miR-133a-3pの回復またはPSAT1の低減によるGSK3β/β-カテニン経路阻害を介した内皮細胞障害駆動型脳動脈瘤の抑制

要旨

マイクロRNA-133a-3p（miR-133a-3p）の脳動脈瘤（IA）における機能的役割は不明です。本研究の目的は、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ1（PSAT1）/グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）/β-カテニンシグナル伝達経路を通じた、血管内皮障害誘発性IAにおけるmiR-133a-3pの制御的役割を調査することです。正常脳細動脈組織とIA組織を、脳外傷患者とIA患者から採取しました。組織中のmiR-133a-3p、PSAT1、GSK3β、β-カテニンの発現をRT-qPCRとウェスタンブロット解析で測定。ヒトIA由来内皮細胞（EC）を培養し、miR-133a-3pミミックとsi-PSAT1で処理して、内皮細胞の遊走、アポトーシス、増殖における機能を検証。ECにおけるmiR-133a-3p、PSAT1、GSK3β、β-カテニン、Ki-67、CyclinD1、Bax、Bcl-2の発現をRT-qPCRまたはウェスタンブロットで測定。さらに、IAラットモデルを確立し、病理変化とIA組織におけるmiR-133a-3p、PSAT1、GSK3β、β-カテニン、VEGF、MMP-9の発現をin vivoで検出。miR-133a-3p発現はIAの数と大きさに関連。miR-133a-3p発現はIAで低下し、PSAT1、GSK3β、β-カテニン発現は上昇。miR-133a-3pの回復とPSAT1の枯渇は病理変化を緩和し、IAにおけるPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現を低下させ、IA ECのアポトーシスを抑制し、増殖と遊走を促進し、in vivoでIA組織中のVEGFとMMP-9発現を低下させました。本研究は、miR-133a-3pの過剰発現またはPSAT1のダウンレギュレーションが、GSK3β/β-カテニン経路を阻害することで内皮細胞障害を抑制し、内皮細胞増殖を促進することを示唆しています。miR-133a-3pはIAの潜在的な候補マーカーおよび治療標的となり得ます。

仮説の提示

本研究では、miR-133a-3p/PSAT1軸がGSK3β/β-カテニン経路の調節を通じて、内皮細胞障害誘発性IAに影響を与える可能性があると推測しました。

仮説の検証

この仮説を検証するため、臨床検体、ヒトIA由来内皮細胞（EC）、IAラットモデルを用いて、miR-133a-3pとPSAT1のIAプロセスにおける機能を解明しました。

仮説の意義

本研究は、miR-133a-3pの過剰発現またはPSAT1のダウンレギュレーションが、GSK3β/β-カテニン経路を阻害することでIAにおける内皮細胞障害を抑制し、内皮細胞増殖を促進するという仮説を確認しました。これらの知見は、IAに対する新規標的療法への新たな洞察を提供します。

はじめに

脳動脈瘤（IA）は、脳内で異常に膨らんだ動脈と、IA破裂によるくも膜下出血（SAH）を特徴とする脳血管疾患であり、高い致死率と罹患率を伴います。破壊的な疾患であるにもかかわらず、IAの発症機序は完全には解明されていません。IAには稀な家族性形式もありますが、一般的には高血圧、喫煙などの従来型リスク因子による後天的な血管障害の結果と考えられています。破裂リスクの高い未破裂動脈瘤患者には、血管内コイル塞栓術や開頭クリッピング術が将来の破裂予防に用いられています。IA手術において著しい進歩があったにもかかわらず、IA患者の術後予後不良は依然として問題となっています。IA治療の厳しい現状は、メカニズムの更なる解明と新たな治療戦略の探索を必要としています。

マイクロRNA（miRNA）は、翻訳後レベルでの翻訳阻害またはmRNA分解の媒介により標的遺伝子の発現を調節する非コードRNAの一群です。miR-133a-3pはいくつかの悪性腫瘍で腫瘍抑制因子として機能し、過剰発現は大腸癌（CRC）細胞の増殖を抑制することが報告されています。オートファジー依存的グルタミン分解を阻害することで、miR-133a-3pは胃癌の転移と増殖をさらに抑制することが示されています。また、miR-133a-3pは心臓発達と心肥大の制御に関与することも報告されています。ある研究では、miR-195-5pの上昇がPSAT1依存的GSK3β/β-カテニンシグナル伝達経路を抑制することで、卵巣癌における血管新生とシスプラチン耐性を低下させることが示されています。別の研究では、miR-365がPSAT1を調節することで食道扁平上皮癌（ESCC）の細胞侵襲と増殖を抑制することが報告されています。PSAT1はセリン生合成に関与する酵素で、羊脳から単離され、多くの組織で高レベル発現しています。PSAT1がGSK3β/β-カテニンシグナル伝達経路の調節を通じて乳癌の細胞周期進行を媒介することが記録されています。LiuらはPSAT1がESCCの発症に機能し、予後不良を予測するため、抗癌治療の有望な標的となり得ると指摘しています。以上の分析を踏まえ、本研究はmiR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-カテニン軸のIAにおける機能的役割への新たなアプローチに貢献することを期待しています。

材料と方法

倫理声明

本研究は天津中医薬大学第一附属病院の機関審査委員会の承認を得て実施されました。すべての参加者から文書によるインフォームド・コンセントを取得。すべての動物実験は国際委員会による実験動物の飼育および使用のガイドラインに準拠しています。

研究対象

2016年1月から2018年3月までに、天津中医薬大学第一附属病院神経外科でIAによるSAH治療を受けた症例を選択。顕微鏡手術で得られた75例のIA病理検体をIA群とし、男性29名、女性46名、年齢31〜55歳、平均年齢44.98±6.79歳。同期間に同病院神経外科で脳外傷治療を受けた患者を対照群とし、外傷手術または減圧術で得られた75例の正常脳細動脈組織を採取、男性43名、女性32名、年齢34〜56歳、平均年齢48.14±8.68歳。高血圧、糖尿病、腫瘍の既往歴がある患者は除外。IA群と対照群の間に性別と年齢の有意差はありませんでした（両方ともP>0.05）。

検体処理と保存

手術切除後、一部の検体をホルマリン固定、勾配アルコール脱水、パラフィン包埋し、HE染色と免疫組織化学染色用にスライス。一部は液体窒素タンクで急速凍結後、-80℃冷凍庫でウェスタンブロットとRT-qPCR用に保存。一部はグルタルアルデヒド固定で電子顕微鏡観察用、一部はEC単離用に使用。

電子顕微鏡観察

検体を3%グルタルアルデヒド固定後、1%四酸化オスミウムで再固定。アセトン脱水、Epon812包埋、厚さ3μmの半薄切片を作製。酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色し、H-600IV透過型電子顕微鏡（日立、東京）で観察。

HE染色

パラフィン切片を60℃で30分乾燥。キシレン固定、勾配無水アルコール脱水、リン酸緩衝液（PBS）洗浄。ヘマトキシリン染色、アンモニア処理、エオシン染色（2分）、脱水、透明化。中性ガムで封入し、顕微鏡（ニコン、東京）で観察・記録。

免疫組織化学染色

免疫組織化学キット（Zymed Laboratories、サンフランシスコ）を使用。パラフィン切片を脱蝋・水和、キシレン溶液に5分×3回浸漬。100%無水アルコール3分×2回、95〜75%アルコールで順次3分浸漬。脱蝋後、3%過酸化水素で15分処理し内因性ペルオキシダーゼ活性を消失。ブロッキング溶液滴下、ノーマルゴート血清作業液で15分インキュベーション、一次抗体（MMP-9：5μg/mL、VEGF：1:250、Abcam、ケンブリッジ、PBSを陰性対照（NC）として）で1〜2時間反応。ビオチニル化二次抗体作業液で30〜60分反応。ストレプトアビジン/ペルオキシダーゼ作業液、新調ジアミノベンジジン（DAB）溶液滴下、対比染色、封入。Nikon SPOT FlexTMイメージングシステムで画像取得。MMP-9とVEGF蛋白発現領域を免疫組織化学定量解析ソフトで測定。各検体の陽性細胞蓄積領域で5視野をランダムに検出し、各視野の平均吸光度を平均値として統計解析に用いました。

ECの単離と培養

正常脳細動脈組織とIA組織からECを単離・培養。組織を3mm²片に切断、0.1%コラゲナーゼB/0.1%ディスペース（ロシュ、バーゼル）で25分インキュベーション。組織を剥離、2mLピペットで2分撹拌、100μmストレーナー（BD Biosciences、NJ、USA）でろ過しECを単離。細胞懸濁液を遠心分離し、成長因子と20%胎児牛血清（PromoCell、ハイデルベルク）を含む培地MV2で再懸濁。フィブロネクチン（Sigma Aldrich Inc.、St. Louis、MO、USA）コート皿に10⁴cells/cm²（1μg/cm²）の密度で播種、5%CO₂で1日間培養。播種翌日にPBSで洗浄し非接着細胞を除去、新鮮な培地に置換。80〜100%コンフルエント達した時点で、Ulex europaeus Agglutinin I（UEA）コート（Vector Laboratories Ltd.、Peterborough、UK）ビーズ（Dynabeads M-450 Tosylactivated、Oxoid、Hampshire、UK）による免疫分離で純粋なECを得る。レクチンコートビーズに結合したECを磁気粒子濃縮器で回収、非結合細胞を基礎培地で2回洗浄除去。UEA陽性細胞を培地で再懸濁、フィブロネクチンコート皿に播種し接着と増殖を改善。4〜6日でコンフルエントに達しました。

ECの同定

細胞表面CD31抗体とFVII因子関連抗原による免疫細胞化学染色でECを同定。PBSで2回洗浄、4%パラホルムアルデヒド固定、3%H₂O₂で10〜15分処理し内因性ペルオキシダーゼ活性消失、0.1%トリトンX-100で10分処理し細胞に透過性を付与。特異的一次抗体：Factor VII（1:200）、CD31（1:400、ロシュ、バーゼル）を滴下、4℃で一晩インキュベーション。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識免疫グロブリンG（1:50）二次抗体を滴下、37℃で45分インキュベーション、DABで避光下4分発色。蒸留水で発色停止、顕微鏡で観察。蛍光倒立位相差顕微鏡で観察、10視野からランダムに陽性細胞と総細胞数をカウント。陽性染色細胞率＝（陽性細胞数/総細胞数）×100%。対応するNC群を設定し、一次抗体をPBSに置換、他の手順は同様に実施。

細胞のグループ分けとトランスフェクション

IA由来ECにおけるmiR-133a-3pとPSAT1の効果を研究するため、ECを以下の群に分けました：対照群（トランスフェクションなし正常血管EC）、IA群（トランスフェクションなしIA血管EC）、ミミックNC群（miR-133a-3pミミックNCトランスフェクション）、miR-133a-3pミミック群（miR-133a-3pミミックトランスフェクション）、si-NC群（si-PSAT1 NCトランスフェクション）、si-PSAT1群（si-PSAT1トランスフェクション）、miR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群（miR-133a-3pミミックとoe-PSAT1トランスフェクション）。ミミックNC、miR-133a-3pミミック、si-PSAT1、si-NC、oe-PSAT1はGenePharma Co., Ltd.（上海）が設計・合成。トランスフェクションはLipofectamine™ 2000試薬（Thermo Fisher Scientific、MA、USA）の指示に厳密に従って実施。

フローサイトメトリー

培地を除去、PBSで2回洗浄。0.25%トリプシンで細胞剥離、800rpmで5分遠心、1×バインディングバッファーで懸濁、細胞密度を1×10⁷cells/mLに調整。細胞懸濁液（100μL）をプロピジウムヨウ化物（PI、20μg/mL）5μLとアネキシンV-FITCで20分インキュベーション、400μL 1×バインディングバッファーと混合。フローサイトメーター（BD FACSArial I cell sorter）で1時間以内にアポトーシス検出。散布図の左下象限（Q4）が健康な生細胞（FITC⁻/PI⁻）、右下象限（Q3）が初期アポトーシス細胞（FITC⁺/PI⁻）、右上象限（Q2）が後期アポトーシスおよびアポトーシス細胞（FITC⁺/PI⁺）；アポトーシス率＝初期アポトーシス率（Q3）+後期アポトーシス率（Q2）。

MTTアッセイ

トリプシンで細胞剥離し細胞懸濁液調製。倒立顕微鏡で細胞数カウント。細胞濃度を5×10⁴cells/mLに調整、96ウェルプレートに播種。48時間後、MTT溶液20μLを添加し4時間インキュベーション。各ウェルのMTTをジメチルスルホキシド150μLで溶解。ECの光学密度（OD）値を570nmで測定。OD値に基づきECの増殖率を算出。

スクラッチテスト

各群の細胞を2×10⁵cells/wellで24ウェルプレートに播種、各群3並列ウェル。90%コンフルエント達した時点で、滅菌済み使い捨て1mLマイクロピペットチップで細胞増殖面をスクラッチ、各ウェル1回、スクラッチ長と深度を統一。スクラッチ後、浮遊細胞を除去、培地を新鮮なものに交換、24時間培養後顕微鏡でスクラッチ間隔観察。スクラッチ創傷治癒面積をNational Instrument Vision Assistant 8.6ソフトで計測。細胞遊走＝創傷治癒面積/初期スクラッチ創傷面積×100%。

実験動物とIAラットモデルの確立

7週齢、体重180〜200gのSprague-Dawley（SD）ラット84匹（中国軍事医学科学院実験動物センター、北京）を使用。動物実験センターで飼育、温度22〜25℃、湿度50〜60%、自然光。標準ラットケージに4匹/ケージで飼育、都市衛生飲料水と普通ラット飼料を給与。敷材を3日ごとに交換、ケージを洗浄・滅菌。IAラットモデルは文献[15]に従って作製。破裂動脈瘤は以下の症状で同定[16]：1、食餌・飲水活動低下による体重減少（約10%）が24時間以内に発生；2、持ち上げ時に躯幹と前肢の屈曲；3、正常姿勢で片側歩行；4、安静時に片側に傾き、自発活動なし。これらの症状を示したラットを手術3ヶ月後に安楽死。手術時にIA組織を採取、PBS灌流、グルタミン酸含有ブルー染料を大脳動脈に灌流。

IAラットの治療と介入

上記84匹を無作為に7群に分け、各群12匹。治療法は以下の通り：正常群（モデリングなし）；IA群（PBSとLipofectamine 2000の100μL混合液を立体定位注射）；ミミックNC群（miR-133a-3pミミックNCとLipofectamine 2000の100μL混合液を立体定位注射）；miR-133a-3pミミック群（miR-133a-3pミミックとLipofectamine 2000の100μL混合液を立体定位注射）；si-NC群（si-PSAT1 NCとLipofectamine 2000の100μL混合液を立体定位注射）；si-PSAT1群（si-PSAT1とLipofectamine 2000の100μL混合液を立体定位注射）；miR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群（miR-133a-3pミミックとoe-PSAT1とLipofectamine 2000の100μL混合液を立体定位注射）。すべての注射を1日1回実施、これらのラットを特定病原体フリー（SPF）動物実験室で12週間飼育。12週後、各群のラットを麻酔し胸腔を開放。左心室から大動脈へチューブ挿入、下大静脈切開で放血。同時に37℃のヘパリンナトリウム含有生理食塩水30mLをダクト経由で灌流、続いて10%ポルホルムアルデヒド/0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.4）を脳へ徐々に注入。灌流固定後、脳を開頭。頭蓋底の動脈輪を手術顕微鏡下で分離・摘出、動脈瘤の変化を顕微鏡下で観察、病理的特徴を調査。ミミックNC、miR-133a-3pミミック、si-NC、si-PSAT1、oe-PSAT1は上海桑園生物工学有限公司（上海）が合成。

血行動態検出

ラットの左総頸動脈末端の血流速度を手術3日前と介入治療12週後に測定。方法：ラットを麻酔機の動物フレームに固定し吸入麻酔、流量パラメータ調整。ラットが安定して呼吸し、尾を触っても明らかな反応がないことを確認後、ゴムバンドで実験台に固定。電気シェーバーで頸部の毛を剃り、カラードップラー超音波探傷器を起動、プローブに適量のカップリング剤を塗布し左総頸動脈末端の血流速度を測定・記録。測定後、ラットを慎重にケージに戻し、気道を確保し麻酔覚醒まで待機。

RT-qPCR

総RNAをRNA simple総RNA抽出キット（TIANGENバイオテクノロジー、北京）で抽出。紫外線分析とホルムアルデヒド変性電気泳動で高品質RNAを確認、PrimeScript RT試薬キットでcDNAに逆転写。SYBR Permix Ex TaqII（タカラ、大連）でPCR反応実施。PCRプライマーは北京ComWin Biotech Co., Ltd.（北京）が設計・合成（表1）。U6をmiR-133a-3pの内部パラメータ、PSAT1、GSK3β、β-カテニン、Bax、Bcl-2、Ki-67、CyclinD1にはグリセラールデヒドリン酸脱水素酵素（GAPDH）を内部パラメータとして使用。データは2⁻ΔΔCt法で算出。

ウェスタンブロット解析

細胞と組織から総タンパク質を抽出、BCA蛋白定量キット（Beyotimeバイオテクノロジー研究所、上海）で定量。サンプルを5×サンプルバッファー1/4体積で混合、5分沸騰。10%分離ゲルと5%濃縮ゲルで電気泳動。膜を5%脱脂粉乳で60分ブロッキング。一次抗体：PSAT1（1:500）、GSK3β（1:500）、β-カテニン（1:5000）、Bax（1:1000）、Bcl-2（1:1000）、CyclinD1（1:200）、Ki-67（1:5000）、MMP-9（1μg/mL）、VEGF（1:1000）（すべてAbcam、ケンブリッジ）。二次抗体（1:2000）で60分反応。電気化学発光反応液（Beyotimeバイオテクノロジー研究所、上海）に1分浸漬、ラップで覆う。X線露光、現像・定着後観察。GAPDH（1:10000、Abcam）をローディングコントロール、ImageJ2xソフトで蛋白質画像解析。

二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

バイオインフォマティクスサイト（https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/）でmiR-133a-3pとPSAT1の標的関係、miR-133a-3pとPSAT1 3′非翻訳領域（3′UTR）の結合部位を予測。miR-133a-3p結合部位を含むPSAT1 3′UTRプロモーター領域の配列を増幅、pGL3-basicルシフェラーゼプラスミド（タカラバイオ、大津）にクローニングし野生型（WT）プラスミド（PSAT1-WT）を構築。点突然変異キット（タカラバイオ、大津）でPSAT1-WT上のmiR-133a-3p結合部位を変異させ、変異型（MUT）PSAT1-MUT組換えプラスミドを作製。対数増殖期の血管ECを96ウェルプレートに播種。コンフルエント70%達した時点で、PSAT1-WTとPSAT1-MUTプラスミドをミミックNCとmiR-133a-3pミミックプラスミドと混合、Lipofectamine 2000で血管ECに共トランスフェクション。トランスフェクション48時間後、細胞を回収・溶解、ルシフェラーゼ検出キット（Promega Corporation、マディソン、WI、USA）でルシフェラーゼ活性測定。

統計解析

すべてのデータをSPSS 21.0ソフトウェア（IBM Corp.、Armonk、NY、USA）で解析。計数データを率またはパーセンテージで示し、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定で分析。正規分布に従う計量データを平均±標準偏差で示す。2群間比較はt検定、多群比較は一元配置分散分析（ANOVA）後Tukey事後検定。P<0.05を有意としました。

結果

IA患者の一般データ

表2にIA群と対照群の一般データ比較を示します。詳細は表2に記載。

miR-133a-3p発現はIAの数と大きさに関連

miR-133a-3p発現とIAの病理組織学的特徴の関係を解析。表3に示すように、IAにおけるmiR-133a-3p平均相対発現量に基づき、75例のIAを高発現群（n=47）と低発現群（n=28）に分類。miR-133a-3pと各病理組織学的パラメータの関係をカイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定で統計解析。結果、miR-133a-3p発現は年齢、性別、動脈瘤の形状と位置とは無関連（すべてP>0.05）でしたが、動脈瘤の数と大きさとは関連（両方ともP<0.05）がありました。

IA組織におけるmiR-133a-3p発現低下とPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現上昇

RT-qPCRでIAにおけるmiR-133a-3p発現を測定。正常脳細動脈組織（対照群）と比較して、IA組織（IA群）でmiR-133a-3p発現が有意に低下（P<0.05）（図1a）。RT-qPCRとウェスタンブロットで、PSAT1、GSK3β、β-カテニン発現が正常脳細動脈組織と比較してIA組織で有意に上昇（すべてP<0.05）（図1a〜c）。

IA組織におけるmiR-133a-3p発現低下とPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現上昇。a IA群と正常群におけるmiR-133a-3p、PSAT1、GSK3β、β-カテニン発現。b PSAT1、GSK3β、β-カテニン蛋白バンド。c ウェスタンブロットによるIA群と正常群のPSAT1、GSK3β、β-カテニン蛋白発現。n=75、*P<0.05 vs. 対照群。計量データを平均±標準偏差で示し、2群間比較は独立サンプルt検定で実施。

動脈瘤の病理変化とIA組織におけるMMP-9およびVEGF発現

正常脳細動脈組織とIA組織を直接観察。対照群では動脈組織内の血管は鮮やかな赤色で、腔内に明らかなアテローム性プラークと側壁血栓は認められませんでした。IA群の動脈瘤腫瘤は大部分が褐色または暗赤色で、外観は嚢状または紡錘状、質感は概ね硬い。腫瘤を切開すると、一部の腫瘤壁に白色または暗赤色のアテローム性プラークが認められ、扁平、円形、楕円形の形状。一部の腫瘤腔内に壁側血栓があり、血栓は柔らかい質感。腫瘤壁の厚さは腫瘤頸部から頂部に向かって徐々に薄くなり、一部は頂部で薄い線維膜のみ、一部は破裂していました。破裂動脈瘤の亀裂は腫瘤頂部またはその付近に位置。

HE染色では、正常脳細動脈組織では血管壁の厚さが均一で、内膜・中膜・外膜の解剖学的構造が明確かつ完全、各層の細胞形態は正常、隣接細胞の肉膜が密接、血管壁の炎症細胞は稀。IA群では、頭蓋内動脈分岐部頂部の遠位側側腔に局所的突出が形成され、動脈瘤壁が鈍角化・縮小、局所的EC消失。少数例で平滑筋細胞層から内膜への移行と筋原性内膜細胞増殖を認める。EC減少または消失。内皮細胞層は増殖性筋内膜細胞と線状配列EC、またはアポトーシス性ECと腔面付着血球で構成。空胞変性を呈し連続性中断。一部は基底膜と共に剥離、内膜コラーゲン線維増加。動脈硬化変化、細動脈壁が明らかに薄く、大量の結合組織で充填。全層に炎症細胞浸潤とびまん性分布、主に中膜と外膜。一部細胞に脂質とコレステロール結晶沈着。一部の腫瘤壁が完全または局所的に薄化・外方拡張（図2a、b）。

動脈瘤の病理変化とIAにおけるMMP-9およびVEGF発現。a 対照群正常脳細動脈組織HE染色切片（×10）。b IA組織HE染色切片（×10）。c 対照群正常脳細動脈組織電子顕微鏡超微細構造（×10,000）。d IA組織電子顕微鏡超微細構造（×10,000）。e 対照群とIA群のMMP-9免疫組織化学染色発現（×200）。f 対照群とIA群のVEGF免疫組織化学染色発現（×200）

正常脳細動脈組織とIA組織切片を電子顕微鏡観察。正常組織では脳血管壁の基質線維が明確に観察され、内皮障害、核濃縮、変性はなし。IA組織では明らかな内皮細胞障害、核濃縮、空胞変性、中膜平滑筋細胞数減少、大部分に核濃縮、クロマチン凝集とアポトーシス小体を認める。一部細胞にミトコンドリア腫脹と正常内部構造消失。細胞骨格を形成する細胞外基質が不明瞭で無定形フロック状を呈。欠損細胞部位に多数の断片を認める（図2c、d）。

免疫組織化学染色でMMP-9とVEGF発現を検査。対照群75例でMMP-9とVEGF発現なし。IA検体75例中60例でMMP-9陽性発現。MMP-9陽性発現はIA壁の内膜と外膜に出現するが均一ではない。陽性発現は主に褐黄色細胞質で特徴づけられる。VEGF陽性発現はIA検体75例中66例。IA壁では中膜と外膜で高陽性、内膜で低陽性。陽性発現も主に褐黄色細胞質（図2e、f）。両群のMMP-9とVEGF発現を表4に示します。

血管ECの同定

免疫組織化学染色でECのFactor VIIIとCD31発現を解析。血管ECはFactor VIIIとCD31関連抗原抗体に陽性反応、陽性率95%。さらに細胞質に多数の褐色顆粒を認め、5代目の細胞では初回継代より褐色染色が劇的に高かった（図3a、b）。

血管ECはFVIIIとCD31関連抗原抗体に陽性反応。a CD31によるEC同定。b FVIIによるEC同定

miR-133a-3p上昇とPSAT1低下によるIA ECのアポトーシス抑制と増殖・遊走促進

フローサイトメトリー、RT-qPCR、ウェスタンブロットで、miR-133a-3pミミックまたはsi-PSAT1処理後のIA ECにおけるアポトーシスとBax、Bcl-2発現を観察。対照群と比較して、IA群で細胞アポトーシス率とBax発現が上昇、Bcl-2発現が低下（すべてP<0.05）。IA群、ミミックNC群、si-NC群の細胞アポトーシスとBax、Bcl-2発現に有意差なし（すべてP>0.05）。si-NC群とミミックNC群と比較して、si-PSAT1群とmiR-133a-3pミミック群で細胞アポトーシス率が抑制、Bax発現低下、Bcl-2発現上昇（すべてP<0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較して、miR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群でアポトーシス率とBax発現が増加、Bcl-2発現が減少（すべてP<0.05）（図4a〜e）。

高発現miR-133a-3pと低発現PSAT1はIA ECのアポトーシスを抑制し増殖と遊走を促進。a フローサイトメトリーによるECアポトーシス検出。b 各群のECアポトーシス率検出。c RT-qPCRによるECのBaxとBcl-2発現検出。d BaxとBcl-2蛋白バンド。e ウェスタンブロットによるECのBaxとBcl-2蛋白発現。f MTTアッセイによる各群EC増殖活性検出。g RT-qPCRによる各群ECのKi-67とCyclinD1発現検出。h Ki-67とCyclinD1蛋白バンド。i ウェスタンブロットによるECのKi-67とCyclinD1蛋白発現。j スクラッチテストによる各群EC遊走検出。k 各群EC遊走の統計結果。N=3、*P<0.05 vs. 対照群。#P<0.05 vs. ミミックNC群。&P<0.05 vs. si-NC群。+P<0.05 vs. miR-133a-3pミミック群。計量データを平均±標準偏差で示し、一元配置分散分析後Tukey事後検定で評価。

MTTアッセイ、RT-qPCR、ウェスタンブロットで、miR-133a-3pミミックまたはsi-PSAT1処理後のIA ECにおける増殖とKi-67、CyclinD1発現を観察。対照群と比較して、IA群で増殖活性とKi-67、CyclinD1発現が低下（すべてP<0.05）。IA群、ミミックNC群、si-NC群の増殖活性とKi-67、CyclinD1発現に有意差なし（すべてP>0.05）。si-NC群とミミックNC群と比較して、si-PSAT1群とmiR-133a-3pミミック群で増殖活性とKi-67、CyclinD1発現が上昇（すべてP<0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較して、miR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群で増殖活性とKi-67、CyclinD1発現が低下（すべてP<0.05）（図4f、i）。

miR-133a-3pミミックまたはsi-PSAT1処理24時間後の各群EC遊走をスクラッチテストで観察。IA群の細胞遊走は対照群と比較して抑制（P<0.05）。IA群、si-NC群、ミミックNC群の細胞遊走に明確な変化なし（すべてP>0.05）。si-NC群とミミックNC群と比較して、si-PSAT1群とmiR-133a-3pミミック群で細胞遊走が上昇（両方ともP<0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較して、miR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群で細胞遊走が低下（P<0.05）（図4j、k）。

miR-133a-3p回復とPSAT1枯渇によるIA ECにおけるPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現低下

RT-qPCRでIA ECのmiR-133a-3p発現を測定。対照群と比較してIA群でmiR-133a-3p発現低下（P<0.05）。IA群、ミミックNC群、si-NC群のmiR-133a-3p発現に明確な変化なし（P>0.05）。miR-133a-3pミミック群でミミックNC群と比較してmiR-133a-3p発現上昇（P<0.05）。si-NC群と比較してsi-PSAT1群でmiR-133a-3p発現に明確な変化なし（P>0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較してmiR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群でmiR-133a-3p発現に有意差なし（P>0.05）（図5a）。

miR-133a-3p上昇とPSAT1低下によるIA ECにおけるPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現低下。a RT-qPCRによるECのmiR-133a-3p、PSAT1、GSK3β、β-カテニン発現検出。b PSAT1、GSK3β、β-カテニン蛋白バンド。c ウェスタンブロットによる各群ECのPSAT1、GSK3β、β-カテニン蛋白発現。N=3、*P<0.05 vs. 対照群。#P<0.05 vs. ミミックNC群。&P<0.05 vs. si-NC群。+P<0.05 vs. miR-133a-3pミミック群。計量データを平均±標準偏差で示し、一元配置分散分析後Tukey事後検定で評価。

ウェスタンブロットとRT-qPCRでIA ECのPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現を測定。対照群と比較してIA群でPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現上昇（すべてP<0.05）。IA群、ミミックNC群、si-NC群のPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現に劇的な変化なし（すべてP>0.05）。miR-133a-3pミミック群とsi-PSAT1群でミミックNC群とsi-NC群と比較してPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現低下（すべてP<0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較してmiR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群でPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現上昇（すべてP<0.05）（図5a〜c）。

miR-133a-3p上昇とPSAT1低下によるIA組織病理変化の緩和

モデリング後のラット血行動態変化を測定し、手術3日前と介入治療12週後の各群ラット血流速度を監視。手術3日前の各群血流速度に明確な差なし（P>0.05）。12週間介入後、IA群のラット血流速度は正常群と比較して低下（P<0.05）。IA群、ミミックNC群、si-NC群、miR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群の血流速度低下度に明確な差なし（すべてP>0.05）。si-NC群とミミックNC群と比較して、miR-133a-3pミミック群とsi-PSAT1群で血流速度上昇（両方ともP<0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較して、miR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群で血流速度低下（P<0.05）（図6a）。

miR-133a-3p上昇とPSAT1低下によるIA組織病理変化の緩和。a モデリング成功後の各時点におけるラット血行動態変化。b トランスフェクション後のIA組織変化。n=12、*P<0.05 vs. 正常群。#P<0.05 vs. ミミックNC群。&P<0.05 vs. si-NC群。+P<0.05 vs. miR-133a-3pミミック群。計量データを平均±標準偏差で示し、一元配置分散分析後Tukey事後検定で評価。

HE染色でIA組織変化を検証。正常群では頭蓋内血管組織中膜の弾性線維が整然とし、正常な弾性蛋白波状構造が出現、断裂と分解なし。正常群と比較してIA群では頭蓋内血管組織腔が拡大、正常な弾性蛋白波状構造が消失、中膜局所弾性蛋白血管の弾性線維が断裂、一部の弾性線維が完全に分解。si-NC群、ミミックNC群、IA群、miR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群のIA組織形態に明確な変化なし。si-NC群とミミックNC群と比較して、miR-133a-3pミミック群とsi-PSAT1群のラット頭蓋内血管組織に弾性蛋白波状構造が存在、局所弾性蛋白血管構造がやや無秩序だが断裂と溶解なし（図6b）。

高発現miR-133a-3pと低発現PSAT1によるin vivo IA組織におけるPSAT1、GSK3β、β-カテニン、VEGF、MMP-9発現低下

RT-qPCRでin vivo IA組織のmiR-133a-3p発現を測定。正常群と比較してIA群でmiR-133a-3p発現低下（P<0.05）。IA群、ミミックNC群、si-NC群のmiR-133a-3p発現に明確な変化なし（すべてP>0.05）。miR-133a-3pミミック群でミミックNC群と比較してmiR-133a-3p発現上昇（P<0.05）。si-NC群と比較してsi-PSAT1群でmiR-133a-3p発現に明確な変化なし（P>0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較してmiR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群でmiR-133a-3p発現に有意差なし（P>0.05）（図7a）。

miR-133a-3p過剰発現とPSAT1低発現によるin vivo IA組織におけるPSAT1、GSK3β、β-カテニン、VEGF、MMP-9発現低下およびPSAT1がmiR-133a-3pの標的遺伝子であること。a RT-qPCRによる各群ラットIA組織のmiR-133a-3p、PSAT1、GSK3β、β-カテニン発現検出。b PSAT1、GSK3β、β-カテニン蛋白バンド。c ウェスタンブロットによる各群ラットIA組織のPSAT1、GSK3β、β-カテニン蛋白発現検出。d VEGFとMMP-9蛋白バンド。e ウェスタンブロットによる各群ラットIA組織のVEGFとMMP-9蛋白発現検出。f Target ScanによるPSAT1とmiR-133a-3pの対応結合部位予測。g 二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ結果。a〜e、n=12；f〜g、N=3、*P<0.05 vs. 正常群/Wt+NC群。#P<0.05 vs. ミミックNC群。&P<0.05 vs. si-NC群。+P<0.05 vs. miR-133a-3pミミック群。計量データを平均±標準偏差で示し、一元配置分散分析後Tukey事後検定で評価。

ウェスタンブロットとRT-qPCRでin vivo IA組織のPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現を測定。正常群と比較してIA群でPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現上昇（すべてP<0.05）。IA群、ミミックNC群、si-NC群のPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現に明確な変化なし（すべてP>0.05）。miR-133a-3pミミック群とsi-PSAT1群でミミックNC群とsi-NC群と比較してPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現低下（すべてP<0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較してmiR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群でPSAT1、GSK3β、β-カテニン発現上昇（すべてP<0.05）（図7a〜c）。

ウェスタンブロットでin vivo IA組織のVEGFとMMP-9発現を検証。正常群と比較してIA群でVEGFとMMP-9発現上昇（両方ともP<0.05）。IA群、ミミックNC群、si-NC群のVEGFとMMP-9発現に明確な変化なし（すべてP>0.05）。ミミックNC群とsi-NC群と比較して、miR-133a-3pミミック群とsi-PSAT1群でVEGFとMMP-9発現低下（すべてP<0.05）。miR-133a-3pミミック群と比較してmiR-133a-3pミミック+oe-PSAT1群でVEGFとMMP-9発現上昇（すべてP<0.05）（図7d、e）。

PSAT1はmiR-133a-3pの標的遺伝子

オンライン予測ソフトウェア（https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/）でPSAT1とmiR-133a-3pの標的部位、PSAT1とmiR-133a-3pが結合する3′UTR領域配列を予測・解析。予測されたmiR-133a-3p結合部位がルシフェラーゼ活性変化をもたらすことを証明するため、miR-133a-3p結合部位を欠失させたPSAT1 3′UTRの変異配列と野生型配列を設計。血管ECでmiR-133a-3pミミックとWT（Wt-miR-133a-3p/PSAT1）またはMUT（Mut-miR-133a-3p/PSAT1）組換えプラスミドを共トランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を検証。結果、miR-133a-3pミミックはMut-miR-133a-3p/PSAT1群のルシフェラーゼ活性に明確な影響なし（P>0.05）、一方Wt-miR-133a-3p/PSAT1群ではルシフェラーゼ活性が有意に低下（P<0.05）（図7f、g）。

考察

IAは頭蓋内動脈の異常拡張であり、血管壁を持続的に外側に押し出すことで動脈壁を弱化させ、動脈瘤破裂リスクを高めます。Liuらの研究では、いくつかのmiRNAが血管平滑筋細胞の増殖調節に関与し、IAと密接に関連することが示されています。また、最近の研究では循環miRNAがハイリスク個体のIA発生可能性評価の新規バイオマーカーとなり得ることが証明されています。PSAT1は統合失調症スペクトラム障害に関与しセリン代謝を変化させる可能性があると一般的に考えられています。本研究は、PSAT1/GSK3β/β-カテニンシグナル伝達経路の調節を通じたmiR-133a-3pによる血管内皮障害調節とIA誘発の制御的役割を探索することを目的として設計されました。

本研究では、miR-133a-3p発現とIAの病理組織学的特徴の関係を解析し、miR-133a-3p発現は年齢、性別、動脈瘤の形状と位置とは無関連だが、動脈瘤の数と大きさとは関連することを示しました。一部の研究者は、動脈壁の局所血流せん断応力が線維芽細胞と血管内皮細胞によるモノサイト遊走蛋白-1（MCP-1）とマクロファージ炎症蛋白1α（MIP-1α）発現を誘導し、高反応性ケモカインMCP-1とMIP-1αが血管壁にマクロファージを集積させ炎症反応を媒介、核転写因子c-Junを興奮させ活性化蛋白1（AP-1）を調節活性化、MMP-9プロモーターをその構造領域で活性化しMMP-9 mRNA発現を上昇、最終的に血管壁細胞外基質を溶解しIA形成を誘導すると考えています。Saitoら[24]はMMP-9陽性細胞が主に中膜と外膜の動脈マクロファージ由来であり、マクロファージ発現MMP-9が動脈壁変性を媒介し動脈瘤形成につながることを確認。以上の研究はMMP-9がIA形成に関連することを示唆。本研究結果ではMMP-9がIAで上昇しており、miR-133a-3pがPSAT1/GSK3β/β-カテニン経路を調節しさらにMMP-9を調節することでIA発生・進展に関与する可能性を推測しました。本研究ではmiR-133a-3p回復が頭蓋内動脈瘤組織におけるPSAT1、GSK3β、β-カテニン、MMP-9発現を低下させることを発見。今後の研究でさらなる検証を行います。

本研究は、miR-133a-3p発現が低下しPSAT1、GSK3β、β-カテニンが上昇していることを実証しました。新たな証拠はmiR-133a-3pが様々な腫瘍で抑制的役割を果たすことを示唆。最近の研究では、miR-133a-3p発現が非癌組織と比較して乳癌組織で劇的に低下することが報告されています。別の研究では、miR-133a-3p発現が隣接正常組織や良性前立腺病変組織と比較して進行性前立腺癌（PCa）組織で低下、特に骨転移性PCa組織で顕著と報告。PSAT1の他疾患における促進効果も文献で見られます。PSAT1発現が非小細胞肺癌（NSCLC）で顕著に上昇し、NSCLC患者の臨床転帰不良を予測することが報告。さらに、PSAT1はCRC腫瘍で最も高発現する遺伝子とされ、化学療法抵抗性患者で高発現。GSK3β活性が癌組織で上昇することが示されています。さらに、GSK3βリン酸化レベルと核内β-カテニン発現も上昇し、GSK3β/β-カテニン経路がオステオポンチン調節に関与する可能性が示唆されています。

本研究データから得られた他の結果は、miR-133a-3p上昇とPSAT1低下がIA ECのアポトーシスを抑制し増殖と遊走を促進し、IA組織中のVEGFとMMP-9発現を低下させることを示唆。以前の研究では、miR-133a-3p過剰発現がコラーゲンタイプIアルファ1（COL1A1）を標的とすることで口腔扁平上皮癌細胞の侵襲、増殖、有糸分裂を抑制することが示唆されています。高発現miR-133a-3pがCOL1A1を標的としてESCC細胞増殖を抑制、アポトーシス促進、遊走と侵襲を低下させることが報告。別の研究では、miR-133a-3p一過性上昇が再結合シグナル結合蛋白Jκを直接標的とすることで胆嚢癌細胞の遊走、侵襲、増殖能を抑制することが検証。同様に、本研究はmiR-133a-3pがPSAT1を標的としてIAで役割を果たすことを示唆。PSAT1過剰発現がESCC細胞増殖とマトリゲル侵襲をin vitroで促進し、高PSAT1発現ESCC細胞をマウスに注射するとin vivoで腫瘍形成を誘導することが示されています。他の研究でもPSAT1が高発現し患者の臨床転帰不良を予測、in vivoおよびin vitroで細胞腫瘍形成と増殖を増強することが報告。先行研究は一般的にPSAT1が機能喪失・獲得実験を通じて細胞周期進行、増殖、腫瘍形成を促進することを確認。MMPsはZn²⁺イオンによる活性部位結合水分子活性化に基づく保存された機構で蛋白質基質を切断する一連の酵素で構成されることが示されています。MMP-9は多くの生物学的プロセスに多大な影響を与える特異的プロテアーゼ。MMP-9が動脈瘤群で対照群と比較して上昇することが報告。血管内皮増殖因子-A（VEGF-A）は栄養膜の血管内分化の主要調節因子と認識。PSAT1発現沈黙がVEGF、β-カテニン、GSK3βリン酸化発現を抑制することが示されています。

結論

簡潔に結論すると、本研究はmiR-133a-3p過剰発現またはPSAT1ダウンレギュレーションが、GSK3β/β-カテニン経路を阻害することでIAにおける内皮細胞障害を抑制し内皮細胞増殖を促進するという仮説を確認しました。これらの知見はIAに対する新規標的療法への新たな洞察を提供します。これらの知見は、PSAT1/GSK3β/β-カテニン経路に関連するIAにおけるmiR-133a-3pの役割を強調します。しかし、この分野の既知研究が限られているため、miR-133a-3pとPSAT1の効果について明確な結論を出すことはできません。今後の臨床試験で厳密に監視し適切に報告する必要があります。

データと材料の入手可能性

該当なし

略語

miR-133a-3p:

マイクロRNA-133a-3p

IA:

脳動脈瘤

PSAT1:

ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ1

GSK3:

β-グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β

SAH:

くも膜下出血

MiRNAs:

マイクロRNA

CRC:

大腸癌

ESCC:

食道扁平上皮癌

HE:

ヘマトキシリン-エオシン

PBS:

リン酸緩衝液

MMP:

マトリックスメタロプロテアーゼ

VEGF:

血管内皮増殖因子

NC:

ネガティブコントロール

DAB:

ジアミノベンジジン

FBS:

胎児牛血清

UEAI:

Ulex europaeus agglutinins I

PI:

プロピジウムヨウ化物

FITC:

フルオレセインイソチオシアネート

DMSO:

ジメチルスルホキシド

OD:

光学密度

SD:

Sprague-Dawley

SPF:

特定病原体フリー

GAPDH:

グリセラールデヒドリン酸脱水素酵素

BCA:

ビシンコニン酸

3′UTR:

3′非翻訳領域

WT:

野生型

MUT:

変異型

ANOVA:

分散分析

NSCLC:

非小細胞肺癌

VEGF-A:

血管内皮増殖因子-A