酸化グラフェンハイブリダイズしたnHAC / PLGA足場はMC3T3-E1細胞の増殖を促進します

背景

三次元多孔質足場と骨細胞を組み合わせた骨組織工学は、機能不全または失われた組織の治療における魅力的なアプローチとして広く研究されてきました[1]。骨の性質を模倣する生分解性の足場は、細胞を収容し、細胞の接着と増殖を制御し、骨の再生を促進するために重要な役割を果たします[2]。これまで、エレクトロスピニング、計算論的トポロジー設計（CTD）と固体自由形状製造（SFF）の統合、凍結乾燥などのさまざまな方法が、さまざまな3次元（3D）多孔質構造の製造に適用されてきました[3,4,5 、6,7]。エレクトロスピニングは、複雑な構造（整列したバネのような繊維）と組成を持つナノファイバーまたはマイクロファイバーの足場を作ることができます[7]。ただし、生産効率はやや低いです。 CTDとSFFの統合により、多孔質構造と優れた機械的特性を備えた3D解剖学的足場の設計が可能になります。しかし、この方法には強力な専門知識が必要です[4]。これらの2つの方法と比較して、凍結乾燥法では、真空下で凍結液相を昇華させて多孔質構造を製造することにより、はるかに簡単なプロセスで多孔質構造を製造できます[8]。

自然の骨は、コラーゲンとヒドロキシアパタイトの2つの主要な構成要素を持つ複雑な階層構造を持っています[9、10、11]。骨組織工学では、機能不全の治療のために細胞接着と増殖に適応する骨細胞外マトリックスの理想的な生体模倣を作製することは依然として課題です[12]。天然の骨を模倣したナノヒドロキシアパタイト/コラーゲン（nHAC）ベースの生分解性足場は、より優れた生体適合性、細胞親和性、および生体吸収性を提供する可能性があります[13]。しかしながら、不十分な機械的および急速な分解特性を含むコラーゲンの欠点は、骨組織工学におけるその適用の障害のままである[14]。高い機械的強度、優れた生体適合性、生分解性、および有機溶媒への良好な溶解性を備えたポリ（乳酸-コ-グリコール）酸（PLGA）などの生分解性脂肪族ポリマーは、骨組織工学用の3D多孔質足場を構築する理想的な補償材料です[15 、16]。コラーゲンと合成ポリマーを含むハイブリッド多孔質足場は、コラーゲンとポリマーの利点を組み合わせ、骨の修復と再生に広く使用されている弱点を克服します[17、18、19]。たとえば、Liao etal。骨の再生を促進するために、nHACとポリ乳酸（PLA）によって調製された骨足場を開発しました[17]。 Niu etal。骨芽細胞の増殖を促進するために、nHAC /ポリ（L-乳酸）/キトサンミクロスフェア複合足場を作製しました[19]。

最近、1原子厚の新しい炭素シートである酸化グラフェン（GO）[20、21]は、優れた生体適合性を備えているため、生物学分野で大きな関心を集めています。 GOハイブリダイズした足場は、足場の機械的特性と、細胞の拡散や増殖などの細胞の挙動の両方を豊かにすることができます[22、23]。羅らGOをPLGAナノファイバーに組み込むと、間葉系幹細胞（MSC）の増殖と骨形成分化が促進されることが報告されています[20]。 Jing etal。熱可塑性ポリウレタンに1.0wt％のGOを添加すると、スイスのマウス線維芽細胞の細胞増殖が促進される可能性があると報告されています[24]。化学架橋剤（ゲニピン、グルタルアルデヒド、カルボジイミドなど。を追加する場合と比較して、 ）[25、26]、特定の細胞毒性を持ち、複合足場の機械的特性を改善するために、少量のGOハイブリダイズ足場は良好な生体適合性を示します。したがって、GOとnHAC / PLGAのハイブリダイゼーションは、骨組織の新しい人工足場になる可能性があります。

この研究では、多孔質ナノヒドロキシアパタイト/コラーゲン/ポリ（乳酸-co-グリコール酸）/酸化グラフェン（nHAC / PLGA / GO）足場で、GOの重量比が異な​​ります（0.0、0.5、1.0、および1.5 wt ％）製造され、特性評価されています。ハイブリダイゼーション足場は多孔質構造を示しています。 GOを追加すると、ハイブリダイゼーション足場の親水性と機械的特性が変更されます。骨組織工学に対するnHAC / PLGA / GO足場の効果を調査するために、MC3T3-E1細胞を多孔性ハイブリダイゼーション足場で培養しました。結果は、1.5 wt％のGOドープハイブリダイゼーション足場が細胞接着、成長、増殖を促進することを示しており、さらにnHAC / PLGA / GO足場が骨組織工学の有望な候補と見なすことができることを示しています。

結果と考察

nHAC / PLGA / GO複合足場の構造

図1は、nHAC / PLGA / GOスキャフォールドの製造プロセスを示しています。製造工程の詳細は実験のセクションに示されています。 nHACは、nHAC / PLGA / GO複合足場を製造する前に合成されました。 nHAC粉末の走査型電子顕微鏡（SEM）画像は、そのナノ構造を示しています。 nHACの対応するエネルギー分散型X線分光法（EDS）スペクトルも示され（追加ファイル1：図S1）、Ca、Cu、P、C、およびOの存在が明らかになります。銅信号はサンプルをサポートします。したがって、nHACはCa、P、C、Oで構成され、nHAC粉末のCa：Pモル比は1.41であり、ヒドロキシアパタイト（HA）のモル比（1.66）よりも低くなっています。これは、合成されたHAがカルシウム欠乏型[27]であることを示しており、nHACの硬度、弾性率、靭性が低下します。複合足場の機械的特性を高めるために、PLGAとGOをnHAC粉末に添加しました。 GOの量が異なる、製造されたnHAC / PLGA / GOスキャフォールドの光学的概要を図2aに示します。サンプルは直径14mmの円柱です。 GOのない複合足場が白色であることは明らかです。 GOの増加に伴い、複合足場はますます暗くなります。さまざまなnHAC / PLGA / GO足場の詳細な形態は、SEMによって明らかにされます（図2b–e）。これは、すべての足場が多孔質構造を形成し、4つの異なる足場の表面がかなり粗いことを示しています。これらの穴の情報を特徴づけるために、自動表面積および多孔性テスターを使用して評価しました。穴の分布の結果を図2fに示しました。 4つの足場の穴のサイズは0〜200nmです。そして、数十ナノメートルの穴の数は、4つの足場に数百ナノメートルの穴の数よりも多くなっています。生体材料の足場の多孔性は、invitroおよびinvivoでの骨形成にとって重要であることが報告されています[28]。周囲の組織への統合を最適化するために、骨形成のための足場は、骨の形態、構造、および機能を模倣する必要があります[4]。したがって、nHAC / PLGA / GO複合足場の3D多孔質構造は骨の再生に重要です。 4つの複合足場の大規模なSEM画像も示されています（追加ファイル1：図S2）。これは、さまざまな表面の概要構造を示しています。

nHAC / PLGA / GOスキャフォールドの製造プロセスの概略図

a GOの量が異なる合成されたnHAC / PLGA / GOスキャフォールドの光学画像。 b – e b のSEM画像 nHAC / PLGA、 c nHAC / PLGA / GO（0.5 wt％）、 d nHAC / PLGA / GO（1.0 wt％）、および e nHAC / PLGA / GO（1.5 wt％）スキャフォールド。 f nHAC / PLGA / GO（0、0.5、1.0、および1.5 wt％）の穴の分布

nHAC / PLGA / GO複合足場の物理化学的および機械的特性

合成プロセスのメカニズムは、さまざまな単一物質および複合材料のX線回折（XRD）およびフーリエ変換赤外分光法（FT-IR）スペクトルによって明らかにすることができます（図3）。図3aに示すように、他のCa-P材料からのピークがXRDパターンに存在しなかったため、無機相は粉末回折ファイル（PDFカード番号09-0432）に従ってHAとして決定されました。 nHAと比較して、nHACの回折ピークが広いということは、粒子サイズが小さく、結晶化度が低いことを意味します。 nHACと同様に、GOの量が異なるnHAC / PLGA / GOのパターンも結晶化度が低かった。ただし、GOのピークはnHAC / PLGA / GOコンポジットには現れませんでした。これは、バルクと比較してGOの量が少ないことが原因である可能性があります。図3bは、さまざまな単一物質および複合材料のFT-IRスペクトルを示しています。図3bから、3336 cm ^-1 で伸びるN–Hなど、コラーゲンの典型的なバンドを観察できます。 アミドAの場合; 3079 cm ^-1 で伸びるC–H アミドBの場合; 1656 cm ^-1 で伸びるC =O アミドIの場合; 1548 cm ^-1 でのN–H変形 アミドIIと1238cm ^-1 の吸収ピーク アミドIIIの場合。 nHACが形成されると、アミドAは3336 cm ^-1 から移動します。 約3411cm ^-1 、アミドBが弱くなり、アミドI、アミドII、アミドIIIが1656、1548、および1238 cm ^-1 から移動します。 〜1654、1542、および1240 cm ^-1 、 それぞれ。このように、それはコラーゲンとHAの間の化学反応を確認します。さらに、1033、601、および563 cm ^-1 にピークがあります。 （PO4） ^3- の典型的なピークです （PO4） ^3- の特徴的なピークのみを有する商品化されたHAのために、コラーゲン上に新たにHAが形成されることを示すグループ。 1033、603、および565 cm ^-1 。 2996および2944cm ^-1 付近のPLGAの特徴的なピーク -CH ₂ に割り当てられました 、1752 cm ^-1 C =O、1183、1093 cm ^-1 に割り当てられました C–Oに割り当てられ、はっきりと見えます。 PLGAスキャフォールドと比較すると、nHAC / PLGAスキャフォールドのピークは1752および1183cm ^-1 から移動します。 1760および1187cm ^-1 それぞれ、PLGAとnHACパワー間の化学反応を示しています。 nHAC / PLGAスキャフォールドと比較して、GOドープnHAC / PLGAスキャフォールドのピークは1760から1762cm ^-1 に移動しました。; GOとnHAC / PLGAの間の化学反応を示す赤方偏移が発生しました。

a XRDおよび b さまざまな成分のFT-IRスペクトル

異なるGO量のnHAC / PLGA / GO足場のナノ構造と機械的特性は、定量的ナノ機械原子間力顕微鏡（QNM-AFM）[29,30,31,32,33,34]によって特徴づけられました。形態と剛性を自発的に提供し、骨[30]、歯[35]、角膜[36]などのさまざまな材料の機械的特性を検出するために広く使用されています。図4a〜dは、4種類の複合材料の顕微鏡検査を示しています。足場。スキャン領域の制限により、AFM画像は局所的な表面構造のみを示します。したがって、多孔質構造は明らかではありません。ただし、AFM画像もSEM画像と同様の粗い表面形態を示しています。粗さは細胞の増殖と分化に重要な影響を及ぼします。表面が粗い表面は、細胞の増殖と分化に有益でした[37,38,39]。形態（図4a–d）から導き出されたラインプロファイル（図4e–h）は、ラインの方向が異なるだけで最大の高さの違いを示しています。最大の高さの差は〜200〜〜600nmの範囲であることが明確に示されています。対応する剛性分布（図4i）は、4つの異なる足場のヤング率がそれぞれ7.53±1.25、8.34±1.00、9.15±0.85、および10.20±1.28GPaであることを示しています。剛性の違いを明確に示すために、対応する棒グラフも示されています（図4j）。 GO量の差が少ないnHAC / PLGA / GO足場のヤング率に大きな違いはありませんが、たとえば、GO量が0.0および0.5 wt％（7.53±1.25および8.34±1.00）のnHAC / PLGA / GO GPa）、0.5および1.0 wt％（8.34±1.00および9.15±0.85 GPa）、1.0および1.5 wt％（9.15±0.85および10.20±1.28 GPa）、nHAC / PLGA / GO足場のヤング率少し大きいGO量の差（0.0 wt％と1.5 wt％）は大幅に異なります（7.53±1.25と10.20±1.28 GPa）。これは、nHAC / PLGA / GOスキャフォールドの機械的特性がGO量の増加とともに増加することを示しています。

a のAFM画像 nHAC / PLGA、 b nHAC / PLGA / GO（0.5 wt％）、 c nHAC / PLGA / GO（1.0 wt％）、および d nHAC / PLGA / GO（1.5 wt％）スキャフォールド。 e – h 形態画像から得られたラインプロファイル。 i QNM-AFMによって測定された4つの異なる足場の剛性分布。 j ヤング率とGO量の棒グラフ。 k 液滴法で測定された4種類の足場の対応する接触角

足場の親水性は、細胞との相互作用において重要な役割を果たします。 GOを添加すると、複合足場の機械的特性が向上するだけでなく、4種類の足場の疎水性も変化します。図4fは、さまざまなnHAC / PLGA / GOスキャフォールドの接触角を示しています。 nHAC / PLGAスキャフォールドの接触角は〜125.1°でしたが、GO量が異なる（0.5。1.0、および1.5 wt％）nHAC / PLGA / GOの場合、それぞれ〜113.4°、〜103.4°、および〜101.4°です。 GO量の増加に伴い、複合足場の接触角は、ヒドロキシル基とGO表面のカルボン酸基などの負に帯電した基の両方のためにわずかに減少します[40]。したがって、GOは3D nHAC / PLGAスキャフォールドに優れた生物活性を提供できます。

一般に、組織工学用の足場は、生体適合性の形態と特性を示すだけでなく、多孔質構造と物理的強度も必要とします[41]。凍結乾燥した3DnHAC / PLGA / GO足場は、溶媒が昇華するため、多孔質構造を持っています。足場表面のヒドロキシル（OH）、エポキシ（C-O-C）、およびカルボキシル（COOH）種を含む官能基[40]は、良好な親水性を誘導します。 PLGAとGOを追加すると、十分な体力が得られます。したがって、3D nHAC / PLGA / GO足場は、組織工学の有望な候補となる可能性があります。

細胞培養

骨組織に使用される足場は、生体適合性があり、細胞増殖性であり、免疫応答を排除する必要があることはよく知られています[21]。天然骨の成分（コラーゲンとHA）を含み、適切な機械的特性と親水性を備えたnHAC / PLGA / GOは、骨組織工学の理想的な候補となるはずです。これらの足場の細胞増殖を調査するために、MC3T3-E1骨芽細胞をこの研究で培養しました。図5は、細胞計数キット-8（CCK-8）アッセイによって評価された細胞生存率と培養時間の関係を示しています。細胞の増殖は、すべてのグループの培養期間全体を通して一貫して増加しました。より具体的には、nHAC / PLGA / GO（0.5および1.0 wt％）スキャフォールドでのMC3T3-E1の細胞増殖は、1日目に大幅に減少しますが、nHAC / PLGA / GO（1.5 wt％）スキャフォールドでの細胞増殖はnHAC / PLGAスキャフォールド。時間の経過とともに、nHAC / PLGA / GO（1.5 wt％）スキャフォールドでのMC3T3-E1の細胞増殖は、3、5、および7日目に大幅に増加します。ただし、nHAC / PLGA / GOでのMC3T3-E1の細胞増殖は（0.5および1.0 wt％）足場は、nHAC / PLGA足場と比べて大きな違いはありません。

異なる足場表面上のMC3T3-E1細胞の比較;二重アスタリスクは p を示します <0.01、サンプル数 N =4

細胞の成長、さまざまな足場での増殖の証拠もSEMによってキャプチャされました。図6は、それぞれ1、3、5、7日間培養した後の、4つの異なる足場上の骨芽細胞の表面形態を示しています。 1日目では、すべての細胞が均等に分離され、4つの異なる足場に分散しています。時間の経過とともに（3、5、および7日目）、細胞のすべてのグループが成長、増殖し、さまざまな足場に統合され始め、細胞の大きな層を形成します。異なる足場の細胞形態と比較して、nHAC / PLGA / GO足場の表面の細胞は、nHAC / PLGA足場の表面の細胞よりもはるかに大きく、伸びていました。 SEM画像によると、異なる量（0.5、1.0、および1.5 wt％）のnHAC / PLGA / GOでの細胞の拡散、細胞間の接着の状況に有意差はありません。

a – p 4つの異なる足場で1、3、5、および7日間培養されたMC3T3-E1細胞のSEM画像。スケールバーはすべての画像で50μmです。白いアスタリスクはMC3T3-E1骨芽細胞を表しています

細胞毒性試験

GOの細胞毒性は、生物学分野での応用にとって重要な関心事です。そこで、24時間で4つの足場の細胞毒性を評価します。結果を図7に示しました。nHAC/ PLGAの線維芽細胞（NIH-3T3）の細胞活力には0.5,1が含まれ、1.5％のGOは99,101.11であり、97.86％はnHAC / PLGAに関連しています。 nHAC / PLGAよりも、酸化グラフェンの増加が0〜1.5％で安全であることを示しています。

nHAC / PLGA（0.5、1、1.5 wt％）でのHIH-373細胞の相対的な活性は、nHAC / PLGAに関連しています

表1は、4種類の複合足場の機械的特性と細胞培養特性をまとめたものです。 GOが増加すると、それに応じて足場のヤング率が増加します。ただし、nHAC / PLGAとnHAC / PLGA / GO（1.5 wt％）の機械的特性のみが明確に異なります。 4種類の足場の細胞生存率は、機械的特性と同じ傾向を示します。つまり、すべてのグループのOD値は、細胞培養時間の増加とともに増加しますが、nHAC / PLGAとnHAC / PLGA / GO（1.5 wt ％）グループは有意差を示します。これは、足場の機械的特性が細胞培養特性と密接に関連していることを示しています。その結果は、組織細胞がそれらの基質の硬さを感じて反応することができるためである可能性があります[42、43、44、45]。基質の機械的特性を調整することで、細胞の成長と生存率とともに細胞表面の相互作用に影響を与える細胞応答を促進することができます[46、47、48、49]。 Haugh etal。足場の剛性がMC3T3-E1細胞の活性（細胞増殖と遊走）を増強することを発見しました[50]。 Engler etal。多くの細胞型の応答における重要な物理的要因は基質の剛性であることが実証されました[51]。彼らは、平滑筋細胞が他の足場依存性細胞と同様にラット大動脈（A7R5系統）に由来し、「柔らかい」基質よりも「硬い」基質でより多く広がり、細胞骨格と接着斑を組織化することを発見しました。機械的特性は、細胞の挙動だけでなく、組織の活動にも影響を及ぼします。 Duncan etal。メカノトランスダクションと骨の機能的反応の機械的ひずみを研究しました。彼らは、機械的負荷が骨吸収を阻害し、invivoで骨形成を増加させる可能性があることを発見しました[52]。したがって、最も硬いnHAC / PLGA / GO（1.5 wt％）足場は、MC3T3-E1細胞の増殖を促進する可能性があります。

GOの細胞毒性は、生物学分野での応用にとって不可欠な関心事です。これまで、2つの議論が生じてきました。 GOは細胞毒性を誘発し、その効果は濃度に依存すると主張する人もいます。たとえば、Chatterjee、etal。 GOの用量依存性が異なる毒性反応を報告した[53]。ピント他細胞の接着と増殖を促進するために、低濃度のGOのみがPLAに安全に組み込まれる可能性があると報告されています[6]。他の人は、さらに大量のGOが良好な生体適合性を持ち、基質の機械的特性と細胞の挙動の両方を強化すると述べています。シン他研究されたC2C12骨格筋芽細胞は、PLGA、PLGA-コラーゲンマトリックスよりもPLGA-GO-コラーゲンハイブリッドマトリックスで増強されました[54]。そしてLuo、etal。 GOをドープしたPLGAナノファイバー足場はMSCの骨形成分化を促進できると報告されています[22]。この研究では、GOは最初の議論に基づいて選択されました。非細胞毒性と強化された機械的特性のために、限られた量が複合足場に追加されます。 GOのnHAC / PLGA足場への結合は、細胞の成長、増殖を大幅に強化しました。 nHAC / PLGAと少量のGOを含むnHAC / PLGAの両方のセル数（たとえば、nHAC / PLGA / GO（0.5 wt％））はほぼ同じですが、nHAC / PLGA / GOのセル数はほぼ同じです。 （1.5 wt％）足場は、nHAC / PLGA足場よりも高かった。これらの結果は、nHAC / PLGA / GO足場が、MC3T3-E1細胞の成長と増殖を促進する能力を備えた生体機能性であることを示しています。したがって、優れた生体適合性と生体機能性により、nHAC / PLGA / GOを骨再生の効果的な足場として使用することができます。

生体材料の性質と製造プロセスは、足場の特性にとって非常に重要です[28]。これまで、金属[55]、セラミック[56]、ガラス[57]、化学合成ポリマー[58]、天然ポリマー[59]、およびこれらの材料を組み合わせて複合材料を形成する[60]などの生体材料が広く研究されてきました。 。複合足場のコンポーネントを変更すると、足場のプロパティが誘導されます。たとえば、天然骨の生体模倣足場を製造するために、この研究ではI型コラーゲンが使用されています。現在、コラーゲンファミリーには、皮膚、骨、軟骨などに存在する20種類以上のコラーゲンが含まれています。I型コラーゲンを他のタイプに置き換えることで、さまざまな目的のためにさまざまな複合足場を製造することができます。たとえば、II型コラーゲンはフィブリル形成コラーゲンの1つであり、軟骨の主要なタイプのコラーゲンです。 II型コラーゲンを足場に調整することで、軟骨の骨の再生を促進できる可能性があります[61]。さらに、適切なアニーリングを施したコラーゲンは、足場をさらに強化する可能性があり、機能的な構造を持つ新しい複合材料を誘発する可能性があります。生体材料の性質に加えて、処理は、さまざまな処理方法など、足場の機能も決定します。材料の化学的性質と処理により、最大の機能特性と、細胞が足場とどのように相互作用するかが決まります。骨組織工学における特性と要件の足場は、分解[62]、機械的特性[63]、サイトカイン送達[64]、および足場と細胞の組み合わせ[65]を含む広範囲に調査されています。

結論

要約すると、GOの量が異なる（0.0、0.5、1.0、および1.5 wt％）nHAC / PLGA / GO足場は、凍結乾燥法によって製造されました。製造されたnHAC / PLGA / GO足場は多孔質構造を示しています。さらに、PLGAとGOを添加することにより、足場の機械的特性と親水性が向上します。インビトロ研究は、多孔質足場が細胞の吸着、成長、および増殖を促進することを示しています。これらのnHAC / PLGA / GO足場は、骨組織アプリケーションの有望な候補となる可能性があります。

メソッド

資料

精製された凍結乾燥1型コラーゲンは、Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co.、Ltdから入手しました。ラクチド：グリコリド比が75：25、Mwが95,000 g / molのPLGAは、Shandong Medical Appliance Factory（中国）から購入しました。 GOはShanghaiAladdin生化学PolytronTechnologies Incから購入しました。MC3T3-E1骨芽細胞は、Shanghai Chinese Academy ofSciencesのセルバンクから提供されました。ウシ胎児血清（FBS）、抗生物質-抗真菌剤、CCK-8、およびダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）は、Tianjin Nobuo Letter Technology Co.、Ltd。からアクセスしました。1,4-ジオキサン、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、0.1 M、 PH 7.4）、および他のすべての化学物質は分析グレードであり、さらに精製することなく受け取ったままの状態で使用されました。

nHACPowerおよびnHAC / PLGA / GO複合足場の準備

nHAC粉末の合成方法は以前に報告されています[66,67,68]。簡単に説明すると、コラーゲンを酢酸（0.5 mol / L）に溶解して、4 g / Lの濃度の溶液を形成しました。 CaCl ₂ およびH ₃ PO ₄ （Ca / P =1.66）次に、溶液を個別に滴下しました。滴下速度は毎分100滴です。溶液を穏やかに攪拌し、37°C​​でアンモニア溶液を用いてpH 9まで滴定しました。24時間後、遠心分離と凍結乾燥によってnHAC沈着物を回収しました。 nHAC / PLGA / GO複合材の足場を作成するために、GOを超音波セルクラッシャーを使用してジオキサンに均一に分散させ、最終濃度をそれぞれ0.0、0.5、1.0、1.5 g / Lにしました。次に、PLGAをGO溶液に添加し、最終濃度を10％（m / v）にしました。次に、GO / PLGA溶液を室温で12時間穏やかに攪拌しました。最終的なソリューションは、1：1のnHAC：PLGA重量比でGO / PLGAソリューションにnHACパワーを追加することによって形成されました。次に、形成されたnHAC / PLGA / GO溶液を攪拌し、4時間超音波処理しました。 − 20°Cで一晩凍結した後、凍結乾燥してジオキサンを除去することにより、nHAC / PLGA / GO複合足場が得られました。

特性

複合足場は金でコーティングされ、SEM（JSM-7100F）で観察されました。電子顕微鏡サンプルの準備のために、金を20秒間スプレーします。マトリックスのトポグラフィーと機械的特性は、空気中の原子間力顕微鏡（AFM、マルチモードVIII、ブルカー、ドイツ）によって特徴づけられました。画像解析は、GwyddionおよびNanoscope AnalysisSoftwareを使用して実行されました。 nHAC / PLGA / GO複合足場の組成分析は、FT-IR分光光度計（VECTOR22、ブルカー、ドイツ）によって実行されました。すべてのスペクトルは、1000〜2200 cm ^-1 の波長範囲で吸収モードで記録されました。 解像度4.0cm ^-1 と16回のスキャン。サンプルの接触角は、液滴法（EasyDrop、モデルDAS30、kruss、ドイツ）による接触角測定システムを使用して測定されました。 XRDパターンは、X線回折計（D8 DISCOVER）を使用して測定しました。 Cu-Kα放射線（λ=0.154 nm）は40kVおよび30mAです。測定のスキャンレートは8°min ^-1 RTで5〜80°の2θ範囲にわたって。足場の気孔率は、自動表面積および気孔率アナライザー（ASAP 2460、Micromeritics、GA、USA）によって測定されました。

細胞培養

MC3T3-E1骨芽細胞を、10％FBSおよび3％抗生物質-抗真菌溶液を添加したDMEMで、37°C​​および5％CO ₂ で培養しました。 セルインキュベーターで。最初の付着と増殖は、製造元の指示に従ってCCK-8を使用してテストされました。この場合、生細胞の数は、CCK-8アッセイで得られた代謝反応生成物に正比例していました[69]。簡単に説明すると、MC3T3-E1骨芽細胞を2.5×10 ⁴ の密度で播種しました。 48ウェル細胞培養に埋め込まれたnHAC / PLGA、nHAC / PLGA / GO（0.5 wt％）、nHAC / PLGA / GO（1.0 wt％）、およびnHAC / PLGA / GO（1.5 wt％）マトリックス上のウェルあたりの細胞数皿。培養期間の最後の2時間（1、3、5、および7日）に細胞をCCK-8溶液とともにインキュベートし、暗所で37℃で増殖させました。 ELISAリーダー（DNM-9602）を使用して、450nmの波長で吸光度を測定しました。

SEM測定用の細胞サンプルをホルムアルデヒドで固定した後、各濃度で15分間、段階的な一連のエタノール（30、50、75、95、および100％）で標本を脱水しました。次に、サンプルを臨界点で乾燥させ、二酸化炭素分析器（日立、HCP-2）で乾燥させた。最後に、金でコーティングされたサンプルがSEMによって観察されました。

細胞毒性試験

線維芽細胞の濃度を1×10 ⁴ に調整しました。 / mlで、ウェルあたり200ulで96ウェルプレートに接種しました。次に、ウェルプレートを5％CO ₂ 中で37℃でインキュベートしました。 24時間インキュベーター。サンプル（nHAC / PLGA、nHAC / PLGA / GO（0.5 wt％）、nHAC / PLGA / GO（1.0 wt％）、nHAC / PLGA / GO（1.5 wt％））を粉末化して、100 mg / mlの懸濁液を作成しました。 。 100 ulの懸濁液を含む実験グループと、等量のDMEM完全培地を含むコントロールグループを24時間インキュベートし、CCK-8をインキュベーターに加えた後、さらに4時間インキュベートしました。細胞生存率は、ELISAリーダーを使用して450nmの波長での吸光度を測定することによって得られました。細胞生存率は、次の式を使用して計算されました。

ここで、A（実験）は、細胞、CCK-8溶液、およびパワーサンプル溶液を含むウェルの吸光度を表します。 A（空白）は細胞を含む培地とCCK-8溶液を含むウェルの吸光度を表し、A（コントロール）は細胞を含むウェル、パワーサンプル溶液を含まないCCK-8溶液の吸光度を表します。

統計分析

定量的結果は、少なくとも3つのサンプルの平均値±標準偏差（SD）として表されました。学生の t テストは統計分析に使用されました。 p の値 <0.05は統計的に有意であると見なされました。 p を示すために、データには**のマークが付いています <<0.01。

略語

3D：

三次元

AFM：

原子間力顕微鏡

CCK-8：

細胞計数キット-8

CTD：

計算論的トポロジーの設計

DMEM：

ダルベッコの改良イーグルメディア

EDS：

X線分光法

FBS：

ウシ胎児血清

FT-IR：

フーリエ変換赤外分光法

GO：

酸化グラフェン

HA：

ヒドロキシアパタイト

MC3T3-E1：

骨芽細胞

MSC：

間葉系幹細胞

nHAC：

ナノヒドロキシアパタイト/コラーゲン

NIH-3T3：

線維芽細胞

PBS：

リン酸緩衝生理食塩水

PLA：

ポリ乳酸

PLGA：

ポリ（乳酸-co-グリコール酸）

QNM-AFM：

定量的ナノメカニカル原子間力顕微鏡

SD：

標準偏差

SEM：

走査型電子顕微鏡

SFF：

オリドフリーフォームファブリケーション

XRD：

X線回折