ソラフェニブ送達のためのヌクレオシド-脂質ベースのナノキャリア

背景

Nexavar™の名前で商品化されているソラフェニブは、進行性腎細胞癌（RCC）[2]、肝細胞癌（HCC）[3]、進行性甲状腺など、さまざまなヒトの癌の治療に承認された疎水性薬物キナーゼ阻害剤[1]です。癌腫。ソラフェニブには、膜貫通型受容体、細胞内チロシンおよびセリン-スレオニンキナーゼを含む複数の既知のプロテインキナーゼ標的があり、アポトーシスを誘導することも示されています。作用機序に関して、ソラフェニブは、複数の標的を介して腫瘍増殖を阻害し、腫瘍および/または腫瘍血管新生に直接作用する（VEGFRおよびPDGFRシグナル伝達の阻害を介して）と報告されています[4、5]。悪性細胞の増殖を阻害するその有効性は、メラノーマ[6]、甲状腺[7]、膵臓[5]、肝細胞癌、白血病[8]などの多くの組織学的癌タイプで実証されています。ただし、低い水溶性、毒性、および副作用により、多くの臨床用途でのソラフェニブの使用が制限されます。これらの問題に対処するために、液晶ナノ粒子[11]、ナノエマルジョン[12]、シクロデキストリン修飾多孔質シリコンナノ粒子[13]、薬物溶出ナノ複合材料[14]、高分子電解質など、いくつかのソラフェニブ製剤が現在調査中です[9、10]。ベースのナノ粒子[15]、またはクルクミン自己組織化ナノ粒子[16]。ただし、ソラフェニブをロードした脂質ナノ粒子（LN）は十分に調査されていません[17、18]。

ここでは、ヌクレオシド脂質[20,21,22]によって安定化されたソラフェニブベースの固体脂質ナノ粒子（SLN）[19]の最初の例を報告します。正および負に帯電したヌクレオ脂質（DOTAUおよびdiC ₁₆ ）で達成されたクロマトグラフィー研究 それぞれdT）は、これらの両親媒性物質が、ドラッグデリバリーアプリケーションの枠内で使用するために要求される安定性と純度を備えていることを示しています[23、24]。単純なナノ沈殿手順により、いずれかの陽性（SLN ⁺ ）を特徴とするSLNの形成が可能になります ）または負電荷（SLN ⁻ ）（図1）。調査したすべてのSLNが、さまざまなヒト癌に対するソラフェニブの細胞毒性効果を増強したことは注目に値します。これは、SLNが水溶性と抗癌活性の点でソラフェニブの限界を克服できることを示しています。

SLNの定式化のスキーム。陰イオン性ヌクレオチド脂質、チミジン3 '-（1,2-ジパルミトイル- sn -グリセロ-3-リン酸）（diC ₁₆ dT）、カチオン性ヌクレオシド-脂質DOTAU（2 '、3'-ジオレイル-5'-デオキシ-5'-トリメチル-アンモニウム-ウリジン）、およびこの研究で使用されたソラフェニブ（左）。ヌクレオ脂質（diC ₁₆ のいずれか）のナノ沈殿後に得られた平行六面体形状のSLNの概略図 dTまたはDOTAU、SLNにつながる ^- およびSLN ⁺ 、それぞれ）ソラフェニブ（右）。概略図は、DOTAUソラフェニブをロードしたナノ粒子（挿入図、バー500 nm）を示す透過型電子顕微鏡（TEM）画像から採用されています

メソッド

化学薬品および試薬

メタノール（MeOH）、ギ酸（FA）、およびギ酸アンモニウム（AFNH ₄ ）はVWR Chemicals（フランス）から購入し、すべてHPLC（高速液体クロマトグラフィー）グレードでした。 HPLCグレードの水（最小抵抗率18.2MΩ）は、ELGA Milliporeシステム（フランス）によって社内で製造されました。 DOTAU（CAS番号：868226-06-6）およびdiC ₁₆ dT（CAS番号：1160002-70-9）は、参考文献[23,24,25]で報告されているプロトコルに従ってラボで合成されました。ソラフェニブ、4- [4-[[4-クロロ-3-（トリフルオロメチル）フェニル]カルバモイルアミノ]フェノキシ]- N -メチル-ピリジン-2-カルボキサミド（CAS番号：284461-73-0）はSynVec http://synvec.fr（参照番号D114250414）から購入しました。

クロマトグラフィー研究

逆相UHPLC（超高速液体クロマトグラフィー）法がヌクレオ脂質（DOTAUおよびdiC ₁₆ ）用に開発されました。 dT）およびSLNにおけるソラフェニブの定量。 HPLCに注入する前に、ナノ粒子の水溶液をエタノールで5倍と10倍に希釈して、それぞれヌクレオ脂質とソラフェニブを定量しました。

Dionex-Thermo Scientific（USA）のクロマトグラフィーシステムUHPLC UltiMate 3000を使用しました。これは、カラム選択用のクォータナリバルブシステムを備えたポンプ、サーモスタット付きオートサンプラー、およびサーモスタット付きカラムコンパートメントで構成されています。分離は、Syncronis C1850×2.1mm、1.7μmのカラムを使用して行いました。移動相は、70/30 MeOH / 25 mM酢酸アンモニウム（pH =7.4）（A）と26.5 mM酢酸アンモニウムのMeOH（pH =7.9）（B）で構成されていました。 0.2 mL / minの流量を使用し、グラジエントプロファイルは0〜2分、0〜100％Bでした。 2〜20分、100％B。カラム温度は25°Cに設定しました。ソラフェニブとdiC ₁₆ については、267nmで検出を行いました。 DOTAUの場合はdTおよび257nm。注入量は1μLで、ソラフェニブで0.6 ng、ヌクレオ脂質とDOTAUおよびdiCの両方で15ngの定量限界になりました ₁₆ dT。

ソラフェニブ、DOTAU、およびdiC ₁₆ の標準曲線 エタノール中のdTは、追加ファイル1：図SI1、SI2、およびSI3にそれぞれ示されています。

ソラフェニブナノ粒子の調製

10ミリグラムのソラフェニブを1mLのエタノールと10mgのNL（いずれかのdiC ₁₆ ）に溶解しました。 dTまたはDOTAU）を1mLのエタノールに溶解しました。 100マイクロリットルのNL、100μLのソラフェニブ溶液、および800μLのエタノールを室温で混合し、磁気攪拌しながら10mLの蒸留水に滴下しました。溶液を25°Cで90分間超音波浴に入れました。 30°Cで真空下でエタノールを除去し、容量を1mLに調整しました。この溶液は、6 mmの超音波プローブ（Vibracell 75186）を使用して、振幅の100％で10分間、5秒ごとに2秒のパルスで2回超音波処理されました。 1ミリリットルを30mLの蒸留水に対して3×15分間透析しました。この容量は2mLに調整され、特性の定量化と安定性の研究のために保存されます。また、コントロール実験は、ヌクレオ脂質の非存在下で同じプロトコルで実現されました。

透過型電子顕微鏡（TEMおよびEDX）

ナノ粒子は、ネガティブ染色顕微鏡によって視覚化されました。 10マイクロリットルのナノ粒子をカーボンコーティングされた銅グリッドに10分間移しました。次に、サンプルを乾燥させ、2.5％（ w ）で染色しました。 / w ）酢酸ウラニルを水中で2分間。試料は日立H7650電子顕微鏡で観察した。エネルギー分散型X線分光法は、Quantax-X-Flash SVE6と組み合わせたTECNAI透過型電子顕微鏡を使用して実行されました。

粒子サイズとゼータの決定

粒子のゼータとサイズは、Zetasizer NanoZS、Malvernを使用して決定されました。実験は、400μLの水で希釈された40μLのナノ粒子で実現され、測定は25°Cで実行されました。

細胞毒性分析

HuH7およびHepG2は、10％ウシ胎児血清を添加したDMEM-Glutamaxで単層培養しました。 MDA-MB-134およびT-47Dは、10％ウシ胎児血清を添加したRPMIで単層培養しました（T-47Dのみ、非必須AA 1X、グルコース0.45％、インスリン10 mg L ^-1 、およびピルビン酸ナトリウム1X）。すべての培養試薬はInvitrogenからのものでした。 10 ⁴ 90μLの完全培地中の細胞/ウェルを96ウェルプレートにプレーティングし、37°C​​および5％CO ₂ で24時間インキュベートしました。 、培地にSLNまたはソラフェニブのいずれかを10μL加える前。ソラフェニブ（CAS番号：284461-73-0）を0.1％DMSOを含む培地に溶解しました。これらの条件では、沈殿のないソラフェニブの最大濃度は5 µMでしたが、ソラフェニブをロードしたSLNの場合、テストされた最大濃度はDMSOなしで120 µMでした。 4日間のインキュベーション後、ホルマザンベースの増殖アッセイ（CellTiter96®AqueousOneSolution Cell Proliferation Assayキット、Promega）を使用して、20μL/ウェルの試薬溶液を添加することにより、細胞生存率を評価しました。 37°Cで30分間インキュベートした後、5％CO ₂ 、Berthold分光光度計を使用して、各ウェルの吸光度を492nmの波長で測定しました。結果は、\（\ frac {{\ mathrm {OD}} _ {492} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {treatment} \ \ mathrm {cells}-{\ mathrm {OD}} _のパーセンテージとして表されます。 {492} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {blank}} {\ {\ mathrm {OD}} _ {492} \ mathrm {of} \ \ mathrm {untreatment} \ \ mathrm {cells}-{\ mathrm {OD}} _ {492} \ \ mathrm {of} \ \ mathrm {blank}} \）。

細胞生存率の研究

HuH7は、「細胞毒性分析」のセクションで前述したように増殖させました。 SLN ⁺ との4日間のインキュベーション後に、細胞生存率を測定しました。 生/死細胞生存率アッセイ（Invitrogen）を使用して、さまざまな濃度（0、1、5、10、25、50、および100μM）のソラフェニブをロードしました。簡単に説明すると、培地を除去し、付着細胞をハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で1回洗浄しました。 2μMのカルセインアセトキシメチルエステルと4μMのエチジウムホモ二量体-1を含む200マイクロリットルのHBSSを各ウェルに添加し、37°C​​、5％CO ₂ で45分間インキュベートしました。 。染色後、細胞をHBSSで1回洗浄し、倒立蛍光顕微鏡で顕微鏡で画像化した。死んだ細胞の割合は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析によって評価されました。 4μMのエチジウムホモ二量体-1溶液で染色した後、細胞をトリプシンで処理し、1000 rpmで5分間遠心分離することにより、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄しました。 Becton DickinsonからLSRFortessaフローサイトメーターでデータを取得し、DIVAソフトウェアを使用して結果を分析しました。死細胞のサンプルは70％メタノールを使用して調製し、コントロールとして使用しました。

結果と考察

SLNの合成と特性評価

ヌクレオ脂質の非毒性と自己組織化特性により、ソラフェニブなどの疎水性薬物をカプセル化するための理想的な両親媒性アジュバントになります。この研究では、ソラフェニブの低い水溶性特性に対処し、多くの場合その臨床使用を制限するその抗癌活性を高めるために、簡単なナノ沈殿手順が開発されました。水溶性に関しては、ソラフェニブの疎水性、複素環、および水素結合機能が、ヌクレオ脂質との相互作用およびナノオブジェクトの形成に有利であると仮定しました。また、ソラフェニブを搭載したSLNは、ソラフェニブの細胞への取り込みを促進することにより、抗腫瘍活性を高めることが期待されていました。実際、シスプラチンナノ粒子で達成された以前の研究の1つで、シスプラチンの抗腫瘍活性の増強は、癌細胞に内在化される薬物の量の増加によるものであることを示しました[23] [1]。私たちのナノ沈殿プロセスには、次の3つのステップが含まれます。（i）40°Cでのエタノールへのソラフェニブの可溶化（10 mg / mLのソラフェニブ、100μL）および1当量のヌクレオ脂質（陰イオン性ヌクレオチド脂質、diC ₁₆ -3'-dT [チミジン3 '-（1,2-ジパルミトイル- sn -グリセロ-3-リン酸）]またはカチオン性ヌクレオシド-脂質DOTAU [23] [2 '、3'-ジオレイル- 5' -デオキシ-5'-トリメチル-アンモニウム-ウリジン]、エタノール中10 mg / mLの溶液100μL。 （ii）1mLのエタノール溶液を10mLの蒸留水に室温で滴下します。 （iii）得られた懸濁液を蒸発させて過剰のエタノールを除去し、超音波処理した。

クロマトグラフィー研究

新規製剤の薬物負荷能力を評価するために、逆相UHPLC法が開発されました。このHPLCメソッドを使用すると、ソラフェニブとヌクレオ脂質の同時分離が12分で達成され、SLN内の化合物の個別の量子化が可能になりました（追加ファイル1：図SI1–4）。

ソラフェニブ/ DOTAU（SLN ⁺ ）およびソラフェニブ/ diC ₁₆ dT（SLN ⁻ ）、 それぞれ。ヌクレオ脂質の非存在下で実施された対照実験中、おそらく水へのソラフェニブの溶解度が低いために、製剤のさまざまな段階でソラフェニブの約90％が失われました。この結果は、ソラフェニブを可溶化し、SLNを安定化させるためにヌクレオ脂質が必要であることを示しています。

物理化学的研究

動的光散乱（DLS）実験は、SLNの形成を特徴づけるために実行されました。負および正の両方のヌクレオ脂質（diC ₁₆ dTおよびDOTAU）は、単分散性の水溶液中で平行六面体の形状を持つ同様の非球形ナノ粒子を形成します（多分散度指数、PDI =0.202および0.289;サイズ=それぞれ335.2および304.4nm、図2および追加ファイル1：図SI7）。予想通り、SLNベースのオブジェクトのゼータ電位は、核脂質の極性ヘッド（ζ）に依存します。 =+ 59.1および− 54.9 mV（SLN ⁺ の場合） およびSLN ⁻ 、追加ファイル1：図SI10を参照）。 NPにおけるソラフェニブの存在はTEMイメージングによって検証され、SLN-のEDX取得はEDX取得によって実現されました。図2e、fは、IスポットとIIスポットを示しています。図2fのスポットIは、塩素原子の放出を示し（スポットI、図2e、f）、ソラフェニブの存在を示しています（化学構造図2fを参照）。塩素はスポットIにのみ存在し、スポットIIには存在しないことに注意してください（図2f）。

SLNの特性評価。 DOTAUを使用したソラフェニブナノ粒子の形態を示す透過型電子顕微鏡（TEM）画像（ a ）とはめ込み（ b ）。 327 x 172 nmのサイズを特徴とするDOTAUベースのSLNの例（矢印）。これは、DLSで測定した場合の平均サイズ304 nmを確認します（ d ）。 c diC ₁₆ を示すTEM画像の例 dT-SLN（それぞれ330 x 500 nmの矢印）。 （ e ）SLN-のTEM画像。 I＆IIスポットは、EDXの取得が実行されたローカリゼーションです。 （ f ）IおよびII位置でのEDXスペクトル。破線は、Iにのみ存在する塩素原子の放出を強調しています。ソラフェニブ分子の化学構造も示されています。両方のスペクトルは、8 keVでのCu原子発光で正規化されました（TEM Cuグリッドによる）

重要なことに、対照実験では、ヌクレオ脂質の非存在下でのソラフェニブのナノ沈殿はナノオブジェクトを生じさせず、ヌクレオ脂質がSLNの形成と安定化を可能にすることを示しています。

安定性研究

SLN ⁺ のコロイド安定性 およびSLN ⁻ 2つの温度でのDLSおよびゼータ電位によって測定されました（図3aおよび追加ファイル1：図SI10）。 diC ₁₆ の場合 dTベースの製剤、SLNのサイズ ^- 4°Cと37°Cの両方で30日後に変更されなかったことは、これらのナノ粒子の安定性が高いことを示しています（追加ファイル1：図SI9）。このような安定性は、相互作用の性質（H結合、πを含む）によって説明できます。 -π diC ₁₆ 間で発生するスタッキング、電荷/電荷相互作用） dTおよびソラフェニブ。ただし、DOTAUベースの製剤の場合、SLN ⁺ DLS研究で明らかになったように（図3a）、4°Cで30日間のみ安定していましたが、37°C​​ではサイズとPDIの両方の増加が観察されました（図3a）。 SLN ⁺ の場合、37°C​​で観察されたこの相対的な不安定性 ソラフェニブとDOTAUの両方の正電荷間で発生する反発性クーロン相互作用によって説明できます。興味深いことに、コロイド安定性の研究は、安定性を調節することが可能であり、したがって、SLNの安定化に使用されるヌクレオ脂質に応じて、SLNから生理学的環境へのソラフェニブの送達を示す。安定性の変調は、必要な放出の動力学に応じて魅力的である可能性があります。

SLNの安定性研究。 SLN ⁺ のコロイド安定性 （ a ）およびSLN ⁺ におけるソラフェニブとDOTAUの化学的安定性 対4および37°Cでの時間（ b ）。 PDI、多分散度指数

コロイド安定性と並行して、ソラフェニブ、DOTAU、およびdiC ₁₆ の化学的安定性 SLNベースの製剤のdTは、新しいクロマトグラフィー法を使用して、4および37°Cでの時間の関数として調査されました（追加ファイル1：図SI4を参照）。両方の温度での速度論的研究を図3bおよび追加ファイル1：DOTAU-SLNおよびdiC ₁₆ のSI5に示します。 それぞれdT-SLN。結果は、ソラフェニブとdiC ₁₆ 製剤中のdT分子は、少なくとも1か月間安定しており、SLN ^- の場合、両方の温度での長期的な化学的安定性を示しています。 。ただし、SLN ⁺ では、この期間中のDOTAUの減少が観察されました。 製剤。まず、4°Cで、7日間で約12％、30日間で20％の損失が測定されました。温度を上げると、DOTAUの安定性が低下し、37°C​​で7日間で55％低下し、30日間で95％低下しました。ヌクレオ脂質間の化学的安定性のこのような違いは、以前の安定性研究ですでに証明されています（追加ファイル1：図SI6を参照）。

生物学的研究

SLNの細胞毒性は、代謝活性と細胞の形態によって評価されました。 MTTアッセイでは、2つの肝細胞癌（HuH7とHepG2）と2つの管腔内乳癌（MDA-MB-134とT- 47D）。まず、遊離ソラフェニブの最大溶解度に近い濃度で（DMSOの0.1％に5μMのソラフェニブ、ソラフェニブ/ DOTAUの場合は2.8μM、ソラフェニブ/ diCの場合は4μM ₁₆ dTナノ粒子）、両方のSLNは、遊離ソラフェニブよりも細胞生存率を抑制しました。図4bに示すように、MDA-MB-134細胞で実現された細胞生存率研究では、遊離ソラフェニブの活性はその水溶性（[ソラフェニブ] =5μMでの細胞生存率の100％）によって制限されることが示されましたが、IC ₅₀ SLN ⁺ では15および50μMの値が観察されました およびSLN ⁻ 、それぞれ（図4b）。 HuH7で達成されたFACS研究では、IC ₅₀ 約50μMが得られました（追加ファイル1：図SI12およびSI13）。位相差顕微鏡の画像は、SLN ^- のいずれかで処理された細胞層の密度が実際に低下していることを示しています。 およびSLN ⁺ 細胞形態の変化がない未処理またはソラフェニブ処理細胞と比較（追加ファイル1：図SI11）。次に、SLNの濃度が高い場合（[ソラフェニブ] =120、SLNの場合は84μM ^- ）、同様の実験が実現されました。 およびSLN ⁺ 、それぞれ）、溶解限度（5μMの濃度）での遊離ソラフェニブと比較。これらの条件では、図5に示すように、両方のSLNが4つの癌細胞株に対して強い細胞毒性効果を示します。位相差顕微鏡画像で明らかになったように、両方のSLNで細胞破片が観察されました ^- （図5C1–4）およびSLN ⁺ （図5D1–4）細胞死を証明しますが、遊離ソラフェニブの場合は細胞が生きたままです（図5B1–4）。管腔B乳がん細胞の場合、両方のSLNに対して強い細胞毒性効果が観察されたことは注目に値します（図5C1–2およびD1–2）。以前は報告されていなかったこのような抗腫瘍効果は、SLNのおかげでソラフェニブの新しい治療への応用の可能性を開きます。

ソラフェニブまたはSLNの細胞毒性効果。 a ）5μMの遊離ソラフェニブ、2.8μMのNPソラフェニブ/ DOTAU（SLN + ）および4μMのNPソラフェニブ/ diC16dT（SLN-）。 b ）遊離ソラフェニブ（溶解度の制限）、SLN +（灰色）またはSLN-（黒色）の存在下での細胞生存率アッセイ（MDA-MB-134細胞）

コントロール、遊離ソラフェニブ、またはSLN間の細胞形態の比較。 4つのヒト癌細胞株（肝癌、HuH7、HepG2、および管腔乳癌MDA-MB-134、T-47D）のさまざまな条件での細胞毒性を示す位相差顕微鏡画像。 A）ソラフェニブがない場合（対照実験、 A1 – a4 MDA-MB-134、T-47D、HuH7、HepG2、細胞株の場合）。 B）5μMの遊離ソラフェニブの存在下で細胞を4日間インキュベートしました。 CおよびD）SLN ^- の存在下でインキュベートされた細胞 およびSLN ⁺ ソラフェニブの濃度がそれぞれ84および120μMの場合

結論

ソラフェニブの効率的なカプセル化と配信を可能にするヌクレオ脂質に基づく新しいアプローチを報告します。私たちの調査は、ソラフェニブを高負荷にした2種類の固体脂質ナノ粒子（SLN）の形成を示しています。これらのSLNは、負または正のゼータ電位値を示し、平行六面体の形状を特徴としています。 DLSおよびHPLCの研究で明らかになったように、SLNの安定性は、使用するヌクレオ脂質に応じて調整できます。重要なのは、両方のSLN ⁺ およびSLN ⁻ 製剤は、ソラフェニブの水溶性を劇的に高めることができます（120μMを超える濃度）。このようなSLNは、水への溶解性がないために制限されている遊離ソラフェニブと比較して、4つの癌細胞株（肝臓癌および乳癌）に対してより優れた抗腫瘍活性を示します。 4つの癌細胞株で記録された位相差顕微鏡画像は、120μMのSLNとインキュベートすると劇的な細胞死を示します ^- または84μMのSLN ⁺ 。したがって、この薬は、肝臓がん（たとえば、動脈内化学療法でのソラフェニブの使用）または乳がんの場合の新しい治療オプションとして使用できます。私たちの知る限り、このレポートは、SLNアプローチの有用性を実証する管腔B乳がんに対するソラフェニブを使用した研究の最初の例です。全体として、この寄稿で報告された結果は、ドラッグデリバリーシステムとしてのヌクレオシド-脂質ベースのSLNの可能性を浮き彫りにしています。

略語

AFNH ₄ ：

ギ酸アンモニウム

DLS：

動的光散乱

FA：

ギ酸

HCC：

肝細胞がん

HPLC：

高速液体クロマトグラフィー

LN：

脂質ナノ粒子

MeOH：

メタノール

PDI：

多分散度指数

RCC：

腎細胞がん

SLN：

固体脂質ナノ粒子

UHPLC：

超高速液体クロマトグラフィー