HepG2肝癌細胞のためのNIR照射Cs0.33WO3ナノ粒子の温熱療法線量の考案

はじめに

世界的に、2018年に沿って、凶暴な癌疾患は約1,000万人の命を奪い、推定1,800万人の新しい症例を追加しました[1]。これまでのところ、化学療法、放射線療法、外科的切除、またはこれら3つの調整された組み合わせは、治療を受けた癌患者の40％をわずかに超える5年生存率の改善を説明していますが[2、3]、化学療法およびイオン性の毒性および有害な性質爆撃は必然的に、脱毛、心毒性、不妊症、染色体異常などの多くの副作用を引き起こします[4、5]。このような生命にかかわる結果は、NPを組み込んだ化合物を含む患者に優しい治療薬の開発を強く促しています。

100 nm未満のサイズスケールでの固有の材料システム、構造、形状、および原子化学量論に基づくナノテクノロジーは、量子化の現象によって強化された前例のない化学的、物理的、および生化学的特性をもたらし、生医学[6、7]。化学療法の欠点にもかかわらず、送達担体として機能するNPは、罹患腫瘍における薬物放出の選択性を改善し、腫瘍細胞による薬物取り込みを促進し、健康な組織における累積毒性を大幅に低減します[8、9]。また、一連のNPベースのイメージングモダリティによって生成される画質は、生体内分布を明らかにし、薬物の取り込みを監視し、腫瘍の位置を特定し、治療の有効性を評価するために、より高い感度、より細かい空間分解能、およびより良い深さの浸透によって大幅に向上します[10]。診断機能に加えて、高周波（RF）アブレーションや光熱的にレンダリングされた温熱療法などの固有の物理的特性を利用したNPは、効率を高めて目的の場所に損傷をさらに誘発する可能性があります[11、12、13]。 2つ目は、その部位特異的な投薬、より低い程度の痛み、より低い副作用、および組織燃焼のリスクの大幅な低減よりも一般的に好ましいです。

これまで、光照射時に温熱療法を誘発できるNP材料システムには、金（Au）、タングステン酸セシウム（CsWO ₃ ）が含まれます。 ）、酸化鉄、硫化銅、グラフェン、カーボンチューブであり、細胞外または細胞内の温度をその場で上昇させることにより、癌細胞に致命的な損傷を与える可能性を示しました[14、15、16、17、18]。 NPで強化されたRFアブレーションと同様に、フォトニックソースの入射パワー密度のレベルは、臨床の安全性と患者の快適さにとって重要な問題であり[11]、VISと400〜980 nmのNIR波長は、0.2〜0.726 W / cm ² 2013年に発表された非イオン化放射線防護に関する国際委員会（ICNIRP）によると[19]。それにもかかわらず、以前のin vitroがん細胞研究から報告された光パワー密度のほとんどは、皮膚組織の安全限界をはるかに超えていました。脆弱性。たとえば、がん細胞の効果的な破壊を示した金（Au）NPのNIR光パワー密度は、2〜80 W / cm ² の範囲です。 10分（分）以下の照射時[13、14、20、21、22]。同様に、酸化グラフェン[18]、白金鉄（FePt）[23]、NaYF ₄ などの他の材料システムの組み合わせ ：Yb、Erナノクリスタル[24]には150 mW / cm以上が必要 ² インストルメンタル展開用。

in vitro実験では比較的探索されていない材料であるため、いくつかの研究では、NIR照射されたCsWO ₃ による子宮頸がん細胞（Hela）の消滅が報告されています。 0.72 W / cm ² 以上のNP [15、25、26]は、ICNRPによって設定されたNIR波長の皮膚組織の曝露限界の近くにあり、長期間の曝露で健康な組織に有害な影響を与える可能性があります[19]。さらに、過去の研究では、NP濃度の処理線量、光曝露の持続時間、および光強度の組み合わせによって生じた培地の温度は、健康なヒト細胞には耐えられない40°Cをはるかに超えていました。がん細胞の詳細は描写されていませんでした。

CsWO ₃ NPは、800nmから2400nmまでのNIR波長の範囲で非常に吸収性が高く[27]、生物医学的用途に機能的に適しています。癌細胞を排除する際の優れた効果が実証されているにもかかわらず、細胞毒性はまだほとんど知られておらず、低細胞毒性のNP濃度、短時間の照射、および皮膚組織の安全な光曝露の範囲内での光パワー密度の投与式の提供はまだ不足しています。

ここでの調査研究では、非細胞毒性NP濃度と光パワー密度を利用して、直径5.2 cmのペトリ皿で培養されたHepG2肝癌細胞を、皮膚組織の光曝露限界内で十分に維持しながら、消滅させる可能性をinvitroで評価しようとしています。通常の人体温度36.5°Cでの細胞培養培地の温度。詳細には、Cs _0.33 WO ₃ 120 nmを中心とする平均フィーチャサイズのNPは、一連のレドックス、熱アニーリング、および湿式粉砕プロセスを使用して合成され、その表面形態、結晶化度、および光学的および時間的な光熱特性によって特徴付けられました。さらに、HepG2がん細胞の生存率に対する、可変線量パラメータ、照射時間、NPの濃度、および中心波長980nmで動作するNIR照射の光パワー密度の光熱効果を調べて判断しました。安全治療用量の組み合わせを考案します。

メソッド

この研究では、ヒト原発腫瘍に由来する第102世代のHepG2肝がん細胞株を実験モデルとして培養し、NIRを照射した自家製Cs _0.33 による細胞毒性を評価しました。 WO ₃ NPを作成し、皮膚組織への曝露の安全限界内で、毒性のないNP濃度で、さまざまな熱量の治療効果を評価します。

Csの合成 _0.33 WO ₃ NP

図1の左側のパネルは、酸化セシウム（Cs _0.33 ）の合成手順のフローチャートを示しています。 WO ₃ ）NP素材。簡単に言えば、前駆体化学物質、（（NH ₄ ） ₂ WO ₄ ）（Alfa Aesar、純度99.9％）とCsCl（Alfa Aesar、純度99.9％）を別々に100 mlのDI水に溶解し、25°Cで250ラウンド/分（rpm）で一定に攪拌しながら混合しました。磁気的に作動するスピナーを1時間（hr）。攪拌後、混合液を含むビーカーの温度を180℃に調整し、溶液の水分が完全に蒸発するまで焼きました。得られた乾燥白色粉末は、Cs _0.33 の最終前駆体でした。 WO3材料。チラーをオンにした状態で、前駆体粉末を含む石英ボートを高温炉管の中央にロードし、炉管内の圧力を0.08トルにしました。その後、前駆体は、ガスの組み合わせH ₂ の流入の導入とともに、500°Cの温度で加熱されます。 およびN ₂ 、酸化還元反応を促進するために、毎分90〜10標準立方センチメートル（SCCM）の比率で。 1時間後、H ₂ の入口 ガスがオフになり、N ₂ の流れ ガスを100SCCMに調整し、炉の温度を800°Cに上げて1時間の熱アニーリングを行います。プロセスが完了した後、冷却装置と温度制御された炉の電源を切り、石英ボートを周囲温度に達するまで冷却し、炉管から取り外しました。石英ボートから得られた濃紺の粉末は、ミクロン（µ）サイズのCs _0.33 です。 WO ₃ 粉。粉末顆粒の特徴サイズをさらに縮小するには、15gのμ粉末で構成される150gの混合溶液、粒子の凝集を防ぐための3.8 gの共重合体ベースの分散剤、10μlの消泡剤およびDI水を準備し、600 gのジルコニアビーズが入ったサンプルボウルに注ぎ、ナノグラインダー装置（Justnanotech Co.、台湾）のチャンバーに取り付けました。速度と温度を毎分2400ラウンド（RPM）、15°Cに設定し、µpowderを0.1 mm ZrO ₂ で粉砕してNPを生成します。 ビーズを4時間、0.05 mm ZrO ₂ さらに4時間ビーズ。過度の流体粘度や材料の物理的サイズの不規則な変化を避けるために、各粉砕プロセスの合計時間は4時間を超えません。粉砕プロセス後の最終溶液は、その後のすべての特性評価と実験のために、0.22μmのポアフィルターでふるいにかけられました。 Cs _0.33 の蛍光バージョン WO ₃ NP（fNP）は、次のプロトコルを使用して作成されました。 28 mg / mlの濃度の2mlのフルオレセインと2mlのCs _0.33 で作られた溶液 WO ₃ 1.5 mg / mlのNP溶液をビーカーで調製し、超音波シェーカーのボウルに15分間入れました。続いて、NP溶液と分散剤を1：1.25の比率で混合し、15分間超音波振とうしました。次に、得られた溶液をＤ．Ｉ．で洗浄した。水を加え、10,000rpmで15分間遠心分離します。使用する前に2回繰り返します。

材料合成、NPとの細胞インキュベーション、および癌細胞の光熱アッセイの実験手順の概略図。 BCL、TEn、PDは、それぞれ両凹レンズ、サーマルエンクロージャー、ペトリ皿の略語です。赤い矢印は、ビームプロファイル測定の場所を示しています

材料の特性評価

その後、Cs _0.33 の特性評価 WO ₃ NPの統計的特徴サイズ、結晶構造、構造形態、輪郭形状、VIS-NIR光吸収を含むNPは、ゼータ電位分析（ZS90、Malvern、英国）、XRD（D2 Phaser、Bruker AXS GmbH、ドイツ）、SEMを使用して実施しました。 （SU-5000、日立、日本）内蔵エネルギー分散型分光分析（EDS）、TEM（JEM-2100F、JEOL、日本）、動的光散乱（DLS）（Delsa Nano C、ベックマンコールター、米国）と組み合わせて、UV-VIS-NIR分光計（V-750、日本電子）。 XRDスペクトルは、毎分4°のスキャン速度で20°から80°の角度スパン内でサンプル上でX線をスキャンすることによって取得されました。サンプルからの走査角度依存回折の信号が決定され、Cs _0.32 の標準XRDスペクトルと比較されました。 WO ₃ 粉末回折標準に関する合同委員会（JCPDS）カード番号83-1334から。 NPの光熱特性の時間依存性を確認するために、波長980 nmのNIRレーザーと温度測定プローブで構成される簡単な実験装置を設置して、NIR照射溶液によって生じる温度の状態を調べました。調査ソリューションには、D.I。水で希釈したNPs溶液と細胞培養培地中のNPs溶液の混合物。ペトリ皿のサンプルの光ビームの直径は、ペトリ皿の表面全体を覆うように拡大され、0.05 W / cm ² を生成しました。 推定光パワー密度では、それ以外は2 W / cm ² で無傷のままでした 。図1の右側のパネルに示されている光学セットアップは、NIR照射を実行するために使用されます。光学システムの中心にあるのは、両凹レンズに向けられたNIRレーザービームで、ビーム径を4mmから5.2cmに拡大します。これは、36.8°に設定されたホットプレートに置かれたペトリ皿の表面径に相当します。 C、これは細胞増殖の生理学的温度です。また、ペトリ皿はプラスチックの円筒形の囲いで囲まれており、周囲環境と媒体の温度を平衡化するのに役立ちます。追加ファイル1：図S1は、ビーム開口部の出口で測定されたNIRレーザービームの光強度のマッピングを示しています。これは、図1のレーザービームの横にある赤い矢印で示されています。ビームプロファイルは、光学強度とペトリ皿の開口部全体にわたるライトフィールドの均一性を検証します。

細胞毒性および光熱アッセイ

細胞培養のサイクルを開始するには、ハムの栄養混合物F-12とダルベッコの改変イーグル必須培地（HDMEM）、ウシ胎児血清（FBS）50 ml、L-グルタミン5mlで構成される培地溶液500mlを使用します。そして、孔径0.22μmのメッシュフィルターで滅菌した5mlのP / S（ペニシリン-ストレプトマイシン）を用意しました。直径10cmまたは5.2cmの細胞を含むペトリ皿に対応して8mlと2mlの培地を充填し、初代培養と継代培養に使用し、5％CO _{2 そして37°Cの温度で。細胞増殖の観察と培地の更新は2日に1回行われました。}

（1）外部入力なしのコントロール、（2）唯一のNIR照射、（3）NPとのインキュベーション、および（4）余波NIR照射と一緒のNPとのインキュベーションを含む細胞ア​​ッセイの場合の生存率を取得するには、培養皿の培地を吸引し、0.4 mlのトリプシンを培養皿に加え、約10分間インキュベーターに入れます。皿壁からの細胞の剥離が確認されたら、細胞含有培地10μlを培養皿から取り出し、マイクロ遠心チューブ内のトリパンブルー溶液10μlに加え、残りの浮遊NPの除去をいくつかの方法で行いました。リン酸緩衝液（PBS）での洗浄回数。その後、注入穴から10μlの染色細胞溶液をカウントプレートに充填することで細胞のカウントを行い、実体顕微鏡の焦点面で細胞を観察し、手動カウンターでカウントすることができます。細胞生存率に関するすべての図に示されている各データポイントは、3回の実験的試行の平均でした（ N =3）プラス標準偏差のマージン。

NPの細胞毒性と細胞生存率に対するその光熱効果の評価の準備として、5.2 cm皿の培地を取り除き、新しい培地に適切な量のNP溶液を再充填して、一連の試験濃度を作成しました。 2 mg / ml、1.5 mg / ml、1 mg / ml、0.5 mg / mlを使用し、実験前に1日間インキュベートします。

光熱アッセイの前に、細胞毒性の評価を実施して、一連のNP濃度に対する細胞の応答を調べ、次のように実施しました。細胞とNPを含む培地をインキュベーターから取り出し、吸引した。 1ミリリットルの予熱したPBSを使用して、癌細胞を洗浄し、残りの浮遊CsWO ₃ を吸引しました。 エンドサイトーシスを受けなかったNP。この手順を数回繰り返して、新しい培地でのNPによる温度上昇が細胞死の可能性を引き起こさないようにします。光熱処理後、細胞毒性および細胞の光熱アッセイのためにカウント手順を実行しました。

結果

Cs _0.33 の吸光度と光熱特性 WO ₃ ナノ材料は、結晶構造、アニーリング後の温度、原子の化学量論、および粒子の特徴サイズに大きく依存します[28、29]。

Cs _0.33 の表面形態を特徴づける WO ₃ 図2aの赤い矢印で示されている円柱状の六角形の象徴的な構造を視覚的に確認するために、倍率10,000倍のµpowder、SEM画像を取得しました。さらに、TEM画像は、図2bのμ粉末顆粒の輪郭形状と特徴サイズを示しています。特徴サイズは約1μm以下です。 NPの棒状の形状と120nmを中心とするナノスケールの特徴サイズのDLS分布ヒストグラムも検証され、図2cと対応する挿入図のTEM画像に示されています。また、XRDを使用したµpowderとNPの結晶特性を図2dに示します。上部パネルのµpowderのXRDスペクトルからわかるように、（002）、（102）、（200）、（112）、（202）、（212）、（004）、（220）に沿った結晶化の象徴的な平面）、（222）、（204）、（400）、および（224）は、Cs _0.32 の標準スペクトルとよく一致します。 WO ₃ 粉末回折標準に関する合同委員会（JCPDS）カード番号83-1334から。 µpowderのフィーチャサイズが120 nmに減少すると、すべての回折ピークの強度が単調に減少し、平面（102）や（220）などの強いNIR吸収を示すいくつかの特徴的なピークがスペクトル内で目に見えないほど小さくなります。同様に、図2eに示すように、原子成分であるセシウム（Cs）、タングステン（W）、および酸素（O）を特定すると、その原子の存在が確認されるだけでなく、CsとWの原子の割合の比率0.315が認証されます。 、最初に設計された化学量論に非常に似ています。

物理的および材料的特性。 a SEMおよび b µ粉末のTEM画像 c NP特徴サイズのDLS分布ヒストグラム、 d µpowderおよび120 nm NPのXRDスペクトル、および e 原子組成のパーセンテージを含むEDSスペクトルが表示されます。 a のスケールバー 、 b 、 c それぞれ1.5μm、200 nm、100nmです

材料の特性評価に加えて、NPの吸光度スペクトルと温度の経時的な光熱変調を測定し、図3に示します。（a、b）では、NIR吸光度の依存性と、NIRによって引き起こされる温度上昇のプロファイルを示しています。 -NP濃度の関数として照射されたNP溶液が示されています。ここでは、たとえば1 mg / mlの時間経過温度プロットが40°Cを超え、少なくとも1時間安定して維持され、材料の光熱安定性と耐久性が確認されます。 。同様に、図3cの時間経過温度プロファイルは、190分以内の5回の繰り返しサイクルを示しており、NP材料の光熱応答性を確認しています。図3dでは、インキュベーターから取り出し、ホットプレートに配置してNIR照射を行った、培地とNPを組み込んだ培地の時間的温度プロファイルは、約37°Cで10分間安定します。 NIRを照射した純粋なNP溶液の温度は、10分後に24.6°Cから33.6°Cまで上昇します。これにより、NPの光熱機能を考慮して、次の実験のNIR照射を10分、30分、60分実施し、実験セッション中のNPの堅牢性を維持し、前臨床試験に適用できる可能性があります。

光学的および光熱的特性。 a b におけるNIR照射NP溶液の吸光度スペクトルと経時温度のプロファイル 、 c キュベットと d ペトリ皿が描かれています。 Exは、ビーム拡張ケースのプロファイルを象徴しています。 1.5 mg / mlのNP濃度と50mW / cmの光パワー密度 ² （ d ）; c でのサイクルあたりのNIR照射の持続時間 15分です

続いて、50 mW / cm ² で1時間および2時間細胞を照射することにより、NIR照射の持続時間およびNP濃度を含む実験パラメーターの非毒性線量を決定しました。 また、濃度が0.5 mg / ml、1 mg / ml、1.5 mg / ml、2 mg / mlのNPと直接相互作用することにより、それぞれ図4a、bに示されています。細胞の生存率は、2時間のNIR照射の過程で95％をはるかに上回っており、980 nmの光子への長期曝露に対する細胞の非毒性、および1.5mg未満の非毒性NP濃度を確認しています。 / mlが決定されました。

実験パラメーターの細胞毒性アッセイ。 a を投与した場合のHepG2細胞の生存率 NIR照射の持続時間、 b さまざまな濃度の120nmNPが表示されます。 NPインキュベーションの期間は1日でした。 3つの実験的試行の標準偏差（ N =3）各データポイントについて示されています

HepG2細胞にほとんど損傷を与えない1.5mg / ml以下で癌細胞を投与する目的は、NPの固有の毒性を示唆することなく、癌細胞に対する光熱量の影響を調べることです。 NIRを照射したNPが癌細胞を排除するための実行可能な解決策になり得るかどうかを調べるために、細胞を1.5 mg / mlのNPと1日インキュベートした後、NIRを1時間照射しました。図5d–fの明視野（BF）光学画像からわかるように、露光時間が1時間（e）または2時間（f）続くと、細胞の数が明らかに減少します。定量的には、照射時間が10分から増加するにつれて、生存率は84.2％から58.4％に単調に減少します。 1時間までであり、線形の傾向線は散乱データポイントによく適合します。これは、照射が2時間続く場合の生存率の20％を予測します。さらに、図5hは、1時間の照射で、光パワー密度が12.5から50 mW / cm ² に増加すると、生存率が73から58％に減少することを示しています。 、癌細胞の破壊における光熱トリガーとしてのNIR照射NPの機能を確認します。

光熱アッセイ。 NIR照射と並行して1.5mg / mlのNP濃度で投与した場合のHepG2細胞の生存率。 a のそれぞれのスケールバー – c トップと d – f BF光学画像の下段は200μmと100μmです。 3つの実験的試行の標準偏差（ N =3）各データポイントについて示されています

さらに、そのような光熱作用が細胞内または細胞外のどちらで起こったかについての不確実性は、fNPを準備し、同じ洗浄およびインキュベーション手順を実行し、fNPの細胞内存在を観察することによって対処された。図6は、共焦点BF（b、e）および蛍光（a、d）画像と、fNPを使用した場合と使用しない場合の細胞の重ね合わせた合成物（c、f）を示しています。明らかに、コントロールとしてfNPをインキュベートしていない細胞は、ごくわずかな緑色蛍光を示します。これは主に細胞の自家蛍光に起因し、画像に見られるすべての細胞質内に緑色蛍光の分布が遍在する実験とは対照的です。コントロールと実験サンプルの画像の平均蛍光強度も定量化され、エンドサイトーシスを受けたfNPの蛍光がコントロールの少なくとも9倍強い図6gのヒストグラムに表示されます。

光学共焦点画像。 a 、 d 蛍光、 b 、 e BFと c 、 f 対応する実験群および対照群として、fNPを使用した場合と使用しない場合のHepG2細胞の複合光学画像を a に示します。 – c トップと d – f g の横の一番下の行 平均蛍光強度のヒストグラム。スケールバーは20μmを表します。レーザー励起波長は488nm

ディスカッション

癌疾患の治療に電磁波を使用する治療用温熱療法の概念は、1900年代初頭にさかのぼり、ある種の悪性腫瘍の治療に成功しましたが、発熱を誘発する抗菌剤の有用性と正確性の欠如のために衰退しましたその場で関心のある局所腫瘍へのアクセス可能性[30]。 1980年代まで、癌細胞に致命的な影響を与える温熱療法後の代謝変化、腫瘍微小循環の変化、酸分解の多くの側面を発見したいくつかのinvitro研究で関心が復活しました[31]。機械論的には、適用温度が> 42°Cのときに癌細胞が壊死し、アポトーシスが減少する直接的な細胞毒性に加えて、冷却能力の低下とpHの低下（<6.8）に伴う血流量の減少により、癌細胞はより感受性が高くなります。加熱し、その結果、より高い細胞死滅率[32、33]。しかし、臨床的には、不正確な非特異的局在化という100年前の欠点のため、温熱療法は、化学療法または放射線療法と同時に適用された場合にのみ、治療効果の向上が見られました[34、35]。

正確なターゲティングとモニタリングを可能にし、表面電荷、蛍光、光熱変換などの幅広い物理的特性を備えたNPベースの材料は、温熱療法のアプリケーションにおけるこのような不正確さのニッチにうまく適合します。ただし、がん細胞研究における多くのNIR照射NP材料の有用性が証明されているにもかかわらず、CsWO ₃ の場合のように、光曝露の安全限界は十分に検討されていないことがよくあります。 NP。 CsWO ₃ ただし、図4bに示すように、NPは、しきい値が1μg/ mlのスケールにあるAg、Au、グラフェンなどの少数の一般的なNP材料と比較した場合、1.5 mg / mlで比較的低い細胞毒性を示します[ 18、36、37]、0.7 W / cm ² が必要です 800nmから2400nmまでの波長範囲での強力なNIR吸収にもかかわらず、Hela細胞を効果的に破壊します[15、25、26]。

この調査研究は、効果的なNIR照射によってトリガーされるCs _0.33 を考案することを目的としています。 WO ₃ NP濃度、照射時間、および皮膚組織のNIR曝露限界内の光出力密度の関数としてのin vitroHepG2がん細胞のNPベースの熱投与式。

実験はNPの合成から始まります。ここで、レドックス反応、アニーリングプロセス、湿式粉砕法を含む段階的な合成手順の概要を図1に示します。レドックス反応では、大きな三元元素（この場合はCs）がWO ₆ の八面体構造のリング 適切な物理的環境で、特異な結晶構造の形成と金属分子化合物への自由電子の取り込みを可能にします。これは、NIR吸収による強力な光熱変換の本質的な理由です[26、27]。また、その後のアニーリングおよび湿式粉砕プロセスは、結晶形成を改善し、粒子の特徴サイズを縮小するのに役立ち、NIR光熱変換をさらに強化しました。その後、合成されたNPソリューションは、120 nmの平均フィーチャサイズ、NIR吸収の重要な最適化を検証し、原子組成を認証する一連の物理的および材料的特性評価を進めました（図2）。さらに、0.5 mg / ml、1 mg / ml、および1.5 mg / mlのゼータ電位の対応する測定値は、-53.2 mV、-54.3 mV、-60.1mVです。一般に、エンドサイトーシスのプロセスは、ほとんどのNPタイプの主要なエントリパスであり、非食細胞のカチオン性およびイオン性NPの両方の取り込み率は、中性エンティティよりも高くなりますが、前者は後者よりも優れたパフォーマンスを示します[38]。また、以前の多くの報告では、負に帯電したNPは非食細胞に対して毒性が低いことがわかりました[39、40]。これは、低毒性を伴う光熱線量に対する過剰な細胞内NP蓄積を考慮すると有益なメリットです。

HepG2セルの光熱分析のトーンを設定するために、光熱ヒーターとしてのNPの堅牢性、周囲環境と平衡状態にある飽和温度での1時間にわたる長期安定性、および5連続サイクルの再現性の評価3時間以内に実証されました（図3b、c）。また、周囲温度（通常は25°C）の影響を排除することにより、癌細胞の投与におけるNPの温熱療法自体の有効性を定量化するために、ホットプレートを37°Cに設定して実験装置のキャリブレーションを実施しました。その上ですべての細胞アッセイが実行され、純粋な培地とNPを組み込んだ培地の時間的光熱特性は37.1°Cのままでした（図3d）。その後、細胞毒性の照射時間とNP濃度への依存性を個別に調べ、図4に示します。これは、2時間以上のNIR照射で細胞死が5％未満であり、1.5 mg / mlが重要なポイントであることを示しています。致死濃度。 NP濃度を1.5mg / mlに固定することにより、これは残りの光熱アッセイ全体で使用され、医療用温熱療法の熱線量は、可変投与時間と光パワー密度の関数として定義されました。図5は、0時間、1時間、および2時間のNIR照射が実施された場合の、低倍率（a–c）および高倍率（d–f）での細胞死の作用を示しています。 （g）に示すように、細胞生存率を分析します。線形傾向線は、2時間の照射で細胞死の80％を予測します。同様に、増加する光パワー密度による細胞生存率の低下も（h）に示されています。最後に、蛍光分析のヒストグラムが表示された図6のBF、蛍光、および重ね合わせた合成画像で明確に示されているように、fNPのエンドサイトーシスが検証されました。

結論

要約すると、この研究では、Cs _0.33 の材料合成と特性評価について説明します。 WO ₃ NPは、直接NP相互作用のin vitro細胞毒性アッセイを、NIR照射とは別に調べ、HepG2癌細胞を破壊したときのNPのエンドサイトーシスとNIR照射NPの有効性を証明します。さらに、この研究は、NIR照射されたCs _0.33 の組み合わせ線量を示唆しています。 WO ₃ HepG2がん細胞用のNPソリューション、1.5 mg / mlのNP濃度、30分の照射時間。 〜1時間、50 mW / cm未満のNIR照射の光パワー密度 ² これは、皮膚組織の安全NIR曝露限界をはるかに下回っていますが、癌細胞の死亡率は40％に近く、患者にやさしい個別化医療の開発に適用できる可能性があります。臨床現場でのこのような研究では、特定のがん細胞タイプの表面受容体を認識する分子による表面修飾などの追加の対策が必要になります。

データと資料の可用性

すべてのデータは制限なしで完全に利用可能です。

略語

NP：

ナノ粒子

fNPs：

Cs _0.33 の蛍光バージョン WO ₃ ナノ粒子

NIR：

近赤外線

UV–VIS–NIR：

紫外-可視-近赤外

REDOX：

酸化還元

DLS：

動的光散乱

XRD：

X線回折

SEM：

走査型電子顕微鏡

EDS：

エネルギー分散型X線分光法

RF：

無線周波数

ICNRP：

非電離放射線防護に関する国際委員会

MIN：

分

SCCM：

標準立方センチメートル/分

μ：

マイクロン

RPM：

1分あたりのラウンド

JCPDS：

粉末回折基準に関する合同委員会

DI：

脱イオン化

BF：

明視野