ミトコンドリア標的TiS₂ナノシートによるレスベラトロール送達：光熱トリガー腫瘍化学療法

概要

抗がん剤の細胞小器官標的送達は、抗がん効果を最大化し副作用を最小化する有望な戦略である。ここでは、IR780ヨウ化物（IR780）と二硫化チタン（TiS₂）ナノシートに基づくミトコンドリア標的薬物送達ナノプラットフォームを調製した。TiS₂ナノシートの大きな比表面積により、抗がん剤レスベラトロール（RV）を高負載可能。調製ナノコンポジット（IR780-TiS₂/RV）は効果的な光熱トリガー腫瘍化学療法に用いられた。IR780-TiS₂/RVは満足な安定性と生体適合性を示し、RVとIR780の負載比はそれぞれ約112%と56%であった。近赤外（NIR）照射により、IR780-TiS₂/RVが生成する熱がRV放出をトリガー。ミトコンドリア特異的IR780との結合により、IR780-TiS₂/RVはミトコンドリアに標的蓄積し、NIRトリガーでRVを放出してミトコンドリア膜電位を低下させ、シトクロムcなどの主要な内因性アポトーシス因子の上昇を急速に誘導し、カスパーゼカスケードを開始し、化学療法効果を達成。IR780-TiS₂/RVナノコンポジットはin vitroおよびin vivoで高い抗腫瘍効力と顕著な組織毒性なしを示した。本研究は、NIRトリガーIR780-TiS₂/RVナノプラットフォームが臨床実践における有望な化学療法剤となり得ることを示唆する。

はじめに

がんは依然として生命を脅かす疾患であり、世界中で高い死亡率を占める[1]。手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法が依然として臨床で主流の治療法[2,3]。このうち化学療法は比較的高い効果から医師と患者に広く受け入れられている[4,5]。しかし、薬剤耐性、腫瘍再発、非特異性など深刻な問題を抱える[5-7]。したがって、これらを克服する新たな化学療法剤と戦略の開発が急務[8]。近年、抗がん剤を機能化キャリアに載せ、標的送達と制御放出を同時に実現するアプローチが治療効果最大化と副作用低減のために普及[9-11]。大きな比表面積による高い薬物負載比は優れた薬物キャリアに不可欠[12]。

また、薬物の特異性向上のため、キャリアは通常、葉酸やグルタチオンなどの細胞表面受容体標的分子で修飾される[13-17]。多くの化学療法薬が特定の細胞小器官に作用するため、小器官特異的送達システムの設計は治療効果を著しく増強し副作用を低減できる[18-20]。従って、腫瘍細胞内の標的部位選択は薬物送達システムにとって極めて重要。ミトコンドリアは細胞の「エネルギー工場」であると同時に、内因性アポトーシス経路を開始する化学療法薬の主要標的[21-23]。したがって、ミトコンドリア標的抗がん剤送達システムの開発はより効果的ながん化学療法に不可欠。これまでにメソポーラスシリカ、炭素ベース材料、タンパク質など様々な薬物送達システムが設計されている[17,24-26]。これらキャリアは薬物送達と腫瘍治療で効率的と報告されているが、さらなる高効率システムが強く望まれる。

本研究では、二次元二硫化チタン（TiS₂）ナノシートベースのミトコンドリア標的・NIRトリガー薬物送達ナノプラットフォームを構築し、制御的・標的的腫瘍化学療法を実現した。TiS₂は遷移金属ダイカルコゲナイドの一員で大きな比表面積を持つ[27-29]。タンパク質支援超音波処理による剥離後、TiS₂ナノシート表面は共有/非共有相互作用で他の機能分子により修飾可能。さらに、腫瘍ミトコンドリア特異的分子IR780（IR-780ヨウ化物）を選択しTiS₂ナノシートを修飾。IR780は有機アニオン輸送ポリペプチド介在性能動輸送と親脂性カチオン特性の両方でナノシートにミトコンドリア標的能を付与[30,31]。IR780は親脂性カチオンとして、腫瘍細胞の高いミトコンドリア膜電位により正常細胞よりも腫瘍細胞ミトコンドリアに蓄積することが報告されている[32,33]。また、IR780は近赤外応答性光熱剤でもある。調製ナノプラットフォーム（IR780-TiS₂）は生体適合性が確認され、抗がん剤レスベラトロール（RV）を効果的に負載可能（IR780-TiS₂/RV）[24]。IR780-TiS₂/RVはミトコンドリア標的能と光熱効果を有し、NIRを外部刺激としてNIR照射時に局所薬物放出をトリガー。in vitroおよびin vivo実験でIR780-TiS₂/RVが高効率な化学療法効果を示すことを確認。メカニズム詳細研究で、IR780-TiS₂/RV誘導細胞死がミトコンドリア介在性内因性アポトーシス経路によることを解明。このミトコンドリア標的薬物送達システム（Scheme 1）は将来の臨床応用における潜在的化学療法剤となり得る。

材料と方法

材料

Sigma-AldrichよりIR-780ヨウ化物（IR780）、TiS₂粉末、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）（St. Louis, MO, USA）。牛血清アルブミン（BSA ≥ 98.0%）はBioSharp Co., Ltd.（韓国）より購入。Cell Counting Kit-8（CCK-8）は同仁化学研究所（熊本、日本）より調達。DMEM培地、胎児牛血清（FBS）など細胞培養試薬はGibco（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）より提供。化学薬品はSigma-Aldrich（上海、中国）より入手。

IR780-TiS₂/RVの合成

第一段階として、先行報告[34]に従い水溶性TiS₂ナノシートを調製。詳細：5 mgバルクTiS₂を5 mL水に混合し20分攪拌。TiS₂水懸濁液を5 mg BSAに加え、氷冷下で500 W、20 kHzチップ超音波（Sonics, VCX130, USA）で6時間解離処理。その後、12,000 rpmで10分遠心分離し、上清にTiS₂ナノシートを得た。

第二段階、TiS₂ナノシートをIR780と結合。トリエチルアミン（TEA）を酸結合剤として使用。5 mg IR780を2 mL DMSOに溶解し、TEA添加下で60 °C、8時間攪拌。混合懸濁液を蒸留水で2日間透析、その後9000 rpm、8分遠心分離して凝集物除去。上清を回収しIR780-TiS₂を得た。

最後に、RVをIR780-TiS₂に負載。IR780-TiS₂（1 mg/ml）をRV（2 mg/ml、DMSO溶解）と混合、室温で一晩緩やかに攪拌。その後、蒸留水で一晩透析しDMSOと遊離RVを除去しIR780-TiS₂/RVを得た。文献に基づき、RV負載比はUV-vis分光光度計（UV-2550, Shimadzu, Japan）で検出し、以下の式で計算：

$$ \mathrm{RV}\ \mathrm{負載比}\ \left(\%\right)=\frac{A_a-{A}_b}{A_c}\times 100\% $$

ここで、A_a (mg)、A_b (mg)、A_c (mg)はそれぞれ初期、非結合RV、IR780-TiS₂を表す。

Bruker TENSOR 27フーリエ変換赤外分光法（FTIR）分光計（Bruker Optics Ltd., Coventry, UK）でTiS₂、IR780-TiS₂、IR780-TiS₂/RVの化学構造を検出。Brunauer-Emmett-Teller（BET）分析で試料の比表面積を測定、N₂吸着結果からBET式で算出。

細胞株と細胞培養

マウス大腸がん細胞CT26を中国科学院細胞バンク（上海、中国）より入手。完全DMEM培地（10% FBS + 90% DMEM）で湿度5% CO₂、37 °Cのインキュベーターで培養。

IR780-TiS₂/RVのin vitro局在化

FITCでIR780-TiS₂/RVまたはTiS₂/RVを標識。簡単に、FITCをエタノール溶液（2.0 mg/mL）に溶解し、IR780-TiS₂/RVまたはTiS₂/RV水溶液（1.0 mg/mL）と暗所室温で4時間攪拌混合。混合物を蒸留水で一晩透析し余分なFITCとエタノール除去、FITC標識IR780-TiS₂/RVまたはTiS₂/RV溶液を得た。ナノ粒子のミトコンドリア共局在をin vitroで確認するため、FITC標識IR780-TiS₂/RVまたはTiS₂/RVで5時間処理した細胞をミトコンドリア特異的染料MitoTrackerで染色。その後、CLSM（Ix81-FV1000, Olympus, Co.）でIR780-TiS₂/RVまたはTiS₂/RVの細胞内取り込みを観察。簡単に、CT26細胞をFITC標識TiS₂/RVとIR780-TiS₂/RV（同濃度FITC）で5時間インキュベート。その後、MitoTracker Red FM溶液（100 nM）で37 °C、30分処理。PBSで3回洗浄後、CLSMで観察。ImageJソフトで細胞蛍光強度を解析。

in vitro NIRトリガー腫瘍化学療法とアポトーシス研究

96ウェルプレートに4 × 10³ cells/wellのCT26細胞を播種し、遊離RV、IR780-TiS₂、IR780-TiS₂/RV、TiS₂/RVを異なるRV濃度で5時間処理、その後NIR照射あり/なし（808 nm, 0.3 W/cm²、3分）で照射。さらに24時間培養後、CCK-8アッセイで細胞生存率解析。処理細胞をロダミン123（Sigma）で染色しFCM（FC 500 MCL; Beckman Coulter, USA）で解析。Annexin V-FITC/PIアポトーシス検出キット（Bender MedSystems, Vienna, Austria）を用いたFCM解析で細胞アポトーシス検出も実施。

ウェスタンブロット

CT26細胞をPBS（対照）、RV、TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV + NIR（同等RV 30 μg/mL、同等IR780 0.5 μg/mL）で5時間インキュベート処理。さらに24時間培養後、各々ウェスタンブロット用に回収。プロトコルは先行報告[23]に基づく。簡単に、細胞を溶解しプロテアーゼとTriton X-100で阻害。SDS-PAGEでタンパク質回収・分離、PVDF膜に転写、5%脱脂乳でブロッキング。その後、一次抗体を4 °Cで12時間インキュベート：シトクロムc（1/1000, Boster, Wuhan, China）、切断カスパーゼ-3（1/1000, CST）、切断カスパーゼ-9（1/1000, CST）、アクチン（1/1000, Mouse, Boster, Wuhan, China）、二次抗体でインキュベート。最後にECL試薬でタンパク質検出。

動物モデル

CT26皮下腫瘍モデル確立のため、1 × 10⁷ CT26細胞（100 μL、PBS）をBalb/cヌードマウス背部に皮下注入。腫瘍体積 = 長さ × 幅²/2。すべての動物実験はNIH実験動物飼育ガイドラインに従い、豫南中心医院動物倫理委員会（河南、中国）承認の下で実施。

in vivo生体分布

腫瘍保持ヌードマウスへのIR780-TiS₂/RV尾静脈注射（150 μL, 6 mg/kg）24時間後の生体分布を検出。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍など主要臓器を秤量し王水で消化。これら組織中のTi元素含有量をICP-OESで定量。

in vivo NIRトリガー腫瘍化学療法

CT26腫瘍保持マウスを6群（n = 6）に無作為分割：生理食塩水、生理食塩水+NIR、RV、IR780-TiS₂/RV、TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV + NIR（同等RV 1 mg/kg、同等IR780 0.5 mg/kg）。NIR照射条件：808 nm, 0.3 W/cm², 3分。30日間治療中、腫瘍体積とマウス体重を3日ごとに記録。治療後、各群の心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓を固定しH&E染色。

統計解析

結果を平均±標準偏差で表示。2群間の有意差検定にStudentのt検定を使用。P < 0.05を有意、P < 0.01を非常に有意とみなす。

結果と考察

IR780-TiS₂/RVの調製と特性評価

IR780-TiS₂/RV調製のため、まず生体適合性TiS₂ナノシートを牛血清アルブミン（BSA）と超音波支援剥離法で調製[34,35]。次に、TiS₂ナノシート上に吸着したBSAのアミノ基とIR780の塩素原子との置換反応で、酸結合剤TEAを用いてIR780-TiS₂を合成。最後に、IR780-TiS₂ナノプラットフォームが抗がん剤RVを物理吸着で負載。IR780-TiS₂/RVの模式図をScheme 1に示す。追加ファイル1：Figure S1にタンパク質支援剥離TiS₂のTEM像を示し、ナノシート構造を表示。TiS₂ナノシートのXRDパターンも検出、TEM観察と一致する良好な結晶性を示唆（追加ファイル1：Figure S2）。機能化後、IR780-TiS₂/RVナノコンポジットはフレーク状形態で格子間隔0.25 nm（透過型電子顕微鏡、Figure 1a,b）、平均直径約123.6 nm、ゼータ電位-37.2 mV（Nanosizer, Malvern Instruments、Figure 1c,d）。水、FBS、生理食塩水中で2週間保存後、IR780-TiS₂/RVの平均サイズは約123 nmで一定（Figure 1e）で、IR780-TiS₂/RVの安定性を示唆、おそらくBSAがTiS₂ナノシート表面に付着しているため。Figure 1fに遊離IR780、遊離RV、TiS₂ナノシート、IR780-TiS₂/RVの吸収スペクトルを示す。IR780-TiS₂/RVの吸収スペクトルは遊離IR780と遊離RVのピークを示し、両者がTiS₂ナノシートに成功結合したことを示す。IR780-TiS₂のRV負載比は約112%（W/W）で、非共有相互作用（π-πスタッキング、疎水性相互作用など）により達成。さらにBET結果によると、バルクTiS₂とTiS₂ナノシートの表面積はそれぞれ15.2 m²/gと122.1 m²/gで、剥離TiS₂ナノシートはバルクTiS₂よりはるかに高いBET表面積を示し、薬物負載のための大きな活性領域を提供。高負载はおそらくTiS₂ナノシートの大きな比表面積とIR780-TiS₂ナノシートへのBSA付着による[23]。RVとIR780がTiS₂ナノシートに負载されていることをさらに確認するため、TiS₂ナノシート、IR780-TiS₂、IR780-TiS₂/RVのFTIRスペクトルを測定。追加ファイル1：Figure S6に、TiS₂ナノシートのすべての特性ピークがIR780-TiS₂/RVのFTIRスペクトルに現れることを示す。さらに、IR780-TiS₂/RVのスペクトルに3つの新しいピーク（~3191 cm⁻¹、~1510 cm⁻¹、1230 cm⁻¹）が出現し、RVとIR780の存在を示唆[36,37]。

3分間の低出力NIR照射（808 nm, 0.3 W/cm²）後、IR780-TiS₂/RV溶液温度はIR780-TiS₂/RV濃度（0, 5, 10 μg/ml）に比例して上昇し、10 μg/mlで最高47.6 °Cに達した（Figure 2a）。また、IR780-TiS₂/RVは5サイクルのNIR照射後も初期光熱効果を保持したが、遊離IR780は光熱効果が低下した（Figure 2b）。これら結果はIR780-TiS₂/RVナノコンポジットが優れた光安定性を持つことを示す。

次に、様々なpHとNIR照射条件下でRV放出比を測定（Figure 2c, d）。24時間後、生理的条件（pH 7.4）ではRV放出比8.56%だが、pH 6.5では16.2%に有意増加、弱酸性条件で促進されることを示唆。さらに、pH 6.5と3分NIR照射（808 nm, 0.3 W/cm²）で放出比が44.8%に有意増加。これら結果はNIR照射がIR780-TiS₂/RVからのRV放出をトリガーする制御可能な外部刺激となり得ることを実証。この効果は、NIR照射下でIR780-TiS₂が生成する熱がRVとIR780-TiS₂表面の非共有吸着相互作用を弱めるためと考えられる[35]。また、酸性環境ではH⁺がTiS₂の表面電荷を変化させ、ナノ粒子の親水/疎水バランスを変える[38,39]。

IR780-TiS₂/RVのin vitro局在化

IR780-TiS₂/RVナノ粒子の細胞取り込みと細胞内分布を調べるため、IR780-TiS₂/RVをFITC標識し、CLSMで細胞内蛍光を可視化。5時間インキュベーション後、TiS₂/RVとIR780-TiS₂/RVは細胞質で類似の蛍光強度を示した（Figure 3a, b）、両ナノコンポジットが細胞内に取り込まれることを示唆（おそらくエンドサイトーシス経由）。しかし、FITC信号とMitoTracker標識をマージした際、IR780-TiS₂/RVナノコンポジットはより強い黄色と緑色の蛍光を示した（Figure 3a, c）。これら結果はIR780-TiS₂/RVが高効率でミトコンドリアを標的できることを示す。さらに、TEMでIR780-TiS₂/RVの細胞質内分布を確認、一部ミトコンドリア内にナノ粒子残留を観察（Figure 3d）。これら結果はIR780-TiS₂/RVが優れたミトコンドリア標的能を持ち、ミトコンドリア内薬物蓄積を促進し即時細胞毒性を引き起こすことを確実に確認。ミトコンドリア標的は有機アニオン輸送ポリペプチド介在性能動輸送と親脂性カチオン特性の両方により、腫瘍細胞ミトコンドリアにナノ粒子を高蓄積させることで媒介される可能性[30-33]。

in vitro NIRトリガー腫瘍化学療法

まずin vitroで光熱効果を評価。5時間インキュベーション後、IR780-TiS₂/RVは約17 °Cの温度上昇を示し、TiS₂/RVは約10 °C（Figure 4a）。光熱効果はIR780とTiS₂ナノシートに起因。薬物負載ナノプラットフォームとしての生体適合性を示し、IR780-TiS₂は300 μg/ml以下の濃度で顕著な細胞毒性なし（Figure 4b）。さらに、RVはNIR照射あり/なしで類似の濃度依存的細胞殺傷効果（Figure 4c）。同RV濃度で、IR780-TiS₂に負载されNIR照射されたRVが、遊離RV、遊離IR780-TiS₂、TiS₂に負载されたRVなど他のすべての条件より最高の細胞殺傷効果を達成（Figure 4d）。興味深いことに、非負载IR780-TiS₂プラットフォームはNIR照射曝露時にNIR非照射と比較して顕著な抗がん効果を示さなかった（Figure 4d）、NIR照射刺激によりIR780-TiS₂が生成する熱が主に薬物放出トリガーに用いられ、放出された薬物が細胞を殺傷することを示唆。これら結果は、IR780-TiS₂/RVがNIR照射トリガーでミトコンドリア内でRVを放出し、ミトコンドリア内局所RV濃度を著しく増加させ、より高い腫瘍抑制効果を達成することを示唆。

細胞死メカニズム

IR780-TiS₂/RVのNIRトリガー化学療法の基盤メカニズムを解明するため、細胞死タイプ、ミトコンドリア膜電位（Ψm）、アポトーシス関連主要タンパク質発現レベルを解析。まず、Annexin V-FITC/PI染色でFCMを用いて細胞死タイプ検出（Figure 5a）。同RV濃度で、遊離RV、TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV + NIRはすべてアポトーシスを誘導、主にRV存在による。確かにRVはアポトーシス誘導能を持つと報告されている。これらの中で、IR780-TiS₂/RV + NIRが90.8%の最高アポトーシス率を示した。次にアポトーシスシグナル経路を調査。Ψm低下はミトコンドリア（内因性）アポトーシス経路の鍵イベントと報告[40]。同RV濃度で、IR780-TiS₂/RV + NIRはΨmを約85%低下させ、IR780-TiS₂、TiS₂/RV（NIRあり/なし）、遊離RVによるΨm低下より顕著（Figure 5b）。この実験はIR780-TiS₂/RV + NIR誘導細胞死がミトコンドリア（内因性）アポトーシス経路により媒介されることを示唆[41]。次に、アポトーシスに重要なタンパク質、シトクロムc（cyto c）、カスパーゼ9、カスパーゼ3の発現をウェスタンブロットで検出。IR780-TiS₂/RV + NIR処理細胞は、RV、IR780-TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV処理細胞より多くの細胞質cyto cを発現（Figure 5c）。cyto cのトランスロケーションはカスパーゼカスケードの最重要イニシエーター[42-44]。結果として、切断カスパーゼ9と切断カスパーゼ3の発現がIR780-TiS₂/RV + NIR処理細胞で著しく上昇。これらデータはアポトーシスがミトコンドリア（内因性）経路により媒介されることを明確に示唆。

in vivo NIRトリガー腫瘍化学療法

in vivoでのNIRトリガー化学療法効果を評価するため、CT26腫瘍保持マウスを生理食塩水、生理食塩水+NIR、RV、IR780-TiS₂/RV、TiS₂/RV + NIR、IR780-TiS₂/RV + NIRで処理。IR780-TiS₂/RV + NIR群で腫瘍サイズが有意に減少し、30日治療後には腫瘍がほぼ消失、他群では腫瘍体積が増加傾向（Figure 6a）。治療中、群間で体重に有意差なし（Figure 6b）。最終的にH&E像で全群で顕著な組織毒性や異常なし（Figure 6c）。これら結果はIR780-TiS₂/RVナノコンポジットが優れたNIRトリガー抗腫瘍効力と低全身毒性を持つことを実証。また、IR780-TiS₂/RVのin vivo生体分布を評価。追加ファイル1：Figure S4に示すように、ナノ粒子は主に肝臓系に取り込まれ、おそらく同系で代謝される[45]。

結論

要約すると、TiS₂ナノシートベースのミトコンドリア標的・RV負载ナノプラットフォームを開発し、NIRトリガー薬物放出と腫瘍化学療法増強を実現。調製IR780-TiS₂/RVはフレーク状形態で良好な安定性と生体適合性を示す。IR780のミトコンドリア標的能により、IR780-TiS₂/RVは腫瘍細胞ミトコンドリアに選択的に蓄積し、NIR照射トリガーでRVを放出。放出されたRVはミトコンドリア膜電位低下、cyto c放出、その後カスパーゼカスケードを開始し、ミトコンドリアシグナル経路を介して腫瘍細胞アポトーシスを促進。in vitroおよびin vivo結果でIR780-TiS₂/RVが顕著な組織毒性なしに効果的なNIRトリガー腫瘍化学療法を示す。これら結果はIR780-TiS₂/RVが臨床実践における有望な化学療法剤となり得ることを示唆。

データと材料の入手可能性

本原稿の結論は、この論文にすべて提示・示されているデータに基づく。

略語

IR780:

IR-780ヨウ化物

BET:

Brunauer-Emmett-Teller

BSA:

牛血清アルブミン

BSA:

牛血清アルブミン

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

共焦点レーザー走査顕微鏡

cyto c:

シトクロムc

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO:

ジメチルスルホキシド

FBS:

胎児牛血清

FCM:

フローサイトメトリー

FITC:

フルオレセインイソチオシアネート

FTIR:

フーリエ変換赤外分光法

NIR:

近赤外

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水

RV:

レスベラトロール

TEA:

トリエチルアミン

TiS₂:

二硫化チタン