では、蛍光発光スペクトルでSiQDミセル-CKAP4から640nmの強い蛍光が観察されました（図2b）。これらの結果は、抗体結合がSiQDミセル-CKAP4の蛍光特性に有意な影響を及ぼさなかったことを示しています。 Si QDミセル-CKAP4水溶液（Si濃度：80 µg / mL）は、自然光で透明で透明でした。 365 nmのUV光の下では、Si QDミセルの結果と一致して、強い赤色の蛍光を発する可能性があります（図2c）。 PL QYテストでは、SiQDミセル-CKAP4の絶対PLQYが約16.96％であることが示されました。

SiQDミセルの細胞毒性試験-CKAP4invitro

ヒト肺がん細胞株A549およびヒト腎上皮細胞株293Tを標的細胞として使用し、SiQDミセルおよびSiQDミセル-CKAP4のバイオセーフティを調査しました。この研究では、さまざまな濃度のSiQDミセルとSiQDミセル-CKAP4（Si濃度0、2.375、4.75、9.5、19、38、76、および152 µg / mL）を、最初にA549または293T細胞と37℃でインキュベートしました。 °Cで2時間。細胞生存率はトリパンブルーを使用して検出されました（図3）[15]。 SiQDミセルおよびSiQDミセルのID50-CKAP4は、GraphPadソフトウェアを使用して取得しました。データは、SiQDミセルのID50がA549および293T細胞で152µg / mLを超えていることを示しました。 Si QDミセル-CKAP4のID50は、A549細胞で25.94 µg / mL、293T細胞で72.69µg / mLでした。これらの結果は、SiQDミセル-CKAP4の細胞毒性がSiQDミセルの細胞毒性よりも有意に高く、A549細胞におけるSiQDミセル-CKAP4の細胞毒性が293T細胞の細胞毒性よりも有意に高いことを示しています。この現象は、補体依存性細胞毒性が原因である可能性があります[17]。さらに、これらの結果は、Si QDミセル-CKAP4が肺がん細胞よりも正常細胞で高い生物学的安全性を示したことも示しており、これがinvivoでの応用の基礎を築きました。

A549 a の細胞生存率 および293T b さまざまな濃度のSiQDミセルおよびSiQDミセル-CKAP4（Si濃度：0、2.375、4.75、9.5、19、38、76、および152 µg / mL）と2時間（ n =3;平均±SD; Dunnettの事後検定を使用した双方向ANOVA。 * P <0.05; ** P <0.01;および*** P <0.001）

SiQDミセル-invitroで肺がん細胞を標的とするCKAP4

インビトロでの肺癌細胞におけるSiQDミセル-CKAP4の標的化機能をさらに調査するために、A549および293T細胞を標的細胞として使用しました。 SiQDミセルおよびSiQDミセル-CKAP4は、最初にA549および293T細胞と37°Cで2時間インキュベートされました。ターゲティング効果は、レーザー共焦点顕微鏡を使用して検出されました（図4）。その結果、SiQDミセル-CKAP4でインキュベートしたA549の赤色蛍光は、SiQDミセル-CKAP4と293Tの共培養グループ、Si QDミセルとA549の共インキュベーショングループ、およびSiQDミセルよりも有意に高かったことがわかりました。および293T共培養グループ。これらの結果は、SiQDミセル-CKAP4がinvitroでA549細胞を特異的に標的化できることを示しています。

SiQDミセルの能力の検出-invitroでのA549細胞を標的とするCKAP4。 a A549および293Tは、SiQDミセル-CKAP4およびSiQDミセル（Si 150 µg / mlの濃度）とともに37℃で2時間インキュベートされました。上清を捨てて2回洗浄した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Bar、25 µm）で細胞の写真を撮りました。 b 平均蛍光強度の定量分析は、ImageJ（ n =3;平均±SD; Dunnettの事後検定を使用した一元配置分散分析。 *** P <0.001）

SiQDミセル-invitroでの肺がん組織を標的とするCKAP4

肺癌組織を標的とするSiQDミセル-CKAP4の可能性を探求するために、A549組織に対するSiQDミセル-CKAP4の標的特性を検証するためのinvitro実験を設計しました。この研究では、A549細胞をマウスの皮下に接種しました。腫瘍形成後、A549腫瘍組織と正常な肺組織を収集し、SiQDミセルおよびSiQDミセル-CKAP4と37°Cで2時間インキュベートしました。ターゲティング効果は、レーザー共焦点顕微鏡を使用して検出されました（図5）。結果は、Si QDミセル-CKAP4でインキュベートされたA549組織が、405nmの励起波長で強い赤色蛍光を発する可能性があることを示しました。ただし、Si QDミセルでインキュベートしたA549組織、Si QDミセルでインキュベートした正常な肺組織、およびSiQDミセルでインキュベートした正常な肺組織では弱い赤色蛍光のみが観察されました。 Si QDミセル-CKAP4でインキュベートしたA549組織の赤色蛍光は、Si QDミセルでインキュベートしたA549組織、Si QDミセル-CKAP4でインキュベートした正常肺組織、およびSiQDミセルでインキュベートした正常肺組織の赤色蛍光よりも有意に高かった。これらのデータは、Si QDミセル-CKAP4がinvitroで肺癌組織を効果的に標的化できることを示しています。これは肺癌の潜在的な蛍光造影剤であると考えられています。

SiQDミセルの能力の検出-invitroでのA549組織を標的とするCKAP4。 a A549組織と正常な肺組織をSiQDミセル-CKAP4およびSiQDミセル（Siの濃度：150 µg / ml）とともに37℃で2時間培養しました。 2回洗浄した後、組織をDAPIで染色して核を可視化しました。組織は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Bar、200 µm）で撮影されました。 b 平均赤色蛍光強度の定量分析は、ImageJ（ n =3;平均±SD; Dunnettの事後検定を使用した一元配置分散分析。 *** P <0.001）

蛍光-ImagingIn Vivo

9匹の担癌マウスを3つのグループ（Si QDミセル-CKAP4注射グループ、Si QDミセル注射グループ、および生理食塩水注射グループ）に分けた。 Si QDミセル-CKAP4注射群のマウスに、200 µLのSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg / kg）を静脈内注射しました。 Si QDミセル注射群のマウスには、200 µLのSi QDミセル（Si：4 mg / kg）を静脈内注射しました。生理食塩水注射群のマウスには、200 µLの生理食塩水を静脈内注射しました。蛍光画像は、さまざまな時点（0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、および4時間）で取得されました。 3つのグループのすべてのマウスの肺がん組織で有意な蛍光シグナルは観察されませんでした（データは示していません）。これは、SiQDミセル-CKAP4およびSiQDミセルの弱い蛍光透過が原因である可能性があります。

Si QDミセル-CKAP4注射グループのマウスは、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍の蛍光シグナルを検出するために、4時間後に麻酔と安楽死を行いました。データは、肝臓、腎臓、および腫瘍組織で有意な蛍光シグナルが観察される可能性があることを示しました。ただし、心臓、脾臓、または健康な肺組織には有意な蛍光シグナルはありませんでした（図6）。肝臓と腎臓での有意な蛍光シグナルは、Si QDミセル-CKAP4が肝臓で代謝され、腎臓で排泄されることを示していました。さらに、A549腫瘍組織の蛍光シグナルは健康な肺組織の蛍光シグナルよりも有意に高かった。この現象は、肺がん組織に対するSiQDミセル-CKAP4のターゲティング能力に寄与しました。これらの結果は、Si QDミセル-CKAP4が肺がん組織を特異的に標的としていることを示しています。これは、将来の肺がんの外科的ナビゲーションのための蛍光造影剤になると期待されています。

a Si QDミセル-CKAP4を注射したマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍の明るい写真。 b Si QDミセル-CKAP4を注射したマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、および腫瘍の蛍光写真。 c 心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍組織の相対的な蛍光強度（ n =3;平均±SD; Dunnettの事後検定を使用した一元配置分散分析。 * P <0.05; ** P <0.01）

SiQDミセルのバイオセーフティ評価-CKAP4In Vivo

最後に、SiQDミセル-CKAP4のinvivoでの急性毒性を調査しました。この研究では、担癌マウス（ n =12）生理食塩水（200 µL）、Si QDミセル（Si：4 mg / kg、200 µL）、またはSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg / kg、200 µL）を静脈内注射し、24時間安楽死させました。後で。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓のH＆E染色画像を図7に示します。生理食塩水を注射したマウスと比較して、SiQDミセルを注射したマウスとSiQDミセルの主要臓器に明らかな病理学的変化はありませんでした。 -CKAP4を注射したマウス。上記のデータは、Si QDミセル（Si：4 mg / kg）およびSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg / kg）がinvivoで有意な毒性を示さなかったことを示しています。

生理食塩水、Si QDミセル（Si：4 mg / kg）、およびSi QDミセル-CKAP4（Si：4 mg / kg）を注射した担癌マウスの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓のH＆E染色画像24時間（倍率：200倍）

ディスカッション

現在、外科用ナビゲーション用の光学造影剤として、さまざまな蛍光ナノ材料が設計および合成されています[3、4]。 2020年に、On etal。肺癌手術ナビゲーションにおける蛍光造影剤としてのフルオロフォア[インドシアニングリーン（ICG）またはシアニン5.5（Cy5.5）]結合グリコールキトサンナノ粒子（CNP）の調製[18]。ただし、SiQDを使用した肺がん手術ナビゲーション用の蛍光造影剤の調製に関する報告はありません。

この研究では、肺がん組織のイメージングをターゲットにできるSiQDミセル-CKAP4の合成に成功しました。 Si QDミセル-CKAP4は、将来、肺がん手術におけるナビゲーション用の光学造影剤として使用されることが期待されています。 Si QDミセル-CKAP4の利点は次のとおりです。（1）Si QDを使用して、肺がん手術ナビゲーションツールライブラリのツールボックスを拡張する、肺がん手術ナビゲーション用の蛍光造影剤を初めて合成しました。 （2）この研究は、Piらによって報告された水分散性SiQDミセルを最適化しました。 SiQDミセルにターゲティング能力を追加する[12]。したがって、生物医学分野でSiQDを適用するための新しい可能性を提供します。 （3）Si QDミセルの原理-肺癌を標的とするCKAP4は、肺癌組織におけるCKAP4タンパク質の高発現に基づいています。 CKAP4抗体の結合により、SiQDミセル-CKAP4は肺癌組織を積極的に標的にすることができます。 EPR効果を介して腫瘍を受動的に標的とするナノ材料と比較して、SiQDミセル-CKAP4は肺癌組織に対してより強い特異性を示しました。 （4）Si QDミセル-CKAP4は、特定の濃度範囲で腫瘍細胞に対して選択的な毒性を示しました。したがって、Si QDミセル-CKAP4は、合理的な薬物濃度の範囲で高い生物学的安全性を示し、その潜在的な臨床応用価値を示しました。

この研究では、PL QYテストにより、Si QDミセルの絶対PLQYは約14.49％であり、SiQDミセル-CKAP4の絶対PLQYは約16.96％であることが示されました。 Piらによる研究。ドデシル-SiQDのPLQYは約26％であり、700nm未満にPLピークを持つ赤色光を放出するSiQDでは非常に高いことが示されました[12、19、20]。ただし、この研究におけるSiQDミセルのPLQYは約14.49％であり、ドデシル-SiQDよりも低かった。これは、エマルジョンプロセス中に導入された表面欠陥が原因である可能性があります。これは、Si-QDミセルのPL QYの減少とほぼ一致していました（ドデシル不動態化Si QDは、エマルジョンのF127から自己組織化されたミセルにカプセル化されていました）。 Piらによって報告された研究。 [12、21]。この研究では、SiQDミセル-CKAP4のPLQYは約16.96％であり、Si QDミセルのPL QY（14.49％）よりもわずかに高かった。これは、Si QDミセル-CKAP4では、CKAP4抗体のカップリングにより、Si QDミセルの表面欠陥が修復され、PLQYがわずかに向上したためと考えられます。

ご存知のとおり、Si QDの生物学的イメージングアプリケーションには課題があります。Siは細胞毒性をほとんど示しませんが、サイズがある程度小さくなると、Si粒子は細胞毒性を示す可能性があります。この研究では、細胞毒性試験により、Si QDミセル-CKAP4が9.5〜19 µg / mLで肺がん細胞に対して選択的な細胞毒性を示すことが示されました。したがって、CKAP4抗体結合の結果として、正常細胞に対するSi QDミセル-CKAP4の細胞毒性は、肺癌細胞の細胞毒性よりも有意に低く、SiQDミセル-CKAP4の生物学的応用に強力な条件を提供します。

この研究では、ヒト肺がん細胞株A549およびヒト腎上皮細胞株293 Tを標的細胞として使用して、SiQDミセルおよびSiQDミセル-CKAP4の標的能力を調査しました。 A549および293T細胞は、それぞれ付着性および半付着性でした。実験中、遠心分離と洗浄を繰り返したため、293T細胞の数が減少しました。そのため、図4に示すように、293T細胞の数はA549細胞の数よりも少なかった。

さらに、A549細胞はp53野生型肺がん細胞株に属することに注意する必要があります。したがって、A549細胞だけでは、SiQDミセル-CKAP4の肺がんに対するターゲティング能力を完全に反映することはできません。 Si QDミセル-CKAP4の臨床応用のための確固たる実験的基礎を提供するために、p53陰性細胞株（H1299など）に対するSi QDミセル-CKAP4のターゲティング能力とイメージング効果をテストするために、さらなる研究が行われます[22]。

結論

この研究は、Piらによって報告されたSiQDミセルを改善および修正しました。水分散性SiQDミセル-CKAP4を調製します。 Si QDミセル-CKAP4は、平均水力直径が約78.8nmの球状粒子でした。 Si QDミセル-CKAP4のUV-可視吸収は、200〜500nmの範囲でした。 330 nmの励起波長では、640nmの強い蛍光が蛍光発光スペクトルで観察されました。 Si QDミセル-CKAP4は、invitroおよびinvivoの両方で肺がん細胞および肺がん組織に対して優れたターゲティング能力を示しました。さらに、in vivo蛍光イメージングアッセイは、Si QDミセル-CKAP4が肝臓で代謝され、腎臓で排泄されることをさらに示しました。細胞毒性およびH＆E染色アッセイは、SiQDミセル-CKAP4がinvitroおよびinvivoの両方で高いバイオセーフティを示したことを示しました。 Si QDミセル-CKAP4は、肺がんの特に標的とされた造影剤であり、将来、肺がんの外科的ナビゲーションのための蛍光造影剤になると期待されています。

データと資料の可用性

現在の作業のデータと分析は、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

Si QD：

Si量子ドット

Si QDミセル-CKAP4：

CKAP4抗体結合Si量子ドットミセル

Dodecyl-Si QD：

ドデシルで不動態化されたSiQD

BSA：

ウシ血清アルブミン

THF：

テトラヒドロフラン

DMEM：

ダルベッコの改良イーグル培地

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

FBS：

ウシ胎児血清

TEM：

透過型電子顕微鏡

DLS：

動的光散乱

XPS：

X線光電子分光法

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

XRD：

X線回折

SPF：

特定病原体除去

DAPI：

4 '、6-ジアミジノ-2-フェニリン-ドール

H＆E：

ヘマトキシリンおよびエオシン