グラフェン酸化物統合nHAC/PLGAスキャフォールドによる骨芽細胞増殖と骨再生の促進

概要

生分解性多孔質スキャフォールドは骨組織工学の中心である。本研究では、ナノヒドロキシアパタイト/コラーゲン（nHAC）をポリ(乳酸-共-グリコール酸)（PLGA）とブレンドし、様々な量のグラフェン酸化物（GO）を加えて凍結乾燥法で複合材を作製した。得られた複合材は連続的な三次元細孔ネットワークを示した。GOは親水性をわずかに向上させ、ヤング率を有意に増加させ、1.5 wt% GO試料はGOフリースキャフォールドの7.53 ± 1.25 GPaに対し10.20 ± 1.28 GPaに達した。インビトロでは、MC3T3-E1骨芽細胞が1.5 wt% GOスキャフォールド上で顕著に高い接着性と増殖を示し、CCK-8アッセイとSEM像で確認された。これらの知見は、nHAC/PLGA/GOスキャフォールドが優れた細胞適合性と優れた機械的性能を兼ね備え、骨再生応用への有望な候補であることを示している。

背景

骨細胞外マトリックスを模倣した三次元多孔質スキャフォールドは、成功する骨修復に不可欠。従来の製造技術（電気紡糸、計算トポロジー設計（CTD）と固体自由成形（SFF）の組み合わせ、凍結乾燥）は、構造制御と拡張性の度合いが異なる。特に凍結乾燥は、凍結溶媒を真空下で昇華させることで高度に相互接続した細孔を生成する簡便な経路を提供する。

天然骨はコラーゲンとヒドロキシアパタイト（HA）の階層的な集合体で構成される。ナノヒドロキシアパタイト/コラーゲン（nHAC）複合材はこの自然な構造を模倣し、優れた生体適合性と生体吸収性を提供する。しかし、コラーゲンの固有の脆さと急速な分解が利用を制限する。ポリ(乳酸-共-グリコール酸)（PLGA）は機械的強靭性と調整可能な分解速度を導入し、GOは高比表面積、機械的補強、細胞挙動を調節できる官能基といった独自の物理化学的特性を提供する。

先行研究ではGO強化スキャフォールドが骨芽細胞分化と細胞増殖を改善することが示されている。ここでは、増分的GO負荷（0.0、0.5、1.0、1.5 wt%）がnHAC/PLGA複合材の構造的、機械的、親水性、生物学的性能にどう影響するかを体系的に評価した。

結果と考察

nHAC/PLGA/GO複合スキャフォールドの構造

製造プロセスは、I型コラーゲンを酢酸に溶解し、CaとPイオンを共沈殿させてnHACを形成、PLGAと分散GOを混合、凍結乾燥する工程を含む。走査型電子顕微鏡（SEM）により、0-200 nm範囲の相互接続した細孔を持つ高多孔質構造が明らかになった。細孔分布は自動表面積分析装置で定量化（図2f）、100 nm未満の細孔が優勢であり、これは骨芽細胞浸潤に適したサイズ範囲である。

凍結乾燥によるスキャフォールド製造の模式図。

物理化学的および機械的特性評価

粉末X線回折（XRD）で六方晶HAの存在を確認。GO信号は低負荷のため検出されず。FT-IRスペクトルはコラーゲン特有のアミドバンドとリン酸ピークを示し、コラーゲン、HA、PLGA、GO間の化学的相互作用を示唆する微妙なシフトが観察された。

定量的ナノメカニカルAFM測定（QNM-AFM）により、GO含有量に伴いヤング率が単調に増加：7.53 ± 1.25 GPa（0 wt%）、8.34 ± 1.00 GPa（0.5 wt%）、9.15 ± 0.85 GPa（1.0 wt%）、10.20 ± 1.28 GPa（1.5 wt%）。1.5 wt% GOスキャフォールドはGOフリー対照と比較して統計的に有意な剛性向上を示し、GOの補強効果を反映。

接触角測定では、GOフリーの125.1°から1.5 wt%で101.4°へ徐々に減少し、GOの親水性官能基による表面濡れ性の改善を示す（図4f）。

4種のスキャフォールドバリエーションのAFM像（a-d）と剛性マップ（i）；着滴法で測定した接触角（k）。

細胞培養と細胞毒性

スキャフォールドに播種したMC3T3-E1骨芽細胞は7日間で代謝活性が増加（CCK-8アッセイ）。0.5 wt%と1.0 wt% GOスキャフォールドでの初期増殖はGOフリー対照よりわずかに低かったが、1.5 wt% GOスキャフォールドは3日、5日、7日目で対照に匹敵し上回った（図5）。SEM像は広範な細胞伸展とネットワーク形成を確認し、GO含有スキャフォールド上の細胞はより大きく扁平な形態を示した（図6）。

スキャフォールド懸濁液に24時間曝露したNIH-3T3線維芽細胞では有意な細胞毒性はなく、すべてのGO負荷で生存率97%以上を維持し、複合材の生体適合性を確認（図7）。

4種のスキャフォールドバリエーション上でのMC3T3-E1細胞生存率（*** p < 0.01）。

4種のスキャフォールドタイプ上での1、3、5、7日目のMC3T3-E1細胞SEM像。

スキャフォールド懸濁液に24時間曝露後のNIH-3T3細胞相対生存率。

結論

凍結乾燥により、相互接続した多孔性、機械的剛性の向上、親水性の改善を備えたnHAC/PLGA/GOスキャフォールドの作製が可能となった。1.5 wt% GOスキャフォールドは優れた骨芽細胞接着と増殖を示しながら優れた細胞適合性を維持し、骨組織工学スキャフォールドとしての可能性を強調している。

方法

材料

I型コラーゲン、PLGA（75:25、Mw = 95 kDa）、GO、細胞培養試薬は定評あるサプライヤーから調達。MC3T3-E1骨芽細胞とNIH-3T3線維芽細胞は信頼できるセルバンクから入手。

スキャフォールド調製

コラーゲンを0.5 M酢酸（4 g L⁻¹）に溶解。カルシウムとリン酸溶液（Ca/P = 1.66）を100滴/分で滴下添加し、攪拌、37 °CでアンモニアでpH 9に調整。24時間後、沈殿物を回収、凍結乾燥、粉砕してnHAC粉末を得た。

GOをジオキサン（0.0、0.5、1.0、1.5 g L⁻¹）に分散させ超音波処理、PLGA（10% m/v）と混合し12時間攪拌。nHACをPLGAに対して1:1重量比で添加、さらに4時間超音波処理。混合物を-20 °Cで一晩凍結し、凍結乾燥して最終スキャフォールドを得た。

特性評価

SEM、AFM（QNMモード）、FT-IR、XRD、接触角、多孔度測定を標準プロトコルで実施。すべてのデータは三重測定で取得。

細胞培養とアッセイ

MC3T3-E1細胞をスキャフォールドディスク上に2.5 × 10⁴ cells mL⁻¹で播種、DMEM +10% FBS +3% 抗生物質、37 °C、5% CO₂で培養。増殖をCCK-8で1、3、5、7日目に評価。SEM用に4%パラホルムアルデヒドで固定、脱水、臨界点乾燥、金スパッタコート。

細胞毒性試験

NIH-3T3細胞を100 mg mL⁻¹スキャフォールド懸濁液に24時間曝露、CCK-8アッセイ実施。細胞生存率を対照培養に対して相対的に算出。

統計解析

データを平均±SDで表現。Student's t検定を適用、p < 0.05を有意とした。