ラット内耳への鼓室内投与リポソームナノキャリアの安全性評価

要旨

リポソームナノキャリア（LPN）は高い薬物担持力と、低侵襲な鼓室内投与後の内耳への効率的な取り込みを提供する。しかし、この感覚器官での生体適合性は系統的に評価されてこなかった。本研究では、ガドリニウム-テトラ-アザシクロ-ドデカン-テトラ-酢酸（Gd-DOTA）あり/なしのLPNをスプラグ・ドーレーラットに鼓室内投与した。ガドリニウム増強MRI（Gd-MRI）でLPN分布とバリア機能を追跡し、聴性脳幹反応（ABR）で聴覚機能を測定した。炎症マーカー（グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、CD44、TLR2）とアポトーシス（TUNEL）を蝸牛組織で定量化した。結果、LPNは中耳・内耳バリアを破壊せず効率的に内耳へ到達し、聴力低下も炎症・アポトーシスマーカーの上昇も認められなかった。したがって、鼓室内LPN投与はラット蝸牛に対して安全であり、感音性難聴治療への応用が期待される。

背景

LPNは臨床で最も古いナノセラピューティックプラットフォームであり、がん、感染症、炎症、疼痛治療で成功を収めている。高い薬物担持力と内耳への実証済み取り込み能により、耳科治療への応用が魅力的である。鼓室内投与は全身曝露を制限する合理的な標的アプローチであり、メニエール病や突発性感音性難聴の臨床で既に用いられている。先行研究ではペプチド機能化LPNが蝸牛到達を示したが、内耳でのLPN安全性プロファイル、特にバリア機能、炎症、細胞生存性への影響は未知であった。本研究はGd-MRI、ABR、包括的組織学解析を用いてラット内耳でのLPN生体適合性を評価することでこのギャップを埋める。

哺乳類耳の模式図。哺乳類耳（ヒトとラットを含む）は外耳、中耳、内耳で構成される。外耳（OE）は耳介と外耳道（EAC）を含む。中耳（ME）には鼓膜（TM）と耳小骨連鎖（槌骨Ma、砧骨Inc、鐙骨）が収まる。中耳腔はユースタキオ管（ET）を介して鼻咽腔と、楕円窓（OW）と円窓膜（RWM）を介して内耳と連絡する。内耳は蝸牛と前庭系を含む。蝸牛は外リンパ階段（ST）と前庭階（SV）、内リンパ階段（SM）からなる。SMの外側壁には血管条（StrV）と螺旋靭帯（SLig）がある。基底蝸牛巻にはコルチ器（内有毛細胞IHC、外有毛細胞OHC）、膜（TM）、螺旋縁（Slim）がある。螺旋神経節細胞（SGC）が聴覚信号を脳へ伝える。前庭系は三半規管（SCC）と前庭（cupulaとmacula）を含む。（Zou 2014から改変）

ヒアルロン酸（HA）は細胞外マトリックス主要成分で、CD44およびTLR2/4と結合し炎症経路を開始する。HA蓄積は様々な組織で透過性亢進と炎症と関連し、蝸牛では銀ナノ粒子（AgNP）がHA蓄積を誘導した報告がある。したがって、HA、CD44、TLR2を本研究の重要な炎症マーカーとして検討した。

目的は、鼓室内LPNが内耳バリア機能を損なうか、炎症を誘発するか、聴力低下を引き起こすかを判定することである。Gd-MRIでバリア機能評価、ABRで聴覚閾値測定、免疫組織化学でHA、CD44、TLR2、アポトーシスDNA断片化を定量化した。

結果

LPNはラット蝸牛に機能的変化を引き起こさない

Gd-MRIにより、LPNが効率的に蝸牛へ進入し、投与後3時間以内に前庭階と外リンパ階で強い信号を示した（Fig.2c-f）。6時間で蝸牛全体に均一な信号分布となり、完全な平衡化を示した（Fig.2e-f）。血液-外リンパバリアと血液-内リンパバリアの完全性は、処理耳と未処理耳の信号強度が比較可能であることから保たれていた（Table 1）。クリックバーストとトーンバースト（2-32 kHz）のABR閾値は、投与後2、4、7日に有意なシフトを示さず、聴覚機能が維持されたことを確認した（Fig.3）。

LPNはラット蝸牛でグリコサミノグリカン蓄積を誘導しない

パス染色（PAS）により、LPNまたはLPN-Gd投与後、蝸牛構造（螺旋縁、骨壁、血管条）のいずれでもグリコサミノグリカン増加は認められず、脱イオン水対照群と差がなかった（Fig.5,6）。定量化でも統計的有意差なし（p>0.05）。

LPNによるヒアルロン酸分泌への影響は軽微

免疫蛍光でHAは主に螺旋神経節細胞、血管条基底細胞、外有毛細胞領域細胞、毛細血管内皮細胞で検出された（Fig.7）。LPNまたはLPN-Gd投与後、螺旋靭帯線維芽細胞でのHA強度がわずかに低下したが、これはバリア透過性変化や聴力低下にはつながらなかった（Fig.8）。

LPN曝露後もCD44発現は変化しない

CD44陽性細胞は血管条基底細胞層、螺旋靭帯、Deiters細胞、毛細血管内皮で全群に豊富に存在し、処理群と対照群で染色強度や細胞数に有意差なし（Fig.9,10）。

LPNでTLR2発現は影響を受けない

TLR2免疫反応性は血管条基底細胞、螺旋靭帯線維芽細胞、内皮で高かったが、LPN、LPN-Gd、水投与群で差はなかった（Fig.11,12）。

LPN投与後に蝸牛アポトーシス増加なし

TUNEL染色では、全群で蝸牛全体にまばらなアポトーシス核が分布し、LPNまたはLPN-Gd群で対照群比増加なし（Fig.13）。鐙骨足板と楕円窓窩での時折のアポトーシスは正常な細胞ターンオーバーの一環と考えられる。

考察

本データは、鼓室内LPNが楕円窓と円窓の両経路で効率的に内耳到達し、血液-外リンパバリアおよび血液-内リンパバリアを損なわないことを示す。聴覚閾値シフトの欠如と炎症・アポトーシスマーカーの不在は、LPNがラット蝸牛で良好に耐容されることを確認する。螺旋靭帯線維芽細胞からのHA分泌わずかな減少は臨床的に無関係であり、透過性変化を誘発せず抗炎症性の高分子量HAへのシフトを反映する可能性がある。これらの知見は、95 nm LPNが内耳送達に最も効率的であり、より大型（110-115 nm）LPNでも安全性が維持されるという先行報告と整合する。

重要なことに、本研究はLPNがTLR2/CD44炎症軸を活性化しないことを確認した。この経路は反応性酸素種やミトコンドリア毒素による蝸牛障害に関与する。したがって、LPNは内耳への標的薬物送達のための安全な担体であり、感音性難聴や他の耳科疾患への臨床応用可能性を支持する。

結論

リポソームナノキャリアの鼓室内投与はラット内耳に対して安全であり、バリア完全性、聴覚機能、細胞ホメオスタシスを維持する。LPNは将来の内耳治療のための薬物送達プラットフォームとして有望である。

実験方法

材料

脂質（スフィンゴシン、SOPC、DSPE-PEG-2000）、蛍光色素（DiI、TRITC-DHPE）、Gd-DOTA（DOTAREM）、銀ナノ粒子（AgNP）を市販品から調達。脂質純度は薄層クロマトグラフィーで確認、濃度は重量法で決定。

LPNの調製と特性評価

500 mM Gd-DOTAを内包した単層LPN（~110 nm、LPN-Gd）とブランクLPN（~115 nm）を、従来報告の薄膜水和法（文献6,3）で調製。粒径分布とゼータ電位を動的光散乱で測定。

LPNの投与

イソフルラン麻酔下、手術用顕微鏡下で左中耳へ50 µlのLPNまたはLPN-Gdを鼓室内注射。対側耳には脱イオン水を陰性対照として投与。投与後15分間、投与耳を上向きに保持。

Gd-MRIによる生物学的バリア機能評価

4.7 T BrukerスキャナでRAREプロトコルを用いGd-MRI実施。造影剤を撮像2時間前に静脈投与。撮像タイムポイントは投与後5時間から8日まで、急性および亜急性変化を捕捉する範囲で設定。

聴性脳幹反応（ABR）

クリックバーストとトーンバースト（2-32 kHz）のABR閾値を、ベースライン、投与後2、4、7日に標準電極配置と遮音室で記録。

組織学的および免疫蛍光解析

最終ABR後、蝸牛を摘出、脱灰、切片化。ヘマトキシリン-エオシン染色とPAS染色で炎症とグリコサミノグリカン含量を評価。HA、CD44、TLR2の免疫蛍光を凍結切片で実施、共焦点イメージングで信号強度を定量化。アポトーシスはTUNEL標識で検出。

統計解析

SPSS 20で解析。一元配置分散分析とKruskal-Wallis検定でABRシフトと染色強度を比較、有意差後に事後LSD検定。p<0.05を有意とした。

略語

ABR

聴性脳幹反応

AgNPs

銀ナノ粒子

dH2O

脱イオン水

Gd-DOTA

ガドリニウム-テトラ-アザシクロ-ドデカン-テトラ-酢酸（DOTAREM）

Gd-MRI

ガドリニウム増強磁気共鳴画像

LPN

リポソームナノキャリア

LPN-Gd

Gd-DOTA含有LPN

ROI

領域

TLR

Toll様受容体