タンパク質検出用の全金属テラヘルツメタマテリアルバイオセンサー

はじめに

今日、医師は通常、さまざまな検査のために病院の患者から血清を収集します。腫瘍検出[1,2,3]やウイルス検出[4,5,6]など。タンパク質は多くの腫瘍マーカーの構成要素であるため、腫瘍検出の予備的な方法はタンパク質検出です。情報は血清中に存在します。血清アルブミンは、血漿中に最も豊富に含まれる（52〜62％）総水溶性画分タンパク質です[7、8]。さらに、血清アルブミンの栄養的および生理学的機能は、それらを必須の生体高分子として作ります。最も人気のある血清アルブミンの1つとして、ウシ血清アルブミン（BSA）は多くの研究分野で使用されています。したがって、BSAの検出に関する研究は非常に重要です。電気化学インピーダンス分光法[9]、キャピラリー電気泳動[10]、光散乱技術[11]など、BSAの濃度を検出および決定するための多くの方法があります。しかし、それらはすべて、複雑な手順、再現性の低さ、時間のかかるなど、いくつかの欠点があります。したがって、新しいバイオセンサーの開発は非常に重要であり、非常に需要があります。

テラヘルツ波は、マイクロ波と赤外線の光波の間にあり、電子機器からフォトニクスへの移行領域にあります。光波と比較して、このバンドの光子のエネルギーは非常に低いです。これは、テラヘルツ波が生体分子に放射線電離損傷を引き起こさないことを意味します。多くの生体高分子は、テラヘルツ帯に固有の指紋も持っています[12、13、14、15]。したがって、テラヘルツ波はバイオセンシングの分野でかなりの注目を集めています[16、17]。

メタマテリアルは、サブ波長構造で構成される人工電磁材料です。それらの独特の電磁共鳴は、負のRI [18、19]、電磁的に誘発された透明性[20、21]、および極端な環境感度[22、23]などの多くの特性を持っています。周囲の環境に敏感なメタマテリアル、特にサブ波長の金属構造で構成されるメタマテリアル[24、25、26]は、さまざまな生体分子を検出するために広く使用されています。テラヘルツ波とメタマテリアルの組み合わせは、生物医学分子の新しい検出方法を提供します。これは、ラベルのない検出を実現するだけでなく、既存のセンサーの分解能の限界を更新します。さらに、化学試薬を使用せずに少量の分析物を使用して、検出を簡単かつ迅速に完了することができます。

THz周波数では、メタマテリアルの生成は通常、ミクロンレベルの処理方法に依存します。フォトリソグラフィー[27]または電子ビームリソグラフィー[28]は、主にマイクロナノパターンをフォトレジスターから機能性材料の表面に転写するために使用され、次にウェット[29、30]またはドライエッチング[31、32]が必要です。メタマテリアルの最終処理を完了します。上記の手順により、優れたグラフィックスの構築を実現できますが、残念ながら、これらの方法のほとんどは、高価な処理装置、高水準の操作環境、および面倒な処理手順を必要とします。レーザー穴あけ[33、34]は、最初の実用的なレーザー加工技術であり、レーザー加工の主要な応用分野の1つでもあります。レーザー光線は空間と時間に非常に集中しています。レンズで焦点を合わせると、スポット径をミクロンレベルまで小さくすることができ、レーザー出力密度は10 ⁵ –10 ¹⁵ W / cm ² 取得できる。このような高出力密度により、レーザー穴あけはほとんどすべての材料で実行できます。私たちの知る限り、メタマテリアルバイオセンサーの製造にレーザードリル技術を適用するのはこれが初めてです。これにより、メタマテリアルバイオセンサーの処理コストを大幅に削減し、実用化を促進できます。

この研究では、全金属メタマテリアルに基づくタンパク質検出用の高感度テラヘルツバイオセンサーが提案され、理論的にシミュレートされ、実験的に実証されました。この装置は製造が簡単で、費用効果が高く、非常に安定しています。それはステンレス鋼材料で構成され、レーザー穴あけ技術を使用して製造されました。最初に、このメタマテリアルセンサーは、有限積分法を使用してシミュレーションおよび分析され、屈折率感度が計算されました。次に、このTHzメタマテリアルバイオセンサーを製造して測定しました。実験により、このセンサーの外部環境に対する高感度が確認されました。バイオセンサーの有効性を評価するための検出物質としてBSAが選択されました。ヒル式を使用して、実験データを適合させました。 72.81 GHz /（ng / mm ² の検出感度 ）および0.035 mg / mLの検出限界（LOD）が得られました。バイオセンサーの信頼性を検証するために、測定を3回繰り返しました。

デザイン

図1aは、提案されている全金属メタマテリアルテラヘルツバイオセンサーの構造を示しています。厚さ50μmのステンレス鋼板（導電率1.4×10 ⁶ ）に、x方向とy方向に周期的に配置された中空のダンベルパターンを形成しました。 S / m）。期間サイズ P _x および P _y ユニット構造はそれぞれ500μmと300μmです。中空ダンベルの長さ L とギャップ H それぞれ294μmと60μmです。半径 R 中空ダンベルの両端の円の数は60μmです。バイオセンサーは、すべて金属の構造設計であり、従来の誘電体基板はありませんでした。テラヘルツ波は、メタマテリアルバイオセンサーの表面に垂直に入射します。

a バイオセンサーの3次元配列図と細胞構造図。構造パラメータは P です _x =500μm、 P _y =300μm、 L =294μm、 H =60μm、 R =60μm。 b バイオセンサーのシミュレートされた伝達

メソッドとシミュレーション

次に、有限積分法（商用ソフトウェアCST）による3次元全波電磁界シミュレーションを以下のシミュレーションに使用しました。 x では周期境界条件が適用されました および y z の波の伝播方向には、完全一致層が使用されました。 。図1aの右上隅に示されているように、入射電磁場の波数ベクトル k _z z を伝播する平面波でした -軸、および電場と磁場は y に沿って分極されました -軸と x -それぞれ軸。図1bに示すように、0.48THzに透過ピークがありました。

この共鳴ピークの生成の物理的メカニズムを研究するために、共鳴ピーク周波数でのバイオセンサーの表面電流と磁場がシミュレートされました。図2の左側に示すように、入射電磁波は y に沿って偏波されました。 軸、開口部の両端で電荷振動を誘発し、電気双極子をもたらします。電荷の振動は、開口部を構成する2つの円形の穴の縁に沿った逆回転電流の振動を伴っていました。これにより、1対の逆向きの面外磁気双極子が生成されました。図2の右側に示されているように、 z には明らかな反対の磁気双極子のペアがありました。 トロイダルダイポールを形成するために端から端まで接続された軸。したがって、メタマテリアルの応答は、電気双極子とトロイダル双極子の組み合わせによって支配されていました。

0.48 THzでのシミュレートされた表面電流分布図と磁気分布図（y =0μm）

センサーの性能は構造パラメーターの影響を受けるため、設計手順中に構造パラメーターを最適化する必要があります。図3は、透過スペクトルに対する構造サイズの変更の影響を示しています。図3aに示すように、中空ダンベルの長さが290μmから298μmに増加すると、透過スペクトルのピーク周波数は0.48THzから赤方偏移しました。図3bに示すように、中空ダンベルのギャップが56μmから64μmに増加すると、透過スペクトルのピーク周波数は0.48THzから赤方偏移しました。 L として および H 増加すると、共振ピークはそれぞれ低周波数と高周波数に向かって移動し始めました。円の半径が56から64μmまで変化し、ステンレス鋼の厚さが40から60μmまで変化すると、共鳴ピークの位置がわずかに変化しました。したがって、中空ダンベルの長さを調整することで、メタマテリアルバイオセンサーの共振周波数を調整する方が簡単です L 中空ダンベルの隙間 H。

a の透過スペクトル 異なる長さ L 、 b ギャップ H 、 c 半径 R 、および d ステンレス鋼板の厚さ

入射角と偏光角が透過スペクトルに与える影響を調べることも非常に重要です。電磁波を垂直に入射させた後、入射角と偏光角を変えました。これらの角度の定義を図4aに示します。入射角はθを意味します _i y–z平面で、偏光はθです。 _p x–y平面で。図4bに示すように、入射角が0°から15°に変化したとき、共振ピークの周波数の差はわずか9GHzでした。図4cに示すように、偏光角が0°から15°に増加すると、共鳴ピーク周波数の差はほぼ0 GHzでしたが、共鳴ピーク振幅は約0.1減少しました。これは、バイオセンサーが入射角と偏光角の変化にほとんど鈍感であることを示しており、これは実際のバイオセンサーアプリケーションに有益です。

a 入射角の変化の概略図θ _i 偏光角θ _p 。透過スペクトルと b 入射角と c 偏光角

バイオセンサーの検知性能を調べるために、図5aに示すように、このメタマテリアルバイオセンサーに120μmの分析物の薄層を追加し、図5aに示すように、分析物の屈折率が変化したときに、このメタマテリアルバイオセンサーのさまざまな透過スペクトルをシミュレートしました。 。5b。 RI感度 S RIユニットに対する透過ピーク位置の変動の比率として定義されました（ S =Δ f /Δ n ）。分析物のRIが増加すると、共鳴ピーク周波数が赤方偏移しました。次に、各RIに対応する共振ピーク周波数シフトを収集しました。良好な直線性が観察されました。図5cのフィッティング結果は、RIに対する感度が294.95 GHz / RIUであることを示しています。

a 分析物の120μm薄層を備えたメタマテリアルバイオセンサーモデル図の断面図と上面図。 b 分析物のRIの変化がバイオセンサーの透過スペクトルに及ぼす影響。 c ピークの周波数シフトと対応するRIの対応する線形フィット

センシングパフォーマンスは、性能指数（FOM）を使用して定量化されました。これは、次のように定義されています。

ここで S は感度であり、FHWMは共振ピークの半値全幅です。このバイオセンサーのFOMは4.03でした。

ほとんどのメタマテリアル構造では、通常、基板として誘電体材料を使用します。しかし、この論文で提案されたこのメタマテリアルバイオセンサーは、すべてステンレス鋼のデザインを備えたすべて金属のメタマテリアルに基づいており、空気が基板として使用されました。ポリエチレンテレフタレート（PET）、石英、シリコンなどの従来の誘電体材料と比較して、空気のRIは最も低くなります。基板の役割を評価するために、これらのメタマテリアルバイオセンサーは、異なる基板を使用して再度シミュレーションされ、屈折率感度とFOM値が続いて計算されました。図6に示すように、基板のRIが増加すると、センサーのRI感度とFOMが低下し始めました。この結果は、基質RIが低いバイオセンサーの方がセンシング性能が優れていることを示しています。

異なる基板を使用した場合の感度とFOM

バイオセンサーの検知原理をさらに調査するために、図7に示すように、電界分布図をシミュレートしました。シミュレートされた電界分布の上面図と側面図は、電界エネルギーが主にステンレス鋼の一部に集中していることを示しています。穴。したがって、分析物が穴に追加されたことを確認することが重要です。

シミュレートされた電界分布。 a 上面図、 b 側面図（ y =0μm）

表1は、提案されたセンサーのRI感度とFOMを要約し、他の報告された研究と比較しました[35、36、37]。他のTHzセンサーはすべて、従来のフォトリソグラフィープロセスに基づいています。私たちが設計したステンレス鋼のメタマテリアルバイオセンサーは、安価なレーザー穴あけ技術を使用して優れたセンシング性能を備えていたことがわかります。

実験

資料とサンプル準備

次に、提案されたTHz mmetamaterialセンサーのバイオセンシング能力を実証するために、実験でタンパク質検出を実行しました。 BSAおよびPBSバッファーは両方ともSigma-Aldrichから購入しました。 BSA溶液はPBSバッファー（pH =7.4）で処方されました。

作製したメタマテリアルバイオセンサーの顕微鏡画像を図8に示します。メタマテリアルバイオセンサーの全体のサイズは12mm×12mmでした。

作製したバイオセンサーサンプルの顕微鏡写真

処方されたBSA溶液の濃度は、0.2 mg / mL、0.5 mg / mL、2.0 mg / mL、および4.0 mg / mLでした。分析物は、液体堆積法によってバイオセンサー表面に加えられた。毎回、150μLのBSA溶液をピペットガンでバイオセンサー表面に移し、バイオセンサーを40℃の加熱テーブルで乾燥させた。バイオセンサーを40℃に加熱すると、タンパク質フィルムがより速く、より均一に形成されました。異なる濃度のBSA溶液を変更する前に、ステンレス鋼シートを脱イオン水に入れ、超音波バイブレーターで振動させて、前のプロセスのタンパク質フィルムを取り除き、このmmetamaterialバイオセンサーの表面をきれいにしました。図9は、タンパク質の添加と乾燥のプロセスの写真と顕微鏡写真を示しています。図9aに示すように、ステンレス鋼板はきれいでした。次に、図9bに示すように、1つの濃度のBSA溶液をステンレス鋼板の表面に添加しましたが、溶液はこのバイオセンサーの表面に留まり、水面張力の影響で穴を通過します。加熱乾燥後、図9cに示すようにBSAフィルムの薄層が形成されました。

さまざまなテストステップでのステンレス鋼の写真： a 後のメタマテリアルバイオセンサー 超音波洗浄および乾燥、 b 150μLのBSA溶液（0.2 mg / mL）を追加し、 c 乾燥;ステンレス鋼板の d の顕微鏡写真 サイドウォールと e BSAを追加する前の表面。ステンレス鋼板の f の顕微鏡写真 サイドウォールと g BSA溶液（0.2 mg / mL）を加えて乾燥させた後の表面

ステンレス鋼の穴の内部の状況を観察するために、ステンレス鋼の片側を切り取り、穴の片側を明らかにして顕微鏡で観察しました。図9d–gに示すように、BSA溶液を滴下して乾燥させると、BSAの薄層がステンレス鋼の穴に追加されました。これは主に、穴の直径がBSAタンパク質。これは、検出される分析物がバイオセンサーの検出感度の高い領域に入る可能性があることを証明しています。これにより、このメタマテリアルバイオセンサーの感度が大幅に向上する可能性があります。

スペクトル測定

すべてのスペクトル測定は、連続波THz分光システム（TeraScan 1550、Toptica Photonics AG）を使用して実施されました。このシステムは、図10に示すように、デュアルレーザー制御（DLC）スマートエレクトロニクス、2つの分散フィードバック（DFB）レーザー、2つのファイバー結合InGaAsフォトミキサー、および4つの90°軸外し放物面鏡で構成されていました。 90°の軸外し放物面鏡を通してサンプルに焦点を合わせました。すべての透過スペクトルは、スキャン時間を短縮するために高速スキャンモードで動作する10 msの積分時間で、40 MHzのステップサイズで50〜1220GHzをスキャンすることによって取得されました。テラヘルツ波の偏波は、ダンベルリングの開口方向に沿っていました。

実験で使用した連続波テラヘルツ分光計の概略図

実験結果とディスカッション

メタマテリアルバイオセンサーのタンパク質検出実験は、4つの濃度のBSA溶液を使用して実施されました。実験を通して、BSAソリューションの各グループが低いものから高いものへと順番に追加されました。すべての測定は3回繰り返されました。

図11aに示すように、BSA溶液の濃度が高くなると、共鳴ピーク周波数が赤方偏移しました。この傾向は、シミュレーション結果と一致しています。共鳴の強さの減少は、BSAタンパク質によるテラヘルツ波の吸収によるものでした。

a さまざまなBSA濃度で測定されたスペクトル。 b BSA実験のヒルフィット

周波数シフトとBSA溶液の濃度の関係は線形ではなく、生物学的実験で一般的です[38、39]。ヒルモデルは、メタマテリアルバイオセンサーと生体分子の間の結合能力を特徴づけることができます。したがって、図11bに示すように、Hillモデル[40]を使用して実験データを適合させました。ヒルの式は次のように記述されます。

ここで、最大ピーク周波数シフトΔ f _max は飽和値、[BSA]はBSA溶液の濃度、 n はヒル係数であり、 K _D は解離定数です。

図11bに示すフィッティング曲線を使用して、ヒル係数 n は0.83と計算され、解離定数 K _D 2.87 mg / mLと計算されました。さらに、Δ f _max は約166GHzであり、飽和濃度での最大ピーク周波数シフトを示しています。共振周波数ピークのヒルフィッティングの結果により、実験の信頼性と精度が確認されました。

バイオセンサーの感度Sは次のように推定されました[41]：

ここで、Δ f _max は166GHzでδ _max はBSAの面密度です。 δ _max [41]によって決定されました：

ここで M _BSA =66,430 g / molはBSAの推定分子量です[42]、 N _A =6.02×10 ²³ mol ^-1 はアボガドロの数であり、 P _BSA =6.96 nm [43]は、1つのBSA分子の平均の長さです。 δ _max 2.28 ng / mm ² でした バイオセンサーのBSA検出感度は72.81GHz /（ng / mm ² 。

K _D ヒルモデルを使用して得られた結果は、解離定数がBSA、および検出限界（LOD） C と強く関連していることを示しました。 _lim BSAの計算式は、次の式[44]を使用して計算されました。

ここで S _f は2GHzのスペクトル分解能です。式（5）は、解離定数が小さいほど検出限界が低くなることを示しています。したがって、 C _lim 0.035 mg / mLと計算されました。

表2は、報告された研究と比較したバイオセンサーのBSAセンシング性能を示しています。実験では、BSA溶液の最低濃度は0.2 mg / mLであり、10.8GHzの周波数変化が得られました。参照と比較して。 [45,46,47]、同じBSA濃度で比較的高い周波数変化が達成されました。ヒルの公式は、メタマテリアルバイオセンサーのデータを分析するために適用されました。計算されたLOD0.035 mg / mlは、参考文献のLODよりも大幅に優れていました。 [45]。これらはすべて、提案されている全金属THzメタマテリアルバイオセンサーが多くの生物学的および化学的用途で優れた性能を発揮することを予測しています。

ステンレス鋼バイオセンサーの優れた検知性能に基づいて、ステンレス鋼バイオセンサーを特定の抗体で修飾して、将来的に特定の抗原検出を実現することができます。また、ステンレス鋼のバイオセンサーの厚さはわずか50μmです。マイクロフルイディクス技術とテラヘルツ分光法の開発により、将来的には生体内でのリアルタイム測定の適用が期待されています。

結論

結論として、全金属メタマテリアルに基づくテラヘルツバイオセンサーを使用してタンパク質濃度を測定しました。バイオセンサーはステンレス鋼でできていて、レーザー穴あけ技術によって準備されました。 CST電磁シミュレーションソフトウェアを使用して計算された最大RI感度とFOMは、それぞれ294.95 GHz / RIUと4.03です。サンプルは、連続波THz分光計を使用して特徴付けられました。実験結果によると、BSA分析物溶液の場合、検出感度と検出限界は72.81 GHz /（ng / mm ² ）です。 ）および0.035 mg / mL。このバイオセンサーは、形状が小さく、検出感度が高く、検出限界が低く、再利用性があり、製造が容易で費用効果が高いという利点があります。これらの研究結果は、生体分子の検出や病気の診断における将来のアプリケーションにとって非常に重要です。

データと資料の可用性

すべてのデータは制限なしで完全に利用可能です。

略語

THz：

テラヘルツ

RI：

屈折率

FOM：

性能指数

BSA：

ウシ血清アルブミン

PET：

ポリエチレンテレフタレート

DLC：

デュアルレーザー制御

DFB：

分散フィードバック

LOD：

検出限界